1。料理の準備<ol><li>スライス培養に使用される料理は（WillCo料理）（ベースとしてカバースリップ付き）ガラス底です。これらはガラスの底をきれいに保つために6 cmの組織培養皿にレンズの組織に配置されています。 </li><li>実験前日に、ポリ-L-リジンコートのガラス底をに可能にするために室温で5分間ガラスボトムディッシュとインキュベートし、2 mlの0.1％のポリ-L-リジン溶液を追加します。 </li><li>ポリ-L-リジン溶液を除去し、脱イオン水で、その後一度70％エタノールで3回すすいでください。 </li><li>一晩乾燥させたままにします。料理も穏やかに30〜45秒のために低消費電力で電子レンジで加熱することによって乾燥させることができる。 </li></ol> 2。胚のエレクトロポレーション<ol><li> °Cハンバーガー·ハミルトン（HH）ステージ10（〜36時間）（または他の所望の段階）に37℃で卵をインキュベートします。 </li><li>ガラス針を（我々は燃える/ブラウンモデルP87マイクロキャピラリープラーを使用します）準備しneedlの先端を切り離し始める前に解剖顕微鏡下で微細な鉗子を使用して電子。それはDNA溶液の注入を妨げるように狭くされていないが針の終わりには胚を貫くのに十分なシャープでなければなりません。 </li><li>胚のいずれかの側の窓の卵と場所電極（5mm離れ） </li><li>神経管に - DNA（ファストグリーンの少量で着色された脱イオン水で0.5μg/μLの〜0.025）を注入します。 </li><li>現在適用されます - パルス間の950ミリ秒と12月17日V三回、50msのパルスの長さ。 </li><li>我々は個々のセルに従うことができるようにモザイクの発現を達成するためにDNAの低濃度、低エレクトロポレーション電圧を使用しています。 </li><li>セロテープで卵殻の窓をカバーし、それが密閉されていることを確認します。 </li><li>胚は37℃で3-4時間または一晩で回復することができ℃の</li></ol> 3。コラーゲンとスライス培養培地の調製<ol><li>スライスする前に、時間に関するコラーゲンミックスとスライス培養培地を準備します。 </li><li> 300μlのtにYPE 1コラーゲンは、100μlの0.1％酢酸溶液と100μlの5×L15培地を追加します。徹底的に各添加後ボルテックス。溶液は黄色に変わります。 </li><li>今15から20μlの7.5％炭酸水素ナトリウムと徹底的に渦を追加します。解決策は、少しピンクになるべきであり、このために必要な重炭酸ナトリウムの量が異なる場合があります。氷上に置き、毎回新鮮な構成しています。 </li><li> 10ミリリットルneurobasal培地に1×の最終濃度と10μlのゲンタマイシン液にB-27サプリメントとグルタミンを追加します。 </li><li> 37℃インキュベーター内で場所媒体は、5％CO 2で緩衝。それはCO 2と平衡できるようにするためにコンテナの上部が緩いままにしておきます。 </li></ol> 4。スライス培養<ol><li>卵から胚を取り出して、L15培地で洗ってください。 </li><li>下部にsylgardの層での組織培養皿で行われ、それらがピンと張ったストレッチされるように、周囲の余分な胚膜を介してそれらをピン。 </li><li>マイクを使用して、roknife、関心領域を介して、できるだけまっすぐにスライス胚。脊髄では、スライスの厚さは1から2体節の間でなければなりません。あなたがそれらを失うことはありませんので、他の胚をスライスしながら胚に接続されているスライスのままにしておきます。 </li><li> 〜先端の1ミリメートルを切断し、P2またはP10にこれを取り付けることにより、200μlのマイクロピペットチップを準備します。このチップは、ガラスボトムディッシュに脊髄スライスを転送するために使用されます。 10μlの先端は、スライスをピックアップするのに十分広いではありません。 </li><li>コー​​ト前に準備1μlのコラーゲンミックスをピペッティングによるコラーゲンの先端の内側。 L15培地でリンスし、1から2分放置します。これは、先端の内側に付着したから組織を防ぐことができます。 </li><li> microknifeを使用して、胚からスライスをデタッチし、200μlの先端を装備し、1μlにセットP2またはP10を使用して、皿から削除します。できるだけ媒体として取るようにしてください。 </li><li>渦コラーゲンミックスとポリ-L-リジンコートしたディッシュにこのの5-8μlをドロップします。 </li><li> Immediately細かい鉗子のペアを使用して所定の位置にコラーゲンや位置に胚のスライスを入れた。スライスが撮像される側はカバースリップの端が揃うように配置する必要があります。組織は、カバースリップ上にポリ-L-リジンコーティングに付着する必要があります。 </li><li>あなたがカバースリップ上で複数のスライスを持ってまで、この手順を繰り返します。我々は、通常1皿に6から9のスライスを配置することができます。 </li><li>すべてのスライスを配置したら、皿をカバーし、コラーゲンが20分に設定することができます。最古の置かれたコラーゲンのいくつかはすでに乾き始めている場合があります。防ぐために、これがカバーする前に、これらにL15の少量を追加します。 </li><li>一度、設定を慎重に少なくとも1時間は37℃、5％CO 2で平衡化された2ミリリットルスライス培養培地を追加します。