この作品は、マクネア財団、NARSAD、およびNINDS助成R00NS064171 - 03をサポートすることによって資金を供給された。

（1） その場脳固定で *リン酸塩を充填した10mlのシリンジ（28ゲージの針を）準備生理食塩水（PBS）がバッファされます。 * PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填した10mlのシリンジ（28ゲージの針を）準備する。ポスト固定用PFA / PBSの準備金は、さらに5〜10 mlです。 <ol><li> AVERTINまたはネンブタールの致死量を実験的にマウスの腹腔内に注入する。 </li><li>マウスが鎮静されると、エタノールで腹部を濡らし、コルク、ワックス、または解剖ピンを使用して、シリコーンエラストマーとの重ねトレーの底にマウスを固定します。腹部を上に向けて、表面に4つの足を確保 - できるだけ広く、それらを広める。 </li><li>胸骨のレベルで鉗子で皮膚をつかみ、そして肝臓を露出させる横方向のカット。肋骨と横隔膜を通って横方向にしてからカット。リブ組織のフラップを取り外し、心臓がアクセス可能になるまで切削を続けます。 </li><li>ピアースまたは以下略循環血液を排出する右心房。 </li><li>左心室経由でPBSの灌流によって循環系から残留血液をフラッシュします。 </li><li>同じ針穴へのアクセス、左心室経由でPBS / PFAのその後の灌流により全体のマウスを修正。 </li></ol> 2。解剖と脳の抽出<ol><li>頭蓋を公開するために前方の皮膚を引っ張ることによって続いて、外耳道と目の軌道の周りにカットすることで頭、首、および頭蓋から皮膚を取り除きます。 *）2.5にステップ2.2）については、図2を参照してください</li><li>骨のはさみを使用して、目から鼻甲介の骨を介してソケットを十字にカット。各サイドに対して、この手順を実行します。クロスカットは、目や嗅球の前方にする必要があります。 </li><li>それぞれの外耳道から眼窩に縦に切る。 </li><li>小さな解剖鋏を使用して、他の一つ外耳道から小脳の上に横たわって後頭骨の板をカット。 </li><li>同じ解剖鋏で、嗅球のレベルに正中線に沿って前方にカット。 </li><li>鉗子を使用して、骨を持ち上げ時の脳は無傷のまま保たれるように、結合組織を除去するために注意しながら、脳から各骨プレートを取り外します。 </li><li>スニップ視神経と脳神経、上部頚椎の椎骨を切断し、固定液に脳を取り除く。 </li><li> 4℃1〜2時間℃の洗浄を3回PBSで各15分のポストフィックス。 </li></ol> 3。アガロース包埋<ol><li>電子レンジでPBS生理食塩水で2％の高強度、低ゲル融点アガロースタイプIBを（A0576シグマのカタログ番号）メルト。 </li><li>試験管に溶融アガロースを転送する。温度平衡になるまで暖かいインキュベーターまたはウォーターバス（40 ° -41 ° C）における場所の試験管。 </li><li>シアノアクリレート系接着剤（ 図3A）と試料の注射器のプランジャーの上に接着固定された脳組織。脳スライスからのアガロースのリングの後のリリースを容易にするために脳組織の表面の飽和スクロース- PBS溶液の薄層を磨きます。 </li><li>プランジャハウジング（ 図3B）に脳組織でプランジャーを下に描く。 </li><li>ピペットまたは脳組織をカバーする、プランジャハウジングに暖かいアガロースを注ぐ。アガロースに気泡をトラップすることは避けてください。アガロースの気泡は、スライスの品質が損なわれます。 </li><li>寒さ（-25〜0 °℃）1分間アガロース（ 図3C）を設定するには、ぞっとするブロック。と試料のシリンジクランプ</li></ol> 4。 Compresstomeで脳のスライスをセクショニング<ol><li> Compresstome（ 図3D）に脳組織を含む検体の注射器を組み立てます。 </li><li>試料の注射器の出口（ 図3E）と密接にカミソリの刃のエッジを合わせます。 </li><li> PBS溶液でバッファタンクをいっぱいに。 </li><li>試料の注射器のアガロース - 脳組織のブロックを押し出すことを楽しみマイクロつのスライスの厚さを回転させます。 </li><li>セクショニングプロセスを開始するCompresstomeの制御ユニットの&quot;スタート&quot;ボタンを押してください。 </li><li>希望のスライスが厚さを決定する時に得られるまで、4.5）にステップ4.4）を繰り返します。 </li><li> PBS（ 図3F）を充填したバイアルまたは染色のウェルにブラシまたはピペットで収穫の脳スライス。 </li></ol> 5。光のクリア<ol><li>グリセロールの体積ソリューション：：PBS 75パーセント巻を準備します。 </li><li>収集した脳スライスからのPBS洗浄の半分のボリュームをオフ（またはピペット）注ぐ。 </li><li>グリセロール/ PBSで削除されたボリュームを再び追加します。 </li><li> 4℃で穏やかに混合して平衡化することを許可° Cのスライスのシンクまで。 </li><li>最後のグリセロール濃度が75％に達するまで）6.4手順6.2）を繰り返します。 </li><li> PBSで90％グリセロールとソリューションを交換し、平衡化することができます。 *注意：グリセロール溶液を加えながら、気泡を導入するように注意してください。気泡が均一equilibraと干渉するので、徐々にソリューションを注ぎ、軽く混ぜるるとは、取り付けスライドに引き継がれます。 </li></ol> 6。スライスは、イメージングのための取り付け<ol><li>マイクロスライド（Superfrostプラス、25 X 75 X 1ミリメートル、猫の表示可能領域に収まるように開いた長方形に両面シールの接着剤（SA - S - 1L、グレースバイオラボ）をカット。＃48311から703、VWR ）2-3 mm幅の側面を持つ。 </li><li>ピペットや絵筆を使って粘着テープの長方形の中心の内側の脳切片を置きます。穏やかな吸引で余分なグリセリンを削除します。 </li><li>絵筆と目的の順序でスライド上に脳スライスを配置します。 </li><li>気泡を導入しないように注意しながら粘着テープの上にゆっくりと下カバーガラス（24 X 60 mmの猫。＃48383から139、VWR）、。ゆっくりと粘着テープとの接触を確実にするためにカバーガラス上に圧力を適用する。 </li><li>スライドとカバーガラスの間のエッジからの過剰なグリセロールを吸引除去する。 </li><li>透明なマニキュアを使用してシールのスライドとカバースリップ。 </li><li>イメージングの前に乾いてから、または4でスライドボックスで、長期保管℃に</li></ol> 7。代表的な結果： 加工、イメージング、および蛍光標識した脳組織を分析するには、神経生物学の研究に不可欠になっています。これらの調査の多くは、低および高解像度の画像解析の両方に続いて、標的神経細胞のサブセットでレポーターの発現を得るために、高度な遺伝子操作が必要です。しばしば実験的および技術的な限界は、それが不可能に同じ動物からのデータの、または迅速な方法でこれらの型を得ることができる。この挑戦の蛍光イメージングエイズのための光学クリア、半厚い脳切片の調製。急行EGFPに設計さ遺伝子組み換え狂犬病ウイルスで標識された無傷の厚い脳スライスの例、および落射蛍光と共焦点顕微鏡を用いて画像を図4および図5に示されています。落射蛍光イメージングのために我々は、ライカM205 FAを用い、共焦点画像取得のために我々はツァイスLSM 510を使用していました。添付のプロトコルの比較的単純なため、このメソッドは1日未満のターンアラウンド時間と蛍光レポーターを発現する組織から有用な画像データをもたらすことができ、両方の低および高解像度の光学顕微鏡と互換性があります。 調査員が追加の死後標識方法、免疫組織化学染色を、組み込むか、シンナーのセクションを作ることを選択した場合、プロトコルに応じて長くなる。しかしながら、上記の方法はそのまま脳に不可欠なレポーター発現のスクリーニングパターンのための単純で比較的ハイスループットメソッドを表します。 <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="図1"/> 図1固定、解剖、スライス、クリア、および半厚い脳スライスの取り付け手順をdiagramingフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。無傷のマウスの脳を抽出するためにシーケンシャル切削手順の図。 <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。Compresstomeを使用して脳組織をマウントし、スライスする手順。瞬間接着剤を使用してプランジャーを切断の上に脳組織のA）の配置。 B）アガロース包埋のためのプランジャーに取り付けられた脳組織ダウン描く。 C）チルド圧縮ブロックを用いてアガロース脳のプラグを固める。 Compresstomeカッティングチャンバにアガロースの脳のプラグとプランジャのD）挿入。プランジ​​ャーのデバイスへの黒人のE）アライメント。 Compresstomeバッファチャンバ内への脳スライスのF）切断とコレクション。 <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する前頭皮質を介してグリセロール-クリア脳組織からの厚いスライスの光学顕微鏡像。マウスの脳を介して）冠状スライス（厚さ200 UM）は、ウイルスベクターを発現するEGFPで標識し、落射蛍光ステレオスコープを用いて低解像度で画像化。スケールバーは2mm。 <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。蛍光標識層5 /クリア厚い脳スライス6皮質ニューロンの高倍率画像。でハイライト領域（図4）を介して最大投影Z -スタック（厚さ150ミクロン）の）高分解能共焦点画像。スケールバー、25ええと。

