ドンのくし

<html> 1。酵素的脱グリコシル化<ol><li>蒸発による水分の損失を最小限にするためにPCRチューブを使用してください。チューブ1の7のラベルが一組。 </li><li> 10X G7バッファ、10X糖タンパク質変性緩衝液、および10％のNP - 40を融解し、穏やかに内容物を混合するためにチューブをタップします。室温で保管してください。 </li><li>氷上で酵素含有バイアルを置きます。融解/凍結サイクルを最小限に抑えるようにしてください。 </li><li>のdH 2 O 600μlのhCGβバイアル（150μg）の内容を溶解し、氷上に置きます。 </li><li>のdH 2 Oで10倍株式を希釈することにより1X G7バッファー1mlを準備</li><li> 25μlの1X G7バッファにPNGase Fの0.5μlを希釈し、氷上に置きます。 </li><li> 2μlのα- N -アセチル、α1- 2フコシダーゼ、β1- 3ガラクトシダーゼ、およびα1- 3、6ガラクトシダーゼのそれぞれを組み合わせることにより、エキソグリコシダーゼのミックスを（EGミックス）の準備。 </li><li>示されるようにPCRチューブを設定します。 </li></ol>AK&quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> チューブ/サンプル＃ </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ（0.25mg/ml） </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 10X糖タンパク質変性緩衝液</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td><td> 1μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li>穏やかに混合しての場所、チューブにキャップをサーモは、蓋を閉じ、94℃で10分インキュベートすることによりタンパク質を変性° 4 ° Cホールドが続くC、（サーモサイクラーにPCRチューブを使用しては非常に少量のサンプルで蒸発を防ぎます）。 </li><li>目に見える結露を除去するサーモサイクラーと遠心機からチューブを外します。 </li><li>示されるように以下の試薬を追加します。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> サンプル＃ </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10％のNP - 40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 10X G7バッファ</td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5＆ムー、L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1：50 DIL。 </td><td> - </td><td> 2μlの</td><td> - </td><td> - </td><td> 2μlの</td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td>脱グリコシルミックス</td><td> - </td><td> - </td><td> 2μlの</td><td> 2μlの</td><td> - </td><td> 2μlの</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> EGミックス</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μlの</td><td> - </td><td> - </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td>のdH 2 O </td><td> 10μlの</td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> 全反応巻。 </td><td> 25μlの </td><td> 25μlの </td><td> 25μlの </td><td> 25μlの &lt;/ TD&gt; <td> 25μlの </td><td> 25μlの </td><td> 25μlの </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li>新しいキャップを使用してPCRチューブの蓋を閉め（その一インキュベーションサイクル後に適切にフィットしないので、使用されているものを破棄する）。 </li><li>優しく4回タップしてチューブをミックスして、内容をスピンダウン。 </li><li> 4時間℃で、その後4℃に試料を冷却37℃サーモサイクラーとインキュベートにチューブを入れ</li></ol> 2。脱グリコシル化のサンプルのSDS - PAGE <ol><li> 1.25M DTT、4μlを添加して130μlの新鮮な3X還元SDSローディングバッファーを準備します。 </li><li>各サンプルに準備さ3X還元SDSローディングバッファーの12.5μlを添加します。 </li><li>新しいキャップとチューブの蓋を閉め、穏やかに混合するためにチューブをタップします。 </li><li> 94℃サーモサイクラーにチューブをインキュベート° C、4℃まで冷却後、5分間とするための</li><li>各サンプルの30μlの10〜20％トリス - グリシンゲル上のタンパク質マーカーの10μlをロードします。パート3.1のサンプルの残りを保存します。 ColorPlusプレステタンパク質マーカー10μlをロードします。 </li><li>色素フロントがゲルの底に近くなるまで、室温で130ボルトでゲルを電気泳動させる。 </li><li>ゲルの実行が終了すると、キャストからゲルを削除し、十分なCoomasie青ゲルをカバーするために染色、小さなプラスチック製の箱に入れてください。 </li><li>穏やかに攪拌しながら1時間ゲルを染色する。 </li><li>脱色液50ml中で30分間ゲル3回洗浄する。 </li><li>白色光のトランスやスキャナーを使って画像を記録する。また、ゲルは、フレームにセロファンのシートの間に乾燥させることができる。 </li></ol> 3。 SDS - PAGEゲルでのグリコシル化タンパク質の検出用Pro - Qエメラルド300 <ol><li> 2.1のゲル）と並行して、10〜20％トリス - グリシンゲルにサンプルの残りをロードする。負荷10＆ムー; ColorPlusプレステタンパク質マーカーlの。 </li><li>ゲルは、DMFでのPro - Qエメラルドの試薬を溶解し、株式の修正を準備し実行している間、プロ- Qエメラルド300の洗浄と酸化性ソリューションは、キットに付属の製品マニュアルは、次の染色。 </li><li>電気泳動が完了すると、キャストからゲルを取り出し、プラスチックボックスに入れてください。 </li><li>修正液100 mlを追加し、穏やかに撹拌しながら室温で一晩、それを残すことによってゲルを修正。 </li><li>ジェンティーレ撹拌しながら室温で10〜20分間洗浄溶液100mlでゲルを洗浄してください。新鮮な洗浄溶液で洗浄を繰り返します。 </li><li>ソリューションを酸化25ml中で30分間穏やかに撹拌しながらゲルをインキュベートすることによって炭水化物を酸化する。 </li><li>ステップ3.5で説明したようにゲルを洗浄してください。 </li><li>ゲルは、エメラルド300のステップ3.2〜25ミリリットルに溶解したプロ- Qエメラルド300試薬溶液500μlを添加して染色新鮮プロ- Qの準備を洗浄している間キットに含まれているバッファを染色。 </li><li>ステップ3.8で作成した染色液の25 mlを加え、90〜120分間穏やかに撹拌しながら、暗所でインキュベートすることにより、ゲルを染色する。 </li><li>ステップ3.5で説明する2つの洗浄手順を繰り返します。 </li><li> 300nmのでUVトランスイルミネーターで画像を記録します。プレステラダーを示すゲルの白色光の画像にUV画像を重なるようにプロ- Qエメラルドグリーンで標識されている80kDaのマーカーを、使用してください。 </li><li>ステップ3.11からプロ- Qエメラルド染色ゲルでステップ2.10でCoomasie染色ゲルの画像を比較。 </li></ol> 4。代表的な結果酵素脱グリコシル化後のタンパク質の移動の変化を図2に示されています。 PNGase Fの治療（N -結合型糖鎖の除去、レーン2）、および脱グリコシル化のミックス（;プラスエンド-およびO -結合型糖鎖を除去するエキソグリコシダーゼ、レーン3 PNGase F）と（パネルA、レーン1）コントロールのサンプルを比較。それ以上の低下なしサイズで追加のグリコシダーゼ（レーン4）で消化した後に見られている。糖鎖が除去される質量の変化に加えて、バンドがシャープになる。 17kDaのマーカー（アスタリスク）の下で実行されているバンドは完全に脱グリコシル化hCGβポリペプチド（：16 kDaのMW）を表します。他のバンドは、不完全な脱グリコシル化またはhCGβ、試料中に存在する複数の未同定タンパク質（レーン1参照）から派生させるかもしれない。レーン5〜7は、（コントロール）グリコシダーゼに対応するバンドを示す。 エメラルドグリーンによる糖タンパク質の染色は、この試薬は、タンパク質の分子中に存在するすべての糖鎖を酸化し、汚れのパネルBに示されています。 hCGβを酵素（レーン4〜レーン1）脱グリコシル化されているため、信号の強度が低下する。レーン3および4における残差信号は、使用する酵素に耐性である糖鎖のモチーフ、の存在を示している。レーン4で使用される追加のグリコシダーゼは、いくつかの余分な糖残基を削除する：蛋白質の移行は同じですが、染色の強度のわずかな減少が見られる。耐糖部分は、すべての種類のタンパク質にも存在しません：いくつかのバンドは、それらが広範囲に脱グリコシル化されたことを示す、エメラルドグリーン（括弧内の、UV画像には存在しない）によって検出されなかった。追加データは、hCGβが不均一にグリコシル化されているという結論を支持。レーン2の上側のバンドは多くの糖鎖のグループがまだ存在していることを示し、明るい間にレーン2（矢印）の下側のバンドは、エメラルドグリーンの画像上で気絶です。これらのデータは、マウスの細胞で発現させた組換えhCGβは、複数のグリコフォーム9を含んでいるという結論をサポートしています。であっても同じタンパク質上にあれば、そうでないもの、これらの異なるグリコフォームはいくつかのポリペプチドは、それぞれのコンセンサス部位および/またはいくつかの糖鎖に糖鎖を受信しないグリコシル化の本質的な異質性に起因するものが拡張されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> 図1。分泌または細胞表面の糖タンパク質の典型的なグリコシル化パターン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> hCGβの酵素的脱グリコシル化を示す図2。SDS - PAGEゲル。パネルBは、グリコシル化タンパク質の可視化のためのPro - Qエメラルド300の結果を示しながら、パネルCoomasieブルー染色を示す。サンプル数：1、hCGβ制御、2、PNGase F消化、3、脱グリコシル化のミックスの消化、4、脱グリコシル化Mix Plusのエキソグリコシダーゼ消化、試料5〜7（O - Glyc、O -グリコシダーゼ試薬のコントロールであり、GNA、β- N -アセチルグルコサミニダーゼ、ギャル/フコース、β1- 3ガラクトシダーゼ、α1- 3、6ガラクトシダーゼ、およびα1- 2フコシダーゼ、GalNA、α- N - Acetylglalactosaminidase、ノイ、ノイラミニダーゼ、PNGase、PNGaseのF）

