この方法は、膜の完全性と細胞内アーキテクチャを維持しながら、膜タンパク質の染色能力を兼ね備えています。したがって、膜関連タンパク質を正確に局所化するのに本当に強力です。この技術の主な利点は、信頼性の高い遺伝的に複製可能なタグであるAPEX2を、低温置換および凍結置換を含む電子顕微鏡の細胞保存における最先端の方法と組み合わせることである。
これらを組み合わせることで、保存状態の良い細胞内での正確なタンパク質の局在化が可能になります。このプロトコルは、ウイルスがホストセル内で複製するメカニズムを解剖するために使用できます。ウイルスは、多くの場合、感染スキーム中にホストタンパク質をハイジャックします.
ウイルスは小さなゲノムであり、これらの宿主細胞の中で複製するために利用する。最近では、未公開のデータで、この技術を使用してこれらのタンパク質にラベルを付け、ウイルスがどのように複製するかを理解することができました。この技術は、ゴルジの崩壊を引き起こす細菌毒素に関する最近の共同研究で本当に重要であることが判明しました。
cryoAPEXを用いて、通常の免疫蛍光技術を使用して見るのが本当に難しい断片化したゴルジ片で毒素を正確に局地化することができました。この技術を実証することは、大学院生のエレイン・ミヘルクと、私たちの研究室の研究員ステファニー・エンジェルです。HEK293細胞を皿に播種した後、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて、APEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドで細胞をトランスフェクトする。
トランスフェクション後12~15時間で、PBSで細胞を1回洗います。その後、PBSで細胞を皿から15ミリリットルの円錐管に洗い流します。500 x g で 5 分間の遠心分離機。
上清を慎重に取り除き、ペレットを2%グルタルアルデヒド2ミリリットル、0.1モルのカコチル酸ナトリウムを室温でpH 7.4で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、30分間インキュベートします。次いで、試料を摂氏4度で5分間5分間500xgでペレット化する。
ペレットを摂氏4度で遠心分離して0.1モルカコチル酸ナトリウムバッファーの2ミリリットルでそれぞれ5分間3回洗浄します。遠心分離後、上清を取り除く。ペルオキシダーゼ反応を行うために、ペレットを3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁し、その後500xgで5分間ペレット化して洗浄する。
その後、ペレットを5.88ミリモル過酸化水素で3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁する。室温で30分間インキュベートします。ペレットは目に見えて茶色色になり、不溶性DAB反応生成物の存在を示す。
DMEMでカコチル酸ナトリウムバッファーで再び洗浄した後、原稿によると、10%のウシ胎児血清および15%ウシ血清アルブミンを含むDMEMの凍結保護剤溶液の500マイクロリットルの細胞ペレットを再中断する。細胞懸濁液を0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。ペレットを再度、500xgから遠心分離速度をわずかに増加させる。
上清の大部分を捨て、ペレットが乾燥しないように十分な液体が残っていることを確認します。実験室のワイプまたはペーパータオルの角を使用して、細胞ペレットから残りの液体を離します。ペレットがペーストを形成するのに十分な液体を残し、歯磨き粉と同様の一貫性を保つ。
細胞ペレットの2〜3マイクロリットルを吸引し、膜キャリアに堆積させる。表面張力が上にわずかなドームを作成するように、膜キャリアのウェルを完全に充填します。膜キャリアをカートリッジにスライドさせて固定します。
カートリッジを準備済みでプライミングした HPF マシンに入れ、押してフリーズします。カートリッジを液体窒素に浸したまま、膜キャリアをカートリッジから取り出します。プラスチック製のカプセルに入れ、プラスチックカプセルを液体窒素でいっぱいのCryovialに入れ。
化学フードで、溶液のサンプルあたり1ミリリットルを、体積タンニン酸で0.2%重量、そして5%DI水をクリオビアルでアセトンで調製します。液体窒素に入れて凍結します。凍結置換ミックス1バイアルと凍結細胞ペレットを含むCryovialsを凍結置換ユニットサンプルチャンバーに入れます。
