このプロトコルは、細菌のglycop%eptideの同定を合理化し、研究者が新規なグリコシル化事象、ならびに株間のグリコシル化に使用されるグリカンの違いを同定することを可能にする。この技術の主な利点は、非グリコシル化の専門家が細菌プロテオームサンプル中の潜在的なグリコシル化事象を同定できることである。オープン検索は、グリコシル化だけでなく、さまざまな修飾の同定に使用できる一般的に適用可能なアプローチであり、任意のプロテオームサンプルに適用することができます。
STB-RPS ストップアンドゴー抽出チップを準備するには、14 ゲージの鈍い針を使用して、47 平方ミリメートルの STB-RPS メンブレンから 3 枚の STB-RPS ディスクを切除し、50 マイクログラムのペプチドを結合させます。ペプチド量が多い場合は、それに応じてディスクの数を増やします。SDB-RPSステージチップを使用する前に、150マイクロリットルの100%アセトニトリルを加え、遠心分離またはシリンジを使用して静かに圧力をかけることによって緩衝液を回転させてチップを洗浄する。
次に、1%TFAを含む150マイクロリットルの30%メタノールで先端を洗浄し、次いで1%TFAを含む150マイクロリットルの90%イソプロパノールで先端を平衡化する。平衡化後、遠心分離またはシリンジを使用して、プロテオームサンプルをSTB-RPSステージチップにロードします。次に、1%TFAを含む150マイクロリットルの90%イソプロパノールで先端を洗浄し、続いて1%TFAを150マイクロリットル洗う。
STB-RPS段階の先端からペプチドを溶出させるには、1つの先端に150マイクロリットルの5%水酸化アンモニウムと80%アセトニトリルを加え、シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって溶出したサンプルを個々のチューブに集めます。あるいは、遠心分離によって溶出する場合は、すべての段階チップに添加した80%アセトニトリル中の5%水酸化アンモニウムで150マイクロリットルを使用し、きれいなプレートに集める。溶出したペプチドを摂氏25度で真空遠心分離により乾燥させる。
次に、糖ペプチドサンプルを富化するために、両性イオン親水性相互作用液体クロマトグラフィー、またはZIC-HILIC、ステージチップを調製する。14ゲージの鈍い針を使用して、470平方ミリメートルのC8メンブレンから1枚のC8ディスクを取り出し、ディスクをP-200チップに詰めてフリットを作成します。次に、シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、50%アセトニトリルに再懸濁された約5ミリメートルのZIC-HILIC材料をフリットに加える。
チップを使用する前に、20 床分の ZIC-HILIC 溶出バッファーで樹脂を平衡化し、樹脂の上に 10 マイクロリットルの容量を残して、樹脂が乾燥しないようにします。次いで、20床容量のZIC-HILIC調製バッファーで樹脂を順次洗浄し、続いて20ベッド容容のZIC-HILICローディングバッファーまたは洗浄バッファーで洗浄する。次に、消化および乾燥したペプチドをZIC-HILICローディングバッファーに再懸濁し、1マイクロリットルあたり4マイクログラムの最終濃度にします。
渦を1分間短時間かけてサンプルを再懸濁させ、その後、Gの2000倍と摂氏25度で1分間回転させます。スピニング後、再懸濁ペプチドサンプルを馴化 ZIC-HILIC カラムにロードし、シリンジを使用して穏やかに圧力を加えて、20 床容量の ZIC-HILIC ローディングバッファーでカラムを 3 回洗浄します。最後に、シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、20床容のZIC-HILIC溶出緩衝液で糖ペプチドを1.5ミリリットルのチューブに溶出し、次いで摂氏25度の真空遠心分離によって溶離液を乾燥させる。
LC-MS 分析では、サンプルをバッファー A* に再懸濁し、1 マイクロリットルあたり 1 マイクログラムの最終濃度にしてから、MS に結合した HPLC-UPLC にサンプルをロードして、糖ペプチドの分離と同定を可能にします。結果の MS データ収集を監視し、データが目的のパラメーターで収集されていることを確認します。プロテオームおよび糖ペプチドを豊富に含むサンプルを分析するには、FragPipe を開き、[ワークフロー] タブをクリックします。
ワークフロープルダウンメニューから、「検索を開く」オプションを選択し、「ファイルの追加」をクリックして、検索するデータファイルを FragPipe にインポートします。次に、[データベース] タブをクリックしてから [ダウンロード] をクリックして、UniProt アクセッション番号を使用して UniProt からプロテオームデータベースをダウンロードするためのダウンロード マネージャを起動します。ダウンロードマネージャで、[おとりと汚染物質の追加]オプションをクリックして、おとりと汚染物質タンパク質をこのデータベースに組み込みます。
次に、[MSFragger] タブをクリックし、[ピーク マッチング] ボックス内で、前駆体の質量許容誤差をデフォルトの 500 ダルトンから 2, 000 ダルトンに増やして、大きな変更を特定します。「実行」タブをクリックして FragPipe の出力場所を定義し、「実行」ボタンをクリックして検索を開始します。信頼性の高い糖ペプチドを割り当てたら、一般的に観察されるグリカン関連イオンを同定し、糖ペプチドの同定を改善します。
次に、[MSFragger]タブをクリックし、観測されたグリカンの決定されたデルタ質量を、個々の質量をスラッシュで区切った[可変修正]セクションと[質量オフセット]セクションに追加します。次に、これらのグリカンのグリカン関連フラグメント塊をMSFraggerのグリコ/ラビイルモッズセクションに追加します。最後に、プロテオミクス研究に関連するすべてのMSデータを、PRIDEリポジトリやMassIVEリポジトリなどの集中型プロテオミクスリポジトリにアップロードします。
アシネトバクター・バウマンニ株AB307−0294のオープン検索は、648.25および692.28ダルトンに対応する2つの優勢なデルタ塊を明らかにした。ACICUカプセルは、843.31ダルトンの予測質量に対応する四糖K単位からなることが知られている。このカプセル構造は、ACICU内で最も頻繁に観察されるデルタ質量と一致する。
株D1279779のオープンサーチ分析は、203.08、794.31、および1588.62ダルトンと一致する複数のデルタ質量の存在を明らかにした。相互作用性ペプチドスペクトルアノテーターを用いて、3つのA.baumannii株にわたって同定された糖ペプチドを評価し、潜在的なグリカン関連イオンを明らかにした。グリカンに焦点をあてた検索は、3つのA.baumannii株すべてで同定された糖ペプチド/ペプチドスペクトルマッチの総数の顕著な増加をもたらし、ACICUの37%増加、AB307-0294の117%増加、およびD1279779の363%の増加に対応する。
個々のMS事象について、グリカン特異的情報を含めると、典型的には観察されたハイパースコアが増加するが、この増加はグリカン依存性が高い。ZIC-HILIC濃縮を行うときは、溶媒の損失が糖ペプチドの単離を損なう可能性があるため、樹脂が常に濡れたままであることを確認してください。グリコシル化の違いに関するデータは、突然変異誘発研究に情報を提供したり、グリカン生合成の原因となる遺伝子クラスを同定したりするために使用することができる。
オープンデータベース検索を使用して、細菌属全体のグリカンの多様性を特徴付け始めました。これは、細菌のグリコシル化が、私たちがかつて考えていたよりもはるかに一般的で多様であることを示しています。