注意はカバースリップからコラーゲンを取り除くないように注意する必要があります。 </li><li> 37℃/ 5％CO 2インキュベーター内での場所とスライスがイメージを作成する前に少なくとも3時間で回復することができます。パースペックスボックスのウィットには湿度がない場合は、場所の皿1コーナーで湿らせたティッシュペーパーのHAビット。 </li></ol> 5。イメージング胚スライス<ol><li>我々は、画像スライスにWeatherStationの環境室を装備しDeltaVisionコア広視野顕微鏡を使用しています。室は常に5％CO 2/95％空気で顕微鏡ステージを維持するためにCO 2灌流装置を用いて37℃に維持されています。 </li><li>イメージングは​​、通常、40×/ 1.30 NA油浸レンズと画像を用いて行われるCCDカメラを冷却CoolSnap HQ2で撮影されています。 </li><li> Z-セクションは、45μmの組織を介して、1.5μmのキャプチャされます。露光時間は可能な限り低く抑える必要があります。我々は通常、各Z-セクションの5から50ミリ秒間公開しています。画像は7分間隔で取得され、最大9つのスライスは、関数を訪れDeltaVisionシステムの正確なポイントを使用して訪問することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果脊髄前駆細胞の例は時間経過のシーケンスは、図に示す。 2aと対応するムービー1。イメージングは​​2日齢（HHステージ12）胚から脊髄スライスに開始されました。このセルは、GFP-αTubulinを表現する構築物でトランスフェクトした。この初期の段階では、神経前駆細胞は主として細胞が2さらに循環前駆細胞を生成するために分割し、その間前駆-前駆モードの部門を受けています。 図。 2bと対応するムービー2は、細胞膜をマーク、GFP-GPI（GPIは、GFPを固定）でトランスフェクトした細胞を示しています。この細胞は、基底のプロセスが二つに分割し、均等に娘細胞に継承されている間分裂を受ける。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> 図1。タイムラプスイメージングのためのスライス培養プロトコル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> 図2。セルB正常な脊髄の開発中にehavior。 ムービー1から（1）選択したフレーム。 GFP-チューブリンを発現する細胞は、再び（24時間23分と25時間54分）に分割二つの娘細胞を生成し、先端面（2時間20分）に垂直な切断面で分割されます。 （b）の動画2から選択したフレーム。 GFP-GPIをトランスフェクト細胞は、基底のプロセスを分割し（白矢印）と同様に娘細胞に継承され、その間に細胞分裂を受ける。 映画は1。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。 ムービー2 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Deconvolution+Microscopy.">3D Deconvolution Microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここではニワトリ胚スライス培養における細胞の挙動を監視するための新たなタイムラプスイメージングアッセイを提示します。 24-48時間の間の時間フレームをキャプチャすることが容易であるが、このアッセイでは、最大70時間の生体組織の高分解能イメージングを可能にします。高NA油浸対物と時間点の間の比較的短い間隔での使用は同様に私たちはしばしば急速に発生する細胞の挙動を監視することができますように、高解像度での画像取得を可能にし、容易に焦点を用いた従来のタイムラプスイメージング中に見逃されることができ顕微鏡。 このアッセイの主な利点は、長期間にわたって画像セルの能力である。 7顕微鏡を共焦点レーザーの代わりにワイドフィールド6の使用はこのために重要です。共焦点顕微鏡は、従来の光学切片をとり、直接フォーカス情報のうち、排除する能力を含む、広い視野顕微鏡に比べていくつかの利点を提供してきました<sup&gt; 7しかし、ピンホールの使用は、大量の情報を除いて、長い露光時間を必要と、検出器8への光の損失につながる。広視野顕微鏡は、他の一方で、完全な視野照明を使用して、目的を介してすべての通過する光は、検出器に送られます。高い量子効率を持つこの結合は、結合素子（CCD）カメラ、非常に高速な露光時間と共焦点顕微鏡9に比べて対ノイズ比の高い信号を画像処理を確実に冷却した。このアプリケーションでは、我々は長い期間、記録の3Dスタック、最終的に小型に近い回折制限された構造を解決するためのイメージする必要があります。共焦点顕微鏡は、これまでに検出器に到達するからアウトフォーカスの光を防ぎ、大幅に厚い、高密度で標識した試料7、8のバックグラウンドを減少させるが、それだけでよりもはるかに大きな光入力で使用可能な信号対雑音比を実現ワイドフィールド顕微鏡10。非常に光に敏感なsparselのために私たちのエレクトロ脊髄のスライスのようにy軸ラベルのサンプルは、したがって、広い視野顕微鏡は、共焦点顕微鏡よりもパフォーマンスが向上します。フォーカス情報と向上し、コントラストの外に除去しデコンボリューションによって、イメージの復元と組み合わせると、広いフィールドが、小さな、薄暗いオブジェクト11の検出に特に適しています。