この方法は、iPSC由来心筋細胞におけるサルコメア成熟の定量的評価に使用することができる。この超解像度ベースのアプローチを使用すると、従来の共焦点イメージングでは不可能なサルコメア組織の微妙な変化を検出することが可能です。使用の少なくとも3時間前に、顕微鏡のスイッチを入れ、試料を室温にします。
顕微鏡の準備ができたら、300マイクロリットルのPALMイメージングバッファーをラベル化された細胞のウェルに加え、チャンバースライドを顕微鏡のステージホルダーに挿入します。1.57 NA 100Xオイルの目的を選択し、イメージングソフトウェアでPALMモードを使用し、TIRF設定を有効にします。フレーム数を 5,000 ~10,000、UVレーザーパワーを0.1%、647レーザーを0.2%、ゲインレベルを50~100に設定します。
取得パラメータがすべて設定されたら、レーザー照明をオンにしてターゲットセルを選択します。画像を取得するには、647レーザーパワーを100%に増やし、ゲインをゼロに減らします。ターゲットセルを約5秒間漂白し、ゲインを50に増やしてPALM画像取得を開始します。
PALM データの再構築のために、取得の最後に、ImageJ でデータを開き、雷雨 プラグインを開きます。プラグインで実行解析を選択し、カメラのセットアップメニューを開きます。ピクセルサイズと電磁ゲインを入力します。
実行解析メニューで、B スプラインの順序を 3 に、B スプライン スケールを 2 に、ピーク強度しきい値を stfwave に設定します。f1、フィッティング半径を3に、初期シグマを1.6に、倍率を5に、更新頻度を50に、横に2にシフトし、OKをクリックします。再構築後、プロットヒストグラムメニューでシグマを選択し、矩形ツールを使用して、可能なアーティファクトを除く対象領域を選択します。対象領域をフィルタに追加し、25 未満の不確定要素を対象領域の値に追加します。
[重複の削除] タブで、距離のしきい値として 10 ナノメートルを入力します。[マージ]タブで、最大距離を 20、分子あたりの最大フレーム数をゼロに、最大オフ フレームを 1 に設定します。ドリフト補正タブで、相互相関を選択し、ビン数と倍率を5に設定し、最終的な PALM 画像を保存して、後処理データをエクスポートします。
サルコメアの長さを解析するには、目的の PALM 画像を ImageJ にインポートし、ラインツールを使用して、Z-ディスクに垂直に垂直に選択したサルコメア構造の間に線を引き、アクチンフィラメント間の最短距離を測定します。解析メニューでプロットプロファイルを選択し、2つのピーク間の長さを取得します。Z ディスクの厚さを分析するには、再構築された PALM イメージを 8 ビット モードのイメージに変換し、リッジ検出プラグインを開きます。
線幅を 20 に、高コントラストを 230 に、低コントラストを 10 に、シグマを 0.79 に、下限しきい値を 25.84 に設定し、最小行長を 20 に設定します。見積もり幅、延長線、および結果の表示を選択し、「OK」をクリックして結果表の平均線幅を使用して、さらに分析します。iPSC由来の心筋細胞と新生児細胞は、不規則に配列が崩壊したサルコメア構造を有する同様のαアクチニンパターンを示す。
定量的評価は、αアクチニンフィラメントの長さと厚さが、iPSC由来の心筋細胞の早期発生状態を示す2つの細胞群の間でほぼ同一であることを示している。対照的に、成人成熟型心筋細胞は、サルコメアの長さがわずかに増加し、Zディスクの厚さを減少させた定期的なサルコメアネットワークを示す。従来の共焦点イメージングとPALMの比較では、サルコメアの長さに有意差は見当たらない。
しかし、iPSC心筋細胞がPALMイメージングを行う場合には、Zディスクの厚さが深く減少することが検出されます。解像度のゲインは、PALM が適用されると観察され、対応する強度プロットによってサポートされます。特に、低品質のバッファーを用いて得られたサルコメア構造は、最適な画像化条件下で捕捉された構造と比較して厚く見える。
このデータ精度の欠如は、フルオロフォアの点滅特性が低下するため、ローカリゼーションイベントごとに検出される光子が少なくなっています。また、ローカリゼーション精度が低下し、再構築されたPALM画像の全体的な解像度が低下します。さらに、サンプルドリフトは、蛍光分子の正確な局在化に影響を与え、画像がぼやけます。
適切なPALM画像を取得するには、イメージング中の過度のサンプルドリフトを避けるために、イメージングシステム全体の熱平衡を可能にすることが非常に重要です。この手順に従って、ミトコンドリアのような他の細胞構造をPALMによって画像化して、心筋細胞成熟の追加パラメータを取得することができる。
