我々は、その優れた技術サポート、知的入力、および精神的支援先にこれらの研究を動かすことに尽力していたアリスゴーハンとジャオ·チン王の世話になっています。これらの研究は、GAHにNIHの助成金AI036532によってサポートされていました。

1。致死的照射<ol><li>使用する照射器と互換性microisolatorケージに10レシピエントマウスまで置きます。 </li><li>総線量を合計2つの等しい用量（BALB.B受取人のための総投与量= 9 CGY）で照射します。 2回目の照射は、最初の3時間後でなければなりません。注射は、最終照射後4〜6時間の間に発生しなければ。セシウム137のソースまたはRS2、000、照射器のいずれかで照射したマウス。 </li><li>移植の時まで酸性化した水でmicroisolatorケージ内の第二放射線量、ストアマウスを次に示します。 </li></ol> 2。脾細胞の調製<ol><li>制度上のガイドラインに従って1ドナーマウスを安楽死させる。 125x10 6脾-各ドナーは、一般的に75x10 6が得られます。 12×10 6 CD8 T細胞- CD8精製キットを使用して、各マウスは、一般的に6×6が得られます。 </li><li>最初の角を右に直接正中線の縦2cmの切開2cmを行うことで、脾臓を取り除く胸郭下。毛皮、皮膚、内臓膜を介してカットします。 </li><li>脾臓を削除し、5％FBSを含むRPMI 1640でシャーレ内40μlのメッシュスクリーンで脾臓を配置することによって単一の細胞懸濁液を作成します。全体脾臓はメッシュスクリーンを通過するまで、脾臓を分解するために、シリンジプランジャを使用しています。 </li><li>各WTとL2G85.B6ドナーに対して、この手順を繰り返します。 1〜50ミリリットルコニカルチューブ内のすべてのWTは単一の細胞懸濁液を回収し、別の50 mlコニカルチューブにすべてL2G85.B6単一の細胞懸濁液を収集します。 </li><li> 4℃で10分、1,200 rpmで遠心し5％FBSおよびカウント細胞と1640 RPMIに再懸濁したペレット。 </li></ol> 3。骨髄準備<ol><li>ドナーマウスの1後肢から皮膚を取り除きます。 </li><li>慎重に大腿骨と脛骨/腓骨からできるだけ多くの筋肉組織として切り取った。 </li><li>股関節で大腿骨を切り欠いて後肢を取り外します。ちょうど脛骨/腓骨交差点下後部足を切り取る。すべての骨のカットは頑丈なはさみを使用してなされるべきである。 </li><li>慎重に残っている筋肉組織を削除します。腓骨、比較的少ない骨髄が腓骨で発見し、努力する価値はありませんがカットオフ。 </li><li>寒い1640 RPMI 5％FBSで行わ後肢および第後肢同じ処理を繰り返します。 40x10 6骨髄細胞-各マウスに20×10 6の間に生成する必要があります。 </li></ol> 4。骨髄除去<ol><li>メディアと冷たいメディアの少量（〜1ml）を持つ大規模なシャーレ内の場所から1後肢を取り外します。 </li><li>膝関節を切り取る。脛骨にシリンジ（容量&gt; 5ミリリットル）、インサート皮下注射針を使用して、すべての赤の材料は、脛骨の内側から削除されるまで注射器を押し下げる。大腿骨を使用してプロセスを繰り返します。骨髄を欠いた残りの骨を捨てる。第二後肢同じ処理を繰り返します。 </li><li>大型シャーレに骨髄を含むメディアをピペッティングすることによって単一の細胞懸濁液を作成し、シリンジのプランジャーとμlの40を使用画面をメッシュにする。 50mlコニカルチューブにピペット単一細胞懸濁液を行い、氷上で保存する。 </li></ol> 5。 CD3枯渇骨髄からCD3 +細胞を枯渇させる様々な方法があります。私たちの研究室では、ミルテニーバイオテク社（ - 130-093-021 CD3-ビオチン）製のキットを使用しています。製造業者のプロトコルに従って骨髄からCD3 +細胞を枯渇させる。ミルテニーキット用バッファは今後のMACSバッファー（2mMのEDTA、PBS、pH7.2中0.5％BSA）で呼び出されます。 <ol><li> 4℃とカウント細胞で10分間、1200rpmで脾細胞と骨髄細胞を遠心分離することによって細胞を洗浄します。 </li><li>すべての上清を取り除きます。 MACS Buffer内千万骨髄細胞当たり100μlで骨髄細胞を再懸濁します。 </li><li> &quot;製造·プロトコルを使用して、CD3枯渇に進みます。 </li><li> CD3枯渇した骨髄細胞を滅菌PBSで3回洗浄する。 CD3枯渇した骨髄細胞をカウントし、10 7個の細胞を注入するための適切な音量で再懸濁します。 </li></ol> L2G85.B6マウス由来のCD8 T細胞を精製するためのさまざまな方法があります。また、WTの脾細胞ドナーからのCD8 + T細胞を枯渇させるいくつかの方法があります。私たちの研究室では、ミルテニーバイオテク社（ - 130-049-401、CD8浄化 - 130-095-236 CD8枯渇）からのキットを使用しています。 <ol><li> 10 7個の細胞あたり90μlのMACSバッファーのWTペレットを再懸濁します。 &#39;製造プロトコル（ - 130-049-401 CD8枯渇）によるCD8 T細胞の枯渇を続行します。 </li><li> 10 7個の細胞あたり40μlのMACS BufferにL2G85.B6ペレットを再懸濁します。 &#39;製造プロトコル（ - 130-095-236 CD8精製）によるCD8 T細胞の浄化を続けてください。 </li><li>各細胞集団をカウントし、滅菌PBSで各集団を3回洗う。 18x10 6 WT（CD8枯渇）脾細胞とCD8 T細胞を精製した2×10 6 L2G85.B6を注入する適切なボリュームで、各集団を再懸濁します。 </li></ol>7。注射の準備<ol><li>マイクロ遠心チューブにCD8 T細胞を精製し10 7 CD3枯渇骨髄細胞、18x10 6 WT（CD8枯渇）脾細胞、および2×10 6 L2G85.B6を兼ね備えています。 