この仕事に貢献し、ほとんどがCaffrey膜から構造·機能研究グループ、過去と現在の両方のメンバーである多くの人々があります。すべてに、特にJingquanタンとヨセフライアンズへ、私達は私達の暖かい感謝と感謝の意を。この作品は、アイルランド科学財団（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915、P50GM073210とU54GM094599）、およびFP7のコストとマリー·キュリー·アクション（CM0902とPIEF-GA-2009からの助成金によって部分的にサポートされていました-235612）。

1。ラボセットアッププリ収穫<ol><li>収穫の準備のために、液体窒素を用いて乾燥した泡デュワーを記入し、収穫が行われるかを顕微鏡の横に置きます。 </li><li>水没ストレージパックは、泡デュワー内の液体窒素中で、一方の端を開くと、それは完全にクールなことができます。 </li><li>磁気ワンド（ 図5）で収穫される結晶にマッチするサイズのマイクロマウントを固定します。一方でそれは1ボーラスからいくつかの結晶を収穫する必要がある状況に対応するために、マイクロマウントがプリロードスペア磁気ワンドの数を持つことが重要です。スペアワンドは常時利用可能であるべきです。 </li><li>マイクロピペット、ヒントや収穫顕微鏡の横に結晶成長のために使用された沈殿剤溶液を配置します。それは、メソフェーズをカバーするために、十分が開かれたときに乾燥を防ぐために必要な場合があります。 </li><li>ベンチでノートとペンが近く、及び/又はしているコンピュータが開く。これらは、彼らがクライオ冷却、収穫し、ストレージに配置されているような結晶の品質、外観、位置、ストレージパック番号などを、に関する観測を記録するために使用されます。 </li><li>アシスタントは、人が明らかに続きますプロトコル、様々なステップが行われる順序、およびプロセス全体における自らの役割を理解しておく必要がある収穫を助けるために利用可能である場合。 </li></ol>所定の位置に資機材のすべての私達の次の作業は、次のとおりです。 2。結晶を含有するプレートとウェルズを識別<ol><li>収穫可能な結晶を見つけるための最も簡単で最も直接的な方法は、通常とと交差偏光の顕微鏡を使って手で井戸を検査することです。顕微鏡照明光の強度を調整することで、結晶を見つけるお手伝いをします。 </li><li>代わりに、プレートをノーマルで自動的にスクリーニングし、分極交差しているイメージャD光は、結晶を探すために使用することができます。 </li><li>目で評価してパソコンのモニターにデジタル画像を記録した。 </li><li>はっきりとノートまたはコンピュータで、メソフェーズ中の結晶の品質や位置、大きさで収穫し、レコードコメントのための結晶とそれらの井戸をマーク。 </li><li>イメージャから収穫の結晶を含むプレートを取り外します。 </li></ol> 3。立方メソとよくを開く。方法1 結晶はメソ法での成長したプレートはガラスサンドイッチプレート（ 図2）です。メソフェーズおよびその中の結晶をアクセスするためには、井戸を開く必要があります。これはよくシールはその後削除されることができる上部のカバーガラスをカットするガラスの切削工具を使用して行われます。 よく結晶の上からカバーガラスをカットしたり削除したりするためのいくつかのアプローチがあります。使用するものは、O型によって決定される結晶が成長したものが含まれているfはメソフェーズ。これは非常に粘性とスティッキーキュービック相（ 図3A）またはその以上の流体バリアント、スポンジ相（ 図3B）にすることができます。このビデオの記事では、我々は井戸を開くために、これらのホスティング材料の両方から結晶を採取する方法を示しています。 <ol><li>光顕微鏡のステージ上のガラスサンドイッチ結晶化プレートを置きます。 </li><li>カバーガラスは、スペーサーの上に位置する2つの同心円で、ちょうど井戸の境界の外側に軽くガラス切削工具のスコアを使用しています。新しい切削工具を使用すると、スコアは最小限の印加圧力を必要とします。スコアに必要な圧力があってもほんの少し増加させる新しい工具と交換するが、これは一般的に10ウェルを開いた後に発生します。 </li><li>内側のカバーガラスを解放するために、2つ獲得したサークルとの間の空間にガラスを破る。これは、ガラスの破片や埃がたくさん生成されます。湿らせたそれらを片付けるペーパータオル。 </li><li>細い先端がピンセットでそれを掴んで、井戸から、オフすぐに傾けることによって解放されたカバーガラスを外します。このケースでは、立方晶相は立ち往生のままで、井戸のベースプレート上に代わるものであること。 </li><li>今結晶収穫で使用するための準備ができている立方メソ相の明確なビューを取得するにはズームイン。 </li></ol> 4。キュービックメソとよくを開く。方法2 <ol><li>カバーガラスで平行な直線は井戸の片側にガラス切削工具スコアを使用して、それがうまく自体全体に拡張できます。これは簡単ピンセットへのアクセスとカバーガラスを除去することができる。 </li></ol>この特定のデモでは、カバーガラスは、スティッキースペーサ表面からカバーガラスを解放に亀裂。プロセスでは、カバーガラスの位置にシフトし、沈殿剤は、立方晶相から分離する。カバーグラスを持ち上げたとき沈殿剤のいくつかはそれになる。我々は、露出したbに残っている任意の周囲の沈殿せずメソフェーズのolus。すぐに、乾燥し、結晶を破損する恐れがあり、相変化を受けてからメソフェーズを防ぐためにマイクロピペットを用いてボーラスの上に1μlの新鮮沈殿剤を追加します。ボーラスは現在、結晶収穫で使用する準備ができました。 5。スポンジ相とよくを開く。失敗してスポンジ·フェーズがあるため流れにその能力で動作するように寛容である。