<ol>
	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

建強Kongは、この記事で使用されている製品を製造してPrecisionaryインスツルメンツ社の従業員です。

光学顕微鏡、急速に画面の必要性、画像、経由して調査のための神経細胞のサブセットをターゲットにし、無傷の脳組織内にニューラルネットワークを分析する蛍光タンパク質を使用しての広範な応用を考えると非常に貴重となっています。 ユーザーフレンドリーなウイルスベクターの開発における技術的進歩は、 生体内エレクトロポレーション技術、及び遺伝?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th項目の&gt;名前</th&gt;<th&gt;会社</th&gt;<th&gt;カタログの番号</th&gt;<th&gt;コメント（省略可能）</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;骨はさみ</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044〜10</td&gt;<td&gt; - または同等の</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;解剖鋏</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084〜08</td&gt;<td&gt; - または同等の</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;タイプIBアガロース</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Precisionaryインスツルメンツ</td&gt;<td&gt; VF - 200</td&gt;<td&gt; - 他のvibratomesは互換性があります</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;両面粘着</td&gt;<td&gt;グレースバイオラボ</td&gt;<td&gt; SA - S - 1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrostプラススラ​​イド</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;カバーグラス</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;グリセリン</td&gt;<td&gt; EMDケミカルズ（株）</td&gt;<td&gt; GX0185 - 6</td&gt;<td&gt; - または同等の</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