300μlの滅菌PBSに再懸濁しで洗ってください。 </li><li>レシピエントマウスの尾静脈に細胞調製物を注入します。注射は28ゲージの針を使用して行われる必要があります。 </li><li>酸性水とmicroisolatorケージにマウスを保管してください。スコアマウスは毎日クックらによって開発された1得点移植片対宿主病（GVHD）のスコアリングシステムを使用しています。 </li></ol> 8。生物発光イメージング<ol><li>六日後に移植、4mgのD-ルシフェリンとレシピエントマウスを注入します。ルシフェリンのための5分がルシフェラーゼと反応することができます。 </li><li>小さなビニングで5分間生物発光イメージャと画像受信者のイソフルラン室でマウスを麻酔。できるだけ多くのイベントとして収集しながら、これは、高解像度の画像を作成します。 </li><li>リビングを使用してデータを分析映像ソフト。擬似カラー画像のスケールは、最良の結果を得るために変更することができます。しかし、それは同じスケールが実験を越えて使用することが不可欠です。 </li><li>関心領域は、関心のある各領域から放出されるフラックス（光子/秒）を計算することにより定​​量化することができるリビングImageソフトウェアと光のエミッタンスを使用して作成できます。 </li></ol> 9。代表的な結果約7-10日、移植後、マウスはGVHDの臨床徴候を示し始めます。マウスは、グルーミングの不足のためにだらしが表示されます。受信者は、7〜10日後の移植の間重量を失うために開始されます。レシピエントマウスの活動や姿勢は、約12から14日後の移植まで、比較的正常なままになります。移植片対宿主病（GVHD）の累積スコアは着実に最初の2-3週間後に移植（ 図1A）を介して増加します。疾患の経過はマウスの間かなり可変ですが、受信者は一様に30から40 dでGVHDに屈するべきであるAYS移植後（ 図1B）。 図2は、6日後に移植を画像化したレシピエントマウスを示しています。擬似着色されたスケールは脾臓と腸内で放出されている最高の光強度で体全体に光放射率を変化させることを示しています。腸内でCD8 T細胞の蓄積がこれまでの知見と一致している6。レシピエントマウスを後の時点で撮像または ex vivoイメージングのために安楽死させるためにmicroisolatorケージに戻すことができます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 基準 </td><td> グレード0 </td><td> グレード1 </td><td> グレード2 </td></tr><tr><td> 減量（wkly.） </td><td> &lt;10％ </td><td> &gt; 10％ - &lt;25％ </td><td> &gt; 25％ </td></tr><tr><td> 姿勢 </td><td>ノーマル</td><td>安静時だけハンチング</td><td>いくつかのハンチング;損なうmovemeNT </td></tr><tr><td> 活動 </td><td>ノーマル</td><td>活性の低下が軽度から中等度</td><td>静止刺激しない限り、 </td></tr><tr><td> 毛皮の質感 </td><td>ノーマル</td><td>波打ち、軽度から中等度</td><td>重度の波打ち/貧しいグルーミング</td></tr><tr><td> 肌のきめ </td><td>ノーマル</td><td>足/尾のスケーリング</td><td>裸にされた皮膚の明白な分野</td></tr></tbody></table> 表1。クックらは、1996年1でこのスコアリングシステムを開発しました。マウスは、左の基準のそれぞれで、毎日獲得する必要があります。各マウスは、各基準について0から2のスコアを与えられ、総得点は、すべての個別スコアの合計である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> 図1致死量の放射線を照射BALB.Bが10 7骨を移植した骨髄細胞を単独で、または18x10 6 CD8 T細胞枯渇WT脾細胞および2×10 6精製L2G85.B6 CD8 T細胞を持つ。 ）骨髄のレシピエントの臨床スコアデータ単独またはCD8 T細胞とWTの脾細胞を枯渇しL2G85.B6 CD8 T細胞を精製した。 B）の骨髄のレシピエントの生存データ単独またはCD8 T細胞枯渇WTの脾細胞および精製L2G85.B6 CD8 T細胞とは<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">大きく姿を見るにはここをクリック</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> 図2：致死量の放射線を照射BALB.Bマウスは10 7骨髄細胞単独またはL2G85.B6 CD8 T細胞を精製18x10 6 CD8 T細胞枯渇WT脾細胞と2×6を移植した。受信者は、腹腔内注射によって4 mgのD-ルシフェリンを注入したと小さなビニングで5分間のXenogen IVISを用いて撮像した。 psの紫は低強度を表し、赤は関心の高強度領域を表しeudo色の画像が表示されます全体のマウスと全光束（光子数/秒）を定量したの周りに描かれた。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> 図3：致死量の放射線を照射BALB.Bマウスは10 7の骨髄細胞を単独で、またはL2G85.B6 CD8 T細胞を精製18x10 6 CD8 T細胞枯渇WT脾細胞と2×6を移植した。受信者は、腹腔内注射によって4 mgのD-ルシフェリンを注入したと小さなビニングで5分間のXenogen IVISを用いて撮像した。紫は低強度を表し、赤は高輝度を表し、擬似カラー画像が表示されます。受信者は）4日目、B）は6日目、C）は8日目のポスト転送で撮像した。