うまく毛細管現象の周囲に接触スポンジ相でのその流れの結果、中間相を引き出すなり、結晶が失われます。この出来事の例は、このビデオクリップに示されている。 <ol><li>スポンジ相上でズームとスポンジ相で結晶を見つけるために、通常と交差偏光を切り替える。 </li><li>よくスコアを開くための準備では、セクション3で説明されているようにカバーガラスをカット。プロセスでは、カバーガラスのひび割れ。の試みで、よく亀裂の方向にシフト沈殿剤を開くためにING、最終的には、スペーサーに接触する。沈殿剤で失われるスポンジ相と結晶のその貨物の一部を行く。 </li></ol>この特定のシーケンスでは、顕微鏡に偏光板が完全に逆になっていないと結晶がよく、その内容が表示されたままになるのと同時に、明るいオブジェクトとして見ることができます。 6。スポンジ相とよくを開く。首尾よく<ol><li>スポンジ相上でズームと正常および交差偏光の結晶を識別します。 </li><li>スコアは、4.1節のように、うまくカバーするカバーガラスの部分をカットして取り外します。不完全交差偏光された光は水晶を追跡するために使用されます。 </li><li>それだけで沈殿剤溶液に接触するまで、カバーガラスの開口部を通って、十分に乾いたティッシュペーパーをご紹介します。慎重なソリューションを逃がすLYそれがほとんど全て消えて、その後組織を除去されるまで。これは、カバーガラスの下に撤回する、所定の位置にまだ結晶で、残りの沈殿剤とスポンジ相を引き起こします。 </li><li>スコアは、4.1節に示すように、カバーガラスの残りの部分をカットし、ピンセットで取り除く。このケースでは、スポンジ·フェーズは分割、一部はカバーガラスによく、いくつかの棒に残っています。結晶はカバーガラス上にボーラスになっています。ほんの少し沈殿剤存在があるので、スポンジ相は乾燥に起因する可能性相転移を受けることを開始します。これは、ボーラスの中心に向かって移動し、複屈折のリングとして見ることができます。ただちに移行を停止するボーラスに沈殿剤を追加します。ボーラスは現在、結晶の収穫に使用するための準備ができています。 </li></ol> 7。立方晶相から収穫やクライオ冷却結晶<ol><li>オープンウェル中の立方相ボーラスの結晶を見つけるために、通常と交差偏光の間を行き来する。トンで最大4つの複屈折結晶への彼のビデオシーケンスは、交差偏光を持つ立方晶ボーラスで見ることができます。 </li><li>収穫直後にデュワー内の液体窒素に、クライオループに含まれる、結晶のたてさらさ中間相を調べるために結晶を釣るため、それらを突き刺すように取り付けクライオループ（ 図5）を使用します。理想的には、収穫やスナップ冷却が1継続的かつ迅速な動きで起こるはずです。できるだけ少ない付着メソフェーズは、水晶を用いて回収する必要があります。我々の経験では、低温保護剤は、 メソ -成長結晶中では必要ありません。 </li><li>それはすぐに液晶が正常に収穫されたことを示唆して存在しなくなっていることを確認するために、収穫のために使用されるメソフェーズボーラスを検査収穫後クライオループ内で結晶を探す事が可能ではないので。 </li></ol> 8。スポンジ相からの収穫とクライオ冷却結晶<ol><li>オープンウェル中のスポンジ相ボーラスの結晶を見つけるために、通常と交差偏光の間を行き来する。このビデオシーケンスでは、多くの複屈折結晶が交差偏光下でボーラスで見ることができます。 </li><li>収穫直後にデュワー内の液体窒素に、cryoloopまたはセキュリティサーバ上に含まれている、スポンジ相から結晶を釣るため、それらを突き刺すように取り付けクライオループ（ 図5）を使用します。立方晶相から収穫と同様に、理想的には、極低温冷却プロセスは結晶が実際の収穫イベント間の経過と液体窒素に急落できるだけ少ない時間で収穫された直後に起こるはずです。できるだけ少ない付着スポンジ相が結晶を用いて回収する必要があります。前述のように、クライオ保護剤は、 メソ成長結晶中では必要ありません。 </li></ol> 9。デュアーにクリスタルを格納<ol><li>液体NIに取り付けられたループを沈めたtrogenは泡デュワー内のストレージ·パックの保持スロットのいずれかに配置します。すべての操作は、ループ、磁気ワンドの上部と液体窒素の中に沈めパックを使用して行われます。 </li><li>ノートブックおよび/またはコンピュータ上で収穫し、クライオ冷却結晶の場所と詳細情報を記録する。 </li><li>泡デュワー内のパックは、完全または日の収穫のときに液体窒素を充填した保管や輸送デュワーで棚上げパックホルダーにパックを転送完了しました。結晶は回折データ収集のための放射光施設への輸送デュアーに出荷することができます。 </li></ol> 10。代表的な結果ここで示した収穫とクライオ冷却演習の目的は、ループ状の結晶をガラス化し、デュワーの液体窒素中で保管してくださいするには、クライオループにホスティング中間相から結晶を転送することです。収穫とcどこに理想的な状況であるたryo-冷却は結晶の回折品質は工程で保持されるような方法で行われます。できるだけ少ないメソフェーズは、水晶を用いて回収する必要があります。これは、結晶を配置し、ガラス化を視野にクライオ冷却を高速化するために、回折データ収集中メソフェーズから背景散乱を妨げにならないように、X線ビームは、そのはるかに少ない挑戦でそれを中心にすることである。結晶は見ることができないことができ、クライオ冷却サンプルのいくつかの例を図6に示します。結晶が肉眼で見ることができない場合、それはデータ収集のための27のビームで結晶を見つけて、中央揃えにするために、回折ラスタに頼ることが通常必要である。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="図1" /> 図1に、その上に脂質二重層を示す生体膜の模式図AReは、種々のタンパク質に位置。