基礎および臨床の両方神経科学の基本的な目標は、より正常と病気の両方脳内の神経細胞に特徴的なアイデンティティ、分子構造、および接続性の​​パターンを理解することです。この向かって、多大な労力は1-3高解像度の神経解剖学的マップを構築する上に配置されています。光学顕微鏡で分子遺伝学と進化の拡大と神経形態だけでなく、クエリを実行する能力だけでなく、個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワーク4の分子や細胞のメイクアップを歩んできました。げっ歯類のトランスジェニックおよび遺伝子ターゲティング技術を介して神経細胞をマークし、操作する能力の大きな進歩は、今回5月6日で&quot;プログラム&quot;神経サブセットに調査官を許可する。間違いなく、現代の神経科学に最も影響力の貢献の一つは、重要な記者の拡大を続けるツールボックス9を得るために彼らのその後のエンジニアリングと並んで、7-8海洋無脊椎動物の蛍光蛋白質（fps）をコードする遺伝子の探索とクローニングをしている。離散的な神経集団の標的とFPの発現を駆動するために悪用する細胞タイプ特異的プロモーター活性は遺伝的精度で神経解剖学的調査を与える。 ニューロンの工学FPの発現は非常に脳の構造と機能の理解を向上しています。しかし、脳深部の組織で、または三次元の画像の個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワークは、挑戦を続けている。高脂質含有量に起因する、神経組織はかなり不透明であると自家蛍光を示す。これらの固有の生物物理学的特性は、それが困難な数十ミクロンの深さを超えて標準的な落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて高分解能での蛍光標識された神経細胞を可視化し、イメージすること。この課題の研究者を回避するには、多くの場合、シリアル薄い断面の撮影と再構成法10、または2光子レーザー走査顕微鏡11を採用。これらのアプローチの現在の欠点は、それぞれ関連付けられている労働集約型組織の準備、もしくはコスト高の計測です。 ここで、我々は、光クリアとイメージングによる固定半厚いマウスの脳スライスで蛍光標識された細胞を可視化するため、比較的迅速かつ簡単な方法を提示する。添付のプロトコールではの方法について説明します。心臓内の血流、2）解剖と脳全体の除去、3）アガロース、4の固定脳の埋め込 ​​み）新しいビブラトームインストルメンテーションを使用して精密半厚いスライス標本を経由してその場で 1）固定脳組織、5）グリセロール勾配を通じて脳組織をクリア、および6）光学顕微鏡とZ -スタック再建（ 図1）用のガラススライドにマウント。 脳スライスを準備するために我々は、計測の比較的新しい作品が&quot;Compresstome&quot;VF - 200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）と呼ばれる実装しました。この楽器は、他のvibratomesに機能的に似たような機能を持つ電動事前に、ブレードの振動系を搭載した半自動ミクロトームです。他のvibratomesとは異なり、スライスする組織は、ステンレス製シリンダー内にアガロースプラグにマウントされています。組織は、目的のシリンダーから厚さで押し出され、そして前方に進める振動刃でカット。アガロースプラグ/シリンダーシステムは再現性の組織が、取付位置合わせ、および精密切削加工が可能になります。私たちの手、&quot;Compresstome&quot;利回り電気生理学、免疫組織化学、および直接取付、固定組織やイメージングのための高品質の組織切片で。光学清算と組み合わせることで、ここで我々は高分解能蛍光イメージングのための半厚い固定脳スライスの準備を示しています。

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices at JoVE.com

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。 、固定スライス、および光学的に脳組織をクリアすることによって我々は標準的な落射蛍光または共焦点イメージングが無傷の神経組織内の個々の細胞や神経回路網を可視化するために使用できる方法について説明します。

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K ビュー.  Baylor College of Medicine (BCM). ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。 、固定スライス、および光学的に脳組織をクリアすることによって我々は標準的な落射蛍光または共焦点イメージングが無傷の神経組織内の個々の細胞や神経回路網を可視化するために使用できる方法について説明します。

ビデオ: A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

神経科学

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

人間の中脳の高解像度機能的磁気共鳴画像法

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

高解像度<em&gt;インビボ</em&gt; 3T磁気共鳴画像を用いたヒト海馬サブフィールドのためのマニュアルセグメンテーションプロトコル

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

ヒト皮質下の高分解能構造磁気共鳴イメージング<I&gt;インビボ</I&gt;と死後

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...