あらゆる組織のイメージング実験には適していませんが、このアプローチは、私たちの生細胞イメージングアプリケーションのための非常に有効であった。 蛍光タンパク質の選択は、細胞の生存に影響を与えることができる重要な要因である。我々は最良の結果がマーカーとして緑色蛍光タンパク質（GFP）12を使用して構造体から得られることがわかります。我々は現在、事実上のデュアルチャネルの時間経過のためにGFPと組み合わせて使用​​することができる赤色蛍光タンパク質の範囲を評価しています。 13利用できるようなタンパク質の様々なものがあります。多くのタンパク質は、蛍光タンパク質との融合体として安定しているが、、いくつかのタンパク質が減少し、細胞生存率の結果、融合によって不安定にレンダリングすることができます。このような場合には、内部リボソーム侵入部位（IRES）を含む構造体の使用は、蛍光タンパク質から目的のタンパク質を分離するのに便利です。 イメージング脊髄スライスする場合は、注意が蛍光灯への暴露を最小限に抑えるように注意する必要があります。顕微鏡の接眼レンズは、スライスを見つけて位置する透過光（明視野）でのみ使用する必要があります。蛍光画像は、常に最小の露光時間を使って顕微鏡ソフトウェアを使用して取得する必要があります。これらは5から50 msの範囲に保たれるべきであり、中立的な密度のフィルタの使用で実験する必要があります。長い露光時間が最初にクリアな画像を生成するかもしれませんが、蛍光灯暴露の光毒性効果は、細胞死につながる可能性があります。この地域は中に損傷されている可能性があり、組織が含まれているカバースリップに最も近い組織の最初の5〜10μmの撮像すべきではありませんスライス。 ここで示す例は、HHステージ10以降撮像された6-7時間でエレクトロ胚のですが、このメソッドは、ステージ18をHHに胚用に使用することができます。後の段階で、脊髄組織がはるかに大きいので、手でスライスすることは困難である。これらのケースでは、低融点アガロースで胚を埋め込み、ビブラトームで切片と良い結果をもたらす可能性があります。我々が開発して脊髄のイメージング細胞の方法として、このアッセイを提示するにもかかわらず、このアプローチはまた、感覚placodes 3を含むイメージを他の胚組織に変更されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> WillCoディッシュ</td><td> WillCoウェルズ</td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td>シグマ</td><td> P8970 </td><td>トリスの0.1％ </td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>ハーバード·インスツルメンツ</td><td> GC100-10 </td><td> 1.0ミリメートル、外径、 0.58ミリメートル、内径</td></tr><tr><td>電極（Genetrodes、OVOで、L字型</td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td>メッキ5ミリメートル金</td></tr><tr><td> ECM 830平方パルスジェネレータ</td><td> BTX </td><td> 45から0002 </td><td> OVO electroopration のための</td></tr><tr><td>速いグリーン</td><td>シグマ</td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td>私はラットのコラーゲン</td><td>シグマ</td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15培地（粉末） </td><td>シグマ</td><td></td><td>蒸留水に2.76グラム/ L 5X溶液の</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S8761 </td><td> 7.5％のソリューション</td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 12348-017 </td><td>フェノールレッドなし</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> A1286001 </td><td> 100xのソリューション</td></tr><tr><td> B-27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / mlの</td></tr><tr><td> L15培地（液体1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tD&gt; <td> 15度傾斜</td></tr><tr><td>ステンレススチールヘッドピン</td><td>ワトキンスとドンカスター</td><td> E6871 </td><td> A1サイズ</td></tr><tr><td> Sylgard 184エラストマー</td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVisionコア顕微鏡システム</td><td>アプライドプレシジョン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