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：完全にロードされ、密封された96ウェルガラスサンドイッチ結晶化プレート。各ウェルには、50 nlの立方相及び1μlの沈殿剤溶液を含んでいます。明確にするために、立方晶相はスーダンレッドで染色し、沈殿剤溶液は、メチレンブルーが含まれています。資料5から。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：脂質メソフェーズで成長した膜タンパク質の結晶。 Hからバクテリオロドプシンの結晶とキュービック相Eからhalobium。B.ビタミンB12受容体/トランスポーター、BtuBの結晶を含むスポンジ相、 大腸菌 。リファレンス25から。キュービックとスポンジ相はappeaを対比しているパネルAおよびBにおける立方晶相を比較することによって明らかなようにrancesは非常に粘性があると、元の形状を保持します。それは流れない。これは、粗面化された外観を持つメソボーラスの端で特に明らかである。契約により、スポンジフェーズはかなり低い粘性であり、流れない。このように、スポンジ相は元の形状を保持するために失敗し、そのエッジは特徴スムーズです。ジェファーミンを含む沈殿、PEG 400、2 -メチル-2,4 -ペンタンジオール、プロポキシブタンジオール、ヘキサンジオールペンタエリスリトールは、立方晶からスポンジフェーズ4,26への移行が発生することがあります。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="図4" /> 図4は、フローチャートはメソ成長膜タンパク質結晶中の生産、収穫やクライオ冷却（）に必要な手順をまとめたものです。赤い点線で囲まれただけで、それらのステップ行、および（B）に詳細に説明したように、このJoveの記事でカバーされています。パネルには、参考資料3からのものです。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="図5" /> 図5は、空のクライオループは、磁気ワンド上の所定の位置に保持されているピンに取り付けられている。ピン（）収穫やクライオ冷却のためのこの重要なツールのマイクロマウント（B）の拡張された部分が表示されます。 Bのマイクロマウントの終わりの空のループの直径は30μmである。広く他のループの種類をテストしていませんしたが、我々は立方晶とスポンジ相の両方でうまく動作示さMiTeGenがループすることがわかります。 <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="図6" /> クライオループとして放射光ビームラインのインライン顕微鏡で見る。、Bの膜タンパク質の図6収穫し、クライオ冷却結晶。収穫結晶の例（caa3シトクロムオキシダーゼ34（a）、ジアシルグリセロールキナーゼ、DgkA （B））の結晶（青矢印）が収穫結晶がクライオループ上クライオ冷却メソフェーズに表示されていない場所のクライオループ℃の例の極低温冷却メソフェーズを通して見える場所。ループの先端が赤い矢印で識別されます。付着クライオ冷却メソフェーズは青い矢印で識別されます。

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes.">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2/D3+selective+antagonist.">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li><li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole.">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li><li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist.">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li><li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li><li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist.">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li><li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor.">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li><li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist.">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li><li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta(2)+adrenoceptor.">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal++structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function.">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li><li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta(2)+adrenoceptor+complex.">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li><li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin.">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li><li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+nociceptin/orphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic.">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li><li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists.">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li><li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このビデオの記事では、脂質メソフェーズに成長した結晶を採集し、回折データ収集で使用するための準備のために、最終的に構造決定のための極低温に冷却される方法を紹介しました。ホスティングメソフェーズは粘性及び粘着性の立方相以上の流体スポンジフェーズ4になることができます。ガラスサンドイッチプレートが開かれている方法と結晶は非常に収穫される方法と、メソフェーズタイプによって異なります。それは前もって扱っている2つのかを知ることが重要である。ホスティング脂質の身元と使用沈殿剤はこの点で重要であり、結晶化メソフェーズボーラスの物理的な外観は、よく（ 図3）それらを区別するために使用できます。両方メソフェーズタイプから収穫は、この資料で説明された。 ガラスサンドイッチプレート中脂質メソフェーズから小さな結晶を収穫するには、時間、スキル、experを必要とする骨の折れるプロセスです。ience、忍耐と着実に手。収穫のための適切な時間を確保しておくと、すべての物資や機器を事前に手になるように研究室を設置することが重要です。収穫を支援するために二人目は必須ではないが推奨されます。その人は、ストレージパックに収穫された結晶と低温冷却マウントループを置くだけでなく、収穫をして個々に事前にマーキングされたプレートの供給を支援することができます。アシスタントは、回折データ収集中に決定的な証明するかもしれない収穫中に行われた結晶の観測を文書で重要なサポートの役割を果たすことができます。アシスタントが存在しない場合には、音声起動、音声記録装置は、文書化のために有利に使用することができる。 この資料に記載されているプロトコルに従うことで、ビューアを立ち上げて結晶収穫で実行するのに役立ちます。しかし、プロセスは簡単ではありませんし、そのことを理解することが重要であるPRActiceは貴重な膜タンパク質の結晶を収穫に起動する前に必要とされる。それは特に貴重ではないタンパク質の結晶を使用してテストプレートは最初に実験されることをお薦めします。これは、ガラスを切断ガラスの破片を除去し、結晶を見て、収穫の間にそれらを追跡するために、顕微鏡に偏光機能を使用して、中間相の上からカバーガラスを持ち上げ、最後に中間相異なる種類の取扱いには貴重な経験を持つ新米を提供しますと、そこから収穫。メソフェーズの質感、ひいては結晶を収穫することができる容易さは、結晶中に時間の経過とともに変化します。それは価値が低い結晶でなく、より価値のあるものと同じ条件下で増殖させたものと、収穫を実践することが重要である。 メソ又は脂質立方相法28およびこれらで considすべきでリゾチームとタウマチンの結晶を成長させることが可能です材料および方法に精通していることを獲得する方法でパワード。一つは、その気まぐれを知るために第一の無タンパク質メソフェーズでの作業を考慮する必要があります。 ここで示す手順は、すべての快適な20℃またはその辺に行われた。より低い温度でのメソ法によって結晶を成長させることが可能です。したがって、準安定相状態のホスティング脂質としてモノオレインは4℃1,2,29,30で使用することができます。代替案は、低温結晶化のために合理的に設計された31 7.9 MAGを使用することです。我々は、特定の膜タンパク質のターゲットで日常的に低温crysallogenesisを行う。このケースでは、結晶成長と収穫はウォークイン4℃の冷蔵庫内で行われます。このような状況下で働くことは暖かく、快適な服装の必要性ではなく、少なくともそのうち独自の課題があります。 高分子CRYSを使用して構造決定する全体的なプロセスの次のステップtallographyは、結晶を回収し、この記事で説明するようにスナップを冷却で回折データを収集することである。 メソ成長結晶中の通常小さいです。しかし、有用な回折データ収集は20μm9の最大寸法を有する結晶では不可能であった。この目的のために、マイクロビームシンクロトロンX線を使用し、このシリーズ32,33の個別のJoveの記事の焦点である。