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	<li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation:+nature,+distribution,+enzymatic+formation,+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds.">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease.">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li><li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins.">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li><li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding,+form+and+function.">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li><li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit.">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li><li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF.">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li><li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity.">Novel endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li><li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li><li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes.">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li><li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine.">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of Glycobiology. , (2008).</li></ol>

著者らは、この記事で使用される試薬の多くを生産するニューイングランドバイオラボで採用されています。

糖鎖特異的試薬は、データの解釈を容易にする一方法は、目的のタンパク質のグリコシル化の状態に関する貴重な情報を提供することができる酵素脱グリコシル化とSDS - PAGEを用いてここで説明する。このプロトコルは、タンパク質のグリコシル化の初期の研究のために意図され、それは特に哺乳動物細胞から分泌と膜の糖タンパク質に適しています：この場合、選択された酵素は、特にすべてのN -結合型糖鎖を削除し、またはN -結合型糖鎖に加えて、最も一般的な砂糖になります拡張とO -結合型糖鎖のコアを形成する。グリコシダーゼは、糖とタンパク質骨格の両方の整合性を維持し、化学的脱グリコシル化法と比較して、軽度であることの利点があります。 占有率（アミノ酸がグリコシル化されている）、グリコシル化の程度、または糖鎖の微細構造を決定するために明らかにするために、例えば、Mのような、より高度な技術お尻の分析法、液体クロマトグラフィーやNMRが必要です。 そのシンプルさのため、このプロトコルのいくつかのステップは、調整置き換え、および/または種々の実験ニーズに対応するために組み合わせることができます。しかし、明確に解釈できる結果を得るために、その長所と限界を理解することが重要です。最初に、グリコシダーゼの特異性と純度は非常に重要です：プロテアーゼと他の汚染活動のないようにテストのみ十分に特徴付けられた酵素を使用する必要があります。残念なことに、グリコシダーゼに対する標準的な酵素のユニットの定義はない、ユーザーは、メーカーの仕様に応じて適切な置換を決定する必要があります。第二に、検出の注意深い選択が必要です：）タンパク質染色試薬は、分子量の大幅なシフトで脱グリコシル化の結果場合に便利です。ここに示すようにそのような明確な結果は必ずしも得られていない。他のケースでは、我々は異常なマイルを見てきました脱グリコシル化後にgration（はるかに予測される分子量、または遅くても移行から）。この現象はよくわかっていないですが、それは移行の変化は、タンパク質が脱グリコシル化されている証拠であるといえる。B）抗体と砂糖の検出は、その適用性を制限する独自の課題を提示。それは、一般的な抗糖鎖抗体を生成するためには非常に困難であった、彼らは通常、その使用を制限する複雑な糖鎖のターゲットに対して発生します。また、いくつかのモノクローナル抗糖鎖抗体は、望ましくない交差反応性10を表示。C）レクチンは、（本質的な砂糖の親和性を持つタンパク質）も砂糖の検出に適している、加えて彼らは糖鎖の構造上の洞察を与える。ただし、すべてのそれらの狭い特異性を持っている、と多くの部分的にのみ（彼らは未知の親和性を有することができることを意味します）特徴がある。その結果、正レクチン染色では、GIの存在の指標ではなく、証拠を、提供するようにVEN砂糖。D）化学ラベリングキットは、（糖の過ヨウ素酸酸化に基づいて）すべての糖タンパク質を染色するのに最適な方法であり、そのためよく脱グリコシル化に従うことが適しています。 未知のサンプルを処理するとき、それは糖蛋白質のコントロールを含めることをお勧めします。フェチュインは容易に入手できるNです-とO -糖蛋白質、絨毛性ゴナドトロピンは（両方のサブユニット）にも適しています。