膜担体を含むインナーカプセルを液体窒素バイアルから、凍結置換を含む対応するバイアルに移入します。90°Cで凍結置換プロトコルを開始します。24時間後、凍結置換を一時停止し、90°Cに冷却されたアセトンでサンプルを5分間3回洗浄します。
次に、化学フードで、1%オスミウム四酸化物質、0.2%酢酸ウラニル、および5%DI水の溶液のサンプルあたり1ミリリットルをクリボビアルで調製し、液体窒素に入れて凍結します。凍結置換を用いたCryovialsを2個を凍結置換ユニットに入れ、3回目のアセトン洗浄から2つのバイアルを混合して凍結置換にカプセルを移します。それらをインキュベートし、90°Cで72時間置換ミックス2を凍結し、続いて12〜18時間にわたって摂氏0度に徐々に温暖化します。
温度を摂氏ゼロ度に保ち、バイアルにあらかじめ冷却したアセトンを加え、それぞれ10分間3回洗浄します。メーカーの指示に従ってプラスチックビーカーに選択した樹脂混合物を調製し、カプセルを浸すためにバイアルに2%4%と8%の樹脂を加えます。摂氏ゼロ度で2時間インキュベートします。
次いで、15%30%60%90%及び100%樹脂成分のA、B、及びDの室温で4時間だけインキュベートする。20時間後、樹脂成分A、B、C、及びDを混合して調製し、4時間インキュベートする。細胞ペレット側の膜キャリアを平らな埋め込み型に入れ、樹脂混合物A、B、C、D.で満たし、オーブンに入れて24〜36時間摂氏60度で重合します。
重合後、モールドからブロックを取り出し、サンプルを超ミクロトームの垂直チャックに入れ、倍率で視覚化することができます。膜キャリアをブロックから分離するには、膜キャリア上の液体窒素をバビングしてプラスチックから金属を分離し、カミソリブレードを使用して膜キャリアの周りの樹脂を切り離します。分離したら、細胞ペレットドームをブロックの面に残して、膜キャリアを静かに持ち上げます。
露出したセルペレットを上方に向けて、最初の金型よりもわずかに深い平らな埋め込み金型に配置し、樹脂成分A、B、C、D.Polymerizeを60°Cで24~36時間充填します。カミソリの刃を使用して、セルペレットの周りのブロックをトリミングします。次に、サンプルチャックのブロックを超ミクロトームの切り離しアームに置きます。
ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットを取り囲む台形にブロックをトリミングします。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットの90ナノメートル超薄い部分を得る。TEM グリッド上のセクションのリボンを選択します。
フィルターペーパーの端を消してグリッドを乾燥させ、TEM グリッドの保管ボックスに保管します。TEMホルダーにグリッドを取り付け、ホルダーを顕微鏡に入れる。80キロボルトのTecnai T12を使用して、クライオAPEXサンプルをスクリーニングします。
APEX2標識を用いて、対象となる細胞や細胞下構造の画像を取得します。本研究では、従来のAPEX法によるサンプルの調製により、組織化された滑らかな小胞体構造の明確な標識が得られた。高倍率では、積層膜がフリルに見え、同心円膜密度の間に不均一なギャップが存在し、膜の保存と脂質抽出が不十分であることを示した。
cryoAPEXによって調製されたサンプルはまた、組織化された滑らかな小胞体構造の明確に定義された標識を有していたが、膜は滑らかで平行であり、脂質抽出はほとんど見られなかった。90ナノメートル薄い切片のTEM分析は、ハンチントン酵母相互作用タンパク質Eが核エンベロープと同様に末梢小胞体全体に存在することを明らかにした。さらに、タンパク質E密度を相互作用するハンチントン酵母は、ルミナル小胞体膜に沿って定期的に間隔をあけた病巣に分解した。
タンパク質E分布と病巣を相互作用するハンチントン酵母も、従来の固定と脱水で調製されたサンプルに見えました。しかし、広範な膜破壊および抽出が存在し、サンプルを最適ではないものにした。APEX2標識は3つの細胞マーカーを用いて行い、その中でミトコンドリアの特異的染色のみを行い、CAAX-APEX2は、形質膜の特異的染色のみを行った。
細胞内小器官では標識は認められなかった。ゴルジルーメンの染色は、当社のオリジナルのセングプタら原稿に記載されているように、アルファMAN2-APEX2マーカーを使用して評価された。この手順に従って、電子断層撮影や集光イオンビーム走査電子顕微鏡などの三次元法を、目的とするタンパク質の3D分布を調べるため行われてもよい。
このプロトコルで使用される化学物質の多くは有毒であるため、使用前に安全データシートを参照して、化学物質が適切な個人用保護具を使用して処理され、制度上のガイドラインに従って処分されるようにする必要があります。