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示されたマウスでGVHDを誘導するためのプロトコルがマウスGVHDの臨床的に関連のあるモデルを表します。もともとBerger らによって確立された1994年に、C57BL / 6はBALB.Bひずみ組み合わせに、MHC-照合され、依存CD4、最も一般的な臨床シナリオ3と非常に類似してCD8 + Tエフェクタ2によって媒介移植片対宿主病（GVHD）で死亡。それは単独でCD8 + T細胞を移植する?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40μMのセルストレーナー</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-ビオチン</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Biotin MicroBeadsは</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8aマイクロビーズ</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-049-401 </td><td>脾臓からCD8 T細胞を枯渇させるために使用します。 </td></tr><tr><td> CD8a精製抗体カクテル</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-095-236 </td><td>精製するために使用脾臓からCD8 T細胞。 </td></tr><tr><td> D-ルシフェリン</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

移植片対宿主病（GVHD）は、血液学的欠陥の様々な根治療法として骨髄移植の広範な使用に制限する障壁となっている。 GVHDはレシピエントに注入された骨髄移植に存在する成熟したアロ反応性T細胞によって引き起こされるとホストの臓器に損傷を与えるされています。しかし、マウスでは、T細胞がGVHDを引き起こすために骨髄接種に追加する必要があります。大規模な作業は、T細胞応答の移植後を特徴づけるために行われているが、生物発光イメージング技術は、生体内で T細胞の人身売買パターンを監視する非侵襲的方法である。 致死照射後、レシピエントマウスをドナーマウスから骨髄細胞と脾細胞を移植されています。 L2G85.B6（恒常的にルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウス）由来のT細胞サブセットは、移植に含まれています。のみ特定のT細胞サブセットを移植することによって、人は、 生体内で特異的なT細胞サブセットを追跡することができますとその場所に基づいて、様々な時点でGVHDの促進に特異的なT細胞サブセットの役割に関する仮説を開発しています。所定の間隔の移植後に、レシピエントマウスXenogen IVIS CCDカメラを用いて結像​​される。光強度は光子強度（赤=高強度、紫=低強度）に基づいて擬似カラー画像を生成するためにリビングImageソフトウェアを用いて定量化することができる。 4-7日後、移植の間、レシピエントマウスはGVHDの臨床徴候を示し始める。クックら 1は、レシピエントマウスの毛皮の質感、皮膚の完全性、活動、体重減少、及び姿勢に基づいて、病気の進行を定量するためのスコアリングシステムを開発しました。マウスは毎日の得点、そして、彼らは瀕死状態になったときに安楽死させる。レシピエントマウスは、一般的に20〜30日、移植後瀕死になる。 マウスモデルでは、GVHDの免疫学を研究するための貴重なツールです。選択的に移植特定のT細胞サブセットら各サブセットが果たす役割を慎重に識別のための安値。非侵襲的に生体内で T細胞応答を追跡すると、マウスGVHDモデルに付加価値の別の層を追加します。

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Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。 T細胞の人身売買パターンを監視する機能<em生体内で&gt;</em&gt;移植片対宿主病の間にT細胞応答の開発や永続化の詳細な分析が可能になります。

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K ビュー.  The Ohio State University Medical Center. マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。 T細胞の人身売買パターンを監視する機能移植片対宿主病の間にT細胞応答の開発や永続化の詳細な分析が可能になります。

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...