ウシ血清アルブミンは（BSA）、ネガティブコントロールとして使用することができます。しかし、それはいくつかの非グリコシル化タンパク質は高濃度で使用する場合は特に、プロ- Qエメラルド300とわずかに反応することに注意してください。そのようなこのプロトコルで使用されているプレステタンパク質マーカーとしての非グリコシル化分子量標準、、シャープなバンドを表示できるという利点を持っている。唯一のチャンスでプロ- Qエメラルド300〜反応これらのタンパク質（80 kDa）の一つです。したがって、ユーザーはそのようなInvitrogeからキャンディケインとして、代わりに糖タンパク質の標準のラダーを実行したい場合がありますnの最後に、nucleocytosolic糖タンパク質（シングルO - GlcNAcので改変されている）のシンプルで-ゲルの検出は、特異性のコントロール11のβ- N -アセチルグルコサミニダーゼに沿って、モノクローナル抗体の使用が可能です。この手法の説明を超えているこの記事の範囲が、それがグリコシダーゼとして言及されるべきは、細胞内に存在する他の多くの糖タンパク質と複合糖質の研究のための便利なツールです。グリコシル化のすべての既知の形態の包括的な治療は、&quot;糖鎖生物学のエッセンシャル&quot;の第2版では見つけることができます。NCBIの本棚で利用できる無料のオンライン（ブックシェルフID：NBK1908、PMID：20301239）12。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCRチューブ</td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCRサーモ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P0704 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td>タンパク質の脱グリコシル化のミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P6039 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td> α- N - Acetylglalactosaminidase </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P0734 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td> α1- 2フコシダーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P0724 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td> α1- 3、6ガラクトシダーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P0731 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td> β1- 3ガラクトシダーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P0726 </td><td>バッファーが付属</td></tr><tr><td> G7 10Xバッファー（500 mMリン酸ナトリウム） </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> --- </td><td> PNGaseFまたはDeglミックスで供給</td></tr><tr><td> 10X糖タンパク質変性緩衝液（5％SDS、400mMのDTT） </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> --- </td><td> PNGaseFまたはDeglミックスで供給</td></tr><tr><td> 10％のNP - 40 </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> --- </td><td> PNGaseFまたはDeglミックスで供給</td></tr><tr><td> 3X SDSローディングバッファー（187.5 mMトリス- HCl pH6.8で、6％SDS、30％グリセロール、0.03％ブロムophenol青） </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> B7703 </td><td> 1.25M DTTが付属</td></tr><tr><td> ColorPlusプレステタンパク質マーカー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10から20パーセントは、トリス - グリシンマルチゲル</td><td>コスモバイオ（株） </td><td> DCB - 414893 </td><td></td></tr><tr><td>カセット電気泳動ユニット</td><td>コスモバイオ（株） </td><td> DCB - 303111 </td><td></td></tr><tr><td>電気泳動用電源EPS 301 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td>プロ- Qエメラルド300糖タンパク質染色キット</td><td>インビトロジェン</td><td> P - 21857 </td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントブルーR </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HPシステム</td><td>セルバイオサイエンス</td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases

グリコシル化、共有結合した糖の付加は、大幅にそのような細胞接着、分子の人身売買、クリアランス、およびシグナル伝達1〜4とのプロセスに影響を与える可能性のタンパク質の主要な翻訳後修飾である。またはセリンまたはスレオニン残基での（O結合型）（図1）、真核生物では、分泌経路における最も一般的なグリコシル化の変更は、コンセンサスのアスパラギン残基（N -結合）で追加です。最終製品は、異なる種、組織、またはタンパク質の間で大きく変動する中に、N型糖鎖合成の開始は非常に、真核生物に保存されている。いくつかの糖鎖は、修正されていない（&quot;高マンノースN -結合型糖鎖&quot;）または、さらにゴルジ（&quot;複雑なN -結合型糖鎖&quot;）で処理されている残る。多様化は、動物細胞における一般的なN -アセチルガラクトサミン（GalNAcを）残基と開始が下等生物1で異なるO -結合型糖鎖、のために見られる。 ENT&quot;&gt;タンパク質のグリコシル化の詳細な分析は、それ自体のフィールドであり、適切に実行するために豊富なリソースと専門知識を必要とする。糖を除去可能な酵素のしかし、様々な（グリコシダーゼ）はのグリコシル化状態の一般的な考え方を持つことが可能に標準的な実験設定におけるタンパク質ここでは、モデル糖タンパク質の分析のためのグリコシダーゼの使用説明：。。二つのN -結合型糖鎖および4個のO -結合型糖鎖5を運ぶ組換えヒト絨毛性ゴナドトロピンβ（hCGβ）、テクニックだけの単純な必要計測機器と代表的な消耗品、そしてそれは容易に複数の糖タンパク質の試料の分析に適応することができます。 いくつかの酵素は糖タンパク質の研究に並行して使用することができます。 PNGase FはN -結合型グリカン6,7のほぼすべてのタイプを削除することができます。 O -結合型糖鎖の場合は、利用可能な酵素は存在しないことを切断するには、目から無傷のオリゴ糖できますEのタンパク質骨格。代わりに、O -グリカンは、簡単にO -グリコシダーゼによって除去される短いコアにエキソグリコシダーゼによってトリミングされています。タンパク質の脱グリコシル化のミックスはPNGase F、O -グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、β1- 4ガラクトシダーゼ、およびβ- N -アセチルグルコサミニダーゼが含まれています。それは同時に、N -結合型糖鎖といくつかのO -結合型糖鎖8を削除するために使用されます。最後に、脱グリコシル化のミックスは中に存在することが特に耐熱単糖を取除くのを助ける他のエキソグリコシダーゼの混合物（α- N -アセチルガラク、α1- 2フコシダーゼ、α1- 3、6ガラクトシダーゼ、およびβ1- 3ガラクトシダーゼ）、を添加した特定のO -結合型糖鎖。 SDS-PAGE/Coomasie青はグリコシダーゼ処理前後の蛋白質の移行の違いを視覚化するために使用されます。さらに、砂糖特有の染色法、ProQエメラルド- 300は、糖鎖がsucceなので低下信号を示しています。ssively削除。酵素的脱グリコシル化は、必要に応じて蛋白質のより多くの数量を収容するためにスケールアップすることができますが、このプロトコルは、糖タンパク質（0.5〜2μg）を少量の分析のために設計されています。

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Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

SDS - PAGEに続く糖タンパク質から糖を削除するには、特定のグリコシダーゼを使用すると、タンパク質サンプルの糖鎖修飾を検出するための貴重な方法ですと、最初の糖鎖生物学の研究に適しています。脱グリコシル化は、次の変更は、ゲル移動度の変化として、あるいは糖鎖に敏感な試薬で染色によって検出することができます。

特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

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36.4K ビュー.  New England Biolabs. SDS - PAGEに続く糖タンパク質から糖を削除するには、特定のグリコシダーゼを使用すると、タンパク質サンプルの糖鎖修飾を検出するための貴重な方法ですと、最初の糖鎖生物学の研究に適しています。脱グリコシル化は、次の変更は、ゲル移動度の変化として、あるいは糖鎖に敏感な試薬で染色によって検出することができます。

ビデオ: Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

生物学

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

微生物の同定とキャラクタリゼーションのためのパイロシーケンシング

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.