胚の脊髄は中枢神経系（CNS）のニューロンとグリア細胞の大部分を生じさせる神経前駆細胞をサイクリングで構成されています。ずっとそのパターン脊髄を分子メカニズムについて知られ、ニューロンの分化1、2を引き出すされていますが、我々は、細胞の挙動のレベルでこれらの初期のイベントの深い理解を欠いている。彼らは神経を受けると、それはリアルタイムで神経前駆細胞の挙動を研究するため、非常に重要です。 過去には、初期胚組織のリアルタイムイメージングは​​、細胞/組織培養中の生存率と同様に蛍光イメージングの光毒性影響によって制限されていました。ここでは、新規のex vivoでのスライス培養プロトコルと広視野蛍光顕微鏡（ 図1）を利用し 、長時間のイメージングなどの組織のための新規アッセイ法を提示します。このアプローチでは、ニワトリ胚の長期的な時間経過のモニタリングを実現高い空間分解能と時間分解能を持つピナル脊髄前駆細胞。 このアッセイは、画像に携帯電話とサブセルラー行動の観察に加えて、胚組織3、4の範囲を変更することができ、遺伝子活性のための新規の開発と高感度レポーター（例えば、Notchシグナル伝達5）は 、このアッセイを行うシグナル伝達を理解するための強力なツールでは、胚発生過程における細胞挙動を制御します。

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High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K ビュー.  University of Dundee, Dundee, UK. リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

神経科学

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

人間の中脳の高解像度機能的磁気共鳴画像法

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

高解像度<em&gt;インビボ</em&gt; 3T磁気共鳴画像を用いたヒト海馬サブフィールドのためのマニュアルセグメンテーションプロトコル

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

ヒト皮質下の高分解能構造磁気共鳴イメージング<I&gt;インビボ</I&gt;と死後

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Methods Article

開発神経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

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開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

開発神経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング