我々は固定プロトコル、試薬や励ましを共有するための証明の原理実験、リチャード·フェッター用のPalm顕微鏡へのアクセスのためにハラルドヘスとBetzigエリックに感謝します。我々は、マイケルソン、ジェラルディンSeydoux、ステファンアイマー、ルドルフロイベ、キースNehrke、クリスチャンFrøkjr·ジェンセン、DNA構築のためのオードADA-ヌグエマとMarc Hammarlundに感謝します。我々はまた、ツァイスPAL-M、ツァイスELYRA P.1やし顕微鏡のベータ版へのアクセスを提供するためにカールツァイス社に感謝します。

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	<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers.">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24 (2010).</li><li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy.">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li><li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images:+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy.">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li><li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light,+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos.">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy.">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li><li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+background-free,+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+(SOFI).">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li><li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleaching/blinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules.">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li></ol>

この記事への生産とフリーアクセスはカールツァイス社が主催している

ここでは、プラスチック製で、電子顕微鏡を用いた超微細構造をセクションで蛍光タンパク質をローカライズし、画像の蛍光タンパク質を保持する方法について説明します。タンパク質は、ナノメートル分解能にPALM顕微鏡を用いた回折限界以下局在していた。特定の標本にこのプロトコルを適応させるために、次のパラメータを考慮する必要があります。フルオロフォア、定量化、および配置。 蛍光タンパク質や有機蛍光色素の選択は、アプリケーションとモデルシステムによって異なります。我々は、EGFP、YFP、シトリン、mEosFP、mEos2、tdEos、mOrange、PA-mCherry、とdendronの複数形12を含む蛍光タンパク質の様々なテストをしている。各蛍光色素からの蛍光の保全は、すべての蛍光タンパク質が記載された方法を用いて保存することができることを示唆して、類似していた。それはCでうまく表現ので、我々はtdEosを選んだelegansは 、タンパク質はtdEosに融合したときに機能的に推移し、そのため光活性化特性は、ヤシの顕微鏡検査に最も適していた。しかし、tdEosの凝集したか失敗した式が、時折12観察されている。 アプリケーションに応じて、異なる蛍光団はより適しているかもしれません。多くの場合、それは光活性化蛍光性タンパク質を使用する必要はありません。単純な相関蛍光電子顕微鏡では、光活性化蛍光タンパク質を必要としません。 GFPまたは有機色素は、回折限界上記のセクションでタグ付けされたタンパク質からの蛍光画像に使用することができます。例えば、人はイメージ、蛍光顕微鏡を用いて神経網の軸索とイメージングによる電子顕微鏡写真で特定の軸索蛍光顕微鏡で蛍光を蛍光シグナルを関連付けることができます。このような誘導放出の枯渇顕微鏡（STED）12、個々の分子リターン（GSDIM）13続いて基底状態の枯渇顕微鏡のような他の超解像技術や、構造化照明顕微鏡（SIM）14は 、光活性化蛍光タンパク質を必要としません。また、有機色素9,15,16または蛍光プローブ17の固有の特性を使用した超解像イメージング技術は、容易に適用可能である。 各分子の蛍光が空間的にも時間的に分離されているので、手のひらに、分子数を定量化することができる。酸化、過少、過大、および過剰発現：しかし、定量化は、4つの理由のために誤解を招く可能性があります。まず、蛍光タンパク質の画分を変性またはサンプル処理5,12間に酸化することができる。蛍光シグナルの約90％が我々のプロトコルでの固定と包埋を通して維持されたが、試料が切削されており、表面が酸素にさらされた後に、蛍光タンパク質の酸化が発生することがあります。第二に、光活性タンパク質の活性化は、確率的であるため、複数の分子ができる所定の回折限界のスポット8で活性化。複数の分子からの蛍光は1スポットとして現れるでしょう、そして、その結果、タンパク質の総数はundercountedされます。第三に、同様の問題は過大につながることができます。手のひらに漂白することにより、それぞれの蛍光タンパク質は、ローカライズされた後、 &quot;消去&quot;。しかし、蛍光タンパク質は18永久に漂白されることなく、暗い状態から戻ることができます。このような分子は、複数回カウントされます。第四に、タグ付けされたタンパク質は、トランスジーンとして表現さ​​れ、しばしば過剰発現につながることができます複数のコピーに存在しています。したがって、Palmから定量化は、与えられた場所での分子の数を推定するが、正確には判断できないために使用することができます。 電子顕微鏡写真とヤシの画像の位置合わせもあるため、電子ビームによる光と電子顕微鏡と歪みで解像度の違いから挑戦することができます。金粒子は、しっかりとlocのサーブ電子顕微鏡写真で基準マーカーを未実現。しかし、金粒子からfluoresecenceは、光活性化ではなく、大規模な回折限界スポットとして表示されます。このように、電子顕微鏡写真上の蛍光画像の配置は推定値です。歪みもプラスチックセクションと電子の相互作用から生じる可能性があります。そのようなGMA等のアクリル系樹脂は、電子ビームの下にあまり安定しており、プラスチック製の寸法を変更することができます。このような状況下では、超微細構造と蛍光を整列する基準マーカーの非線形変換が必要な場合があります。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬や機器の名称</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>注釈</td></tr><tr><td>高圧冷凍庫</td><td>アブラ州</td><td> HPM 010 </td><td> WohlwendからライカやHPF-01からEMPactとHPM 100を使用することもできます。 </td></tr><tr><td>自動凍結置換ユニット</td><td>ライカ</td><td> AFSの2 </td><td> AFSの1を使用することもできます。 </td></tr><tr><td>ツァイスPALM </td><td>ツァイス</td><td> ELYRA P.1 </td><td>ニコンとVutaraはまた、商業やし顕微鏡を販売しています。 </td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td> FEI </td><td>ノバナノ</td><td>他の高分解能SEM顕微鏡を使用することができます。 </td></tr><tr><td>アセトン</td><td> EMSの</td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td>オスミウムトンetroxide </td><td> EMSの</td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td> EMSの</td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンから</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>ポリサイエンス</td><td> 21447から25 </td><td>この会社の酢酸ウラニルのpHがわずかに高くなっています。 </td></tr><tr><td>グリコールメタクリレート（GMA） </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td>低酸、TEM用グレード。 </td></tr><tr><td> N、N-ジメチル-p-トルイジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>ナルゲン</td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td> EMSの</td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> ACLARフィルム</td><td> EMSの</td><td> 50425から10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEMカプセル</td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td> 3月8日 &quot;DISCパンチ</td><td>テッドペラ</td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td>金ナノ粒子</td><td>ミクロス-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> 2倍濃縮液を要求</td></tr></tbody></table>

nano-fem: protein localization using photo-activated localization microscopy and electron microscopy

タンパク質の分布をマッピングすると、細胞内のタンパク質の機能を理解するために不可欠です。蛍光顕微鏡は、広範囲のタンパク質局在するために使われますが、細胞内の文脈はしばしば蛍光画像では欠如しているされています。免疫電子顕微鏡法は、他の一方で、タンパク質をローカライズすることができますが、その方法は互換性のある抗体の不足によって制限され、形態学の貧しい保全とほとんどの抗原は、試料表面に露出されていないため。相関アプローチはどちら免疫蛍光または遺伝的にタグ付けされたタンパク質から、最初の全細胞からの蛍光画像を取得することができます。次に、試料を固定し、埋め込 ​​まれた電子顕微鏡観察のため、画像は1から3まで相関しているされています。しかし、低解像度の蛍光画像と基準マーカの欠如は、タンパク質の正確な局在を排除。 あるいは、蛍光イメージングは​​、プラスチック中の検体を保存した後に行うことができます。でこのアプローチは、ブロックが区分され、蛍光画像と同じ断面の電子顕微鏡写真を4-7相関している。しかし、相関画像の光の回折限界は個々の分子の位置を曖昧にし、蛍光はしばしばセルの境界を越えて延びている。 ナノ分解能蛍光電子顕微鏡（ナノFEM）を撮像することにより、ナノスケールでの光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と電子顕微鏡を使用して同じ部分をタンパク質をローカライズするために設計されています。 Palmはイメージング個々の蛍光タンパク質による回折限界を克服し、その後、各蛍光スポット8-10の重心をマッピングする。 我々は5つのステップでナノFEM手法を概説しています。まず、試料を固定し、タグ付けされたタンパク質の蛍光を維持する条件を使用して、埋め込まれています。第二に、樹脂ブロックが搭載されている極薄のセグメント（70-80 nm）とに区画されているカバーガラス上に。第三に、蛍光はツァイスPALM顕微鏡を用いて、これらのセクションに結像される。第四に、電子密度の高い構造は、走査型電子顕微鏡を用いて、これらの同じセクションに結像される。第五に、蛍光および電子顕微鏡写真は、基準マーカーとしての金粒子を用いて整列されます。要約すると、蛍光標識タンパク質の細胞内局在は、約1週間でナノメートルの分解能で決定することができる。

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Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

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15.9K ビュー.  University of Utah. 我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。