この方法は、免疫抑制ウイルスがB細胞とどのように相互作用するかなど、鳥類ウイルス学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が現在研究室で使用されている不死化細胞株よりも関連性が高いということです。この方法は、鶏の細胞がIBDVにどのように反応するかについての洞察を提供しますが、ALVおよびREVにも適用できます。
この方法は、私たちの研究における鳥の数を減らし、それは研究における動物の使用の交換、削減、および洗練を意味する3つのRsにとって有益です。微生物安全キャビネットでは、少なくとも3回冷たいPBSの30ミリリットルでBFを洗浄する。洗浄した組織をペトリ皿に移し、5ミリリットルの1XコラゲナーゼD溶液を加える。
滅菌はさみやメスの刃を使用して、BFを直径5ミリメートル未満の部分に切ります。摂氏37度で、30分間、周期的に穏やかな攪拌を行います。この後、滅菌パスツールピペットを使用して、繰り返し混合物を吸引し、組織の崩壊を促す。
さらに5ミリリットルの1XコラゲレーターーゼD溶液を組織に加え、摂氏37度で定期的に穏やかな攪拌でさらに30分間インキュベートします。このプロセスを繰り返し、混合物を吸引し、新鮮なコラゲナーゼD溶液を加え、組織が完全に消化されるまでインキュベートする。さらに溶解しない小さな顆粒があることに注意してください。
消化した細胞懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーを通して、カルシウムなしで1X HBBSの20ミリリットルに渡します。5分間400回gで遠心分離機。上清を捨て、ペレットを1X RPMIの10ミリリットルに5%FBSで再懸濁する。
次いで、ポリスクロースとジアトリゾートナトリウムを含む5ミリリットルの密度勾配培地の上に細胞懸濁液の10ミリリットルを重ね合わせる。2 つのレイヤーの間に明確なインターフェイスがあることを確認します。900倍gで遠心分離機、摂氏4度で20分間。
セルは、セルメディアと密度勾配メディアの間のインターフェイスでバンドを形成する必要があります。次に、無菌パスツールピペットを使用して細胞を除去し、冷たいPBSを含むチューブに移します。400倍gで5分間遠心し、冷たいPBSで再懸濁して細胞を洗います。
この洗浄を3回繰り返します。まず、細胞懸濁液を400回gで5分間遠心する。1X完全なIMDMの30ミリリットルで細胞を再懸濁します。
細胞懸濁液のアリコートを取り、トリパンブルー溶液に追加します。Trypan ブルーを除外する生存可能なセルの数をカウントし、セルの数と生存率の割合を決定します。この後、細胞懸濁液を400回gで5分間遠心する。
1ミリリットル当たり1000万細胞の密度で鶏CD40リガンドの1〜20希釈を補充完全なIMDMで細胞を再懸濁する。96ウェルまたは24ウェルプレートで細胞を48〜72時間培養します。48〜72時間の分離後、ウイルスのアリコートを解凍する。
サンプルを渦に入れ、氷の上に保管します。IMDM培地の一次バーサル細胞を再び中断します。細胞懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを取り、トリパンブルー溶液の10マイクロリットルに加えます。
次に、細胞数および生存率の割合を決定する。ウイルスを1X完全にIMDMで希釈し、感染の適切な多重度にしてウイルスを接種させる。この希釈液を渦で混ぜます。
細胞懸濁液を400回gで5分間遠心分離する。次に上清を除去し、ウイルス接種中の細胞を再懸濁する。摂氏37度で1時間、周期的に撹拌します。
この後、細胞懸濁液を400回gで5分間遠心する。ウイルスの接種を除去し、1X完全なIMDM培地で細胞を洗浄します。96ウェルまたは24ウェルプレートのいずれかで細胞を培養します。
本研究では、ニワトリ原生細胞は、可溶性鶏CD40リガンドの存在下でex vivoを続けて培養した。可溶性鶏CD40リガンドの存在下で培養された細胞は、6日間にわたって1ミリリットル当たり902,000から363万個に4倍に増加することが分かる。細胞生存率は、ニワトリCD40リガンドの存在下でも有意に改善される。
代表的な共焦点顕微鏡画像では、感染した細胞は核の周りに緑色の蛍光を有することが示され、これは細胞質におけるIBDVの存在と一致する。これは、IBDVの2つの株、細胞培養適合株、D78、および非常に悪質な株、UK661のために明らかである。RNAは、感染後5時間、18時間、24時間、48時間で抽出され、IBDV VP4遺伝子の保存領域に特異的なプライマーを用いてRT-qPCRを受ける。
IBDV VP4発現は、D78による感染後48時間で16,603部、UK661での感染後48時間で38,632部に増加すると見られる。このデータは、鶏の一次バーサル細胞が細胞培養に適応し、非常に毒性の高いIBDV株の複製をサポートできることを示している。この手順に従って、RT-qPCR、マイクロアレイ、RNA-Seqのような他の方法は、細胞が感染にどのように反応するかのような追加の質問に答えるために行うことができる。
我々は、細胞が減衰株およびIBDVの非常に毒性の高い株との感染にどのように反応するかを比較し、我々は現在、それらが他のウイルス感染にどのように反応するかを調査している。これらの細胞を培養する能力は、私たちは鳥に感染することなく、ウイルスの病原体と免疫抑制の側面を研究することができます。これは、研究における動物の使用の3つのRs、交換、改良、および削減に大きな影響を与えます。