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コンポーネント </td></tr><tr><td>湾曲したピンセット</td><td>シグマ</td><td> F4142 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>使い捨てのピペットチップ</td><td>ギルソン</td><td>さまざまな</td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>泡デュワー</td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>ガラスと金属廃棄物容器</td><td>ダニエルズヘルスケア</td><td> DD479OL </td><td>ツール</td></tr><tr><td>収穫ループ</td><td> MiTeGen </td><td>さまざまな</td><td>ツール</td></tr><tr><td>収穫顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ1500 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>実験ノート</td><td>さまざまな</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>磁気プッシュボタンのサンプルローディングワンド</td><td>ハンプトンリサーチ/分子寸法</td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>オリジナルパック（ALS風ロボットで使用する場合のみ） </td><td>クリスタル·ポジショニング·システム</td><td> CP-111から035 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>ペッティングデバイス</td><td>ギルソン</td><td>さまざまな</td><td>ツール</td></tr><tr><td>沈殿ソリューション</td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>試薬</td></tr><tr><td>パックベントクライオトング</td><td>クリスタル·ポジショニング·システム</td><td> CP-111から030 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>病みつきになって、ハンドルとロックロッドとのパック棚付き送料ケイン（元ALS-スタイル） </td><td>クリスタル·ポジショニング·システム</td><td> CP-111から029 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>精製水</td><td>ミリポア</td><td></td><td>試薬</td></tr><tr><td>安全眼鏡</td><tD&gt;各種</td><td> NA </td><td>ツール</td></tr><tr><td>サンプルピンベ - 磁気（非銅） </td><td>クリスタル·ポジショニング·システム</td><td> CP-111から015 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>配送デュワー</td><td>テイラー·ウォートン</td><td> CX100 </td><td>ツール</td></tr><tr><td>組織</td><td> NA </td><td> NA </td><td>使い捨て</td></tr><tr><td>タングステンカーバイドガラスカッター（TCTスクライバー） </td><td>シルバーラインツール（ヨービル、イギリス） </td><td> 633657 </td><td>ツール</td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

タンパク質は機械論的レベルでどのように機能するかを理解するための重要なルートでは、理想的には、原子レベルの分解能で、利用可能な標的タンパク質の構造を持つことである。現在、そこに内在性膜タンパク質（ 図1）、それらが形成する複合体に適用されるような情報をキャプチャするための唯一の方法であり、その方法は、高分子のX線結晶構造解析（MX）です。行うためにMX回折品質結晶は、膜タンパク質の場合には、容易に形成しないような、必要とされている。脂質メソフェーズ、特に立方とスポンジのフェーズ1-5の使用を含む膜タンパク質を結晶化させるための方法は、（それは、Gタンパク質共役型受容体のフィールド6-21できた成功に遅れにより、かなりの注目を集めている<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">WWW 。mpdb.tcd.ie</a> ）。しかし、今後メソ又は脂質立方相メソッドでと呼ばれる方法は、独自の技術が付属しています課題。これらは、しばしば微細結晶である結晶は、成長する脂質メソフェーズの一般に粘性と粘着性の性質のために、部分的に発生する。結晶を操作すると、22,23の収穫時に結果として難しいと特にそうなります。問題は24,25を 、収穫のために、その中に極低温冷却と最終的なXをメソフェーズボーラスを公開するために開設し、結晶されています（ 図2）の結晶が成長するガラスサンドイッチプレートのことを要求しており、収穫に先行段階であまりにも生じる線回折データを収集します。 結晶が収穫されている必要があり、そこから立方晶とスポンジメソフェーズ変異体（ 図3）は大いに異なるレオロジー4,26を持っています。立方相は、粘性と太い歯磨き粉に付箋似ています。これとは対照的に、スポンジ相は流れに明確な傾向がより流動的です。開口部結晶化のための井戸containiしたがって、異なるアプローチキュービックとスポンジの段階で成長ngの結晶は確かに別の方法が2メソフェーズタイプから結晶を収穫に必要であるように求められています。洗練され、実装メンブレン構造·機能生物学（MS＆FB）のグループで、このJoveの記事（ 図4）に詳細に記載されているされているだけで行うためのプロトコル。例としては、結晶が正常に収穫し、低温に冷却されている状況を説明しています。我々はまた、問題は結晶の取り返しのつかない損失にそのリードを生じる例の例を提供し、これらの問題を回避することができる方法を説明します。この記事ではビューアをガラスサンドイッチ結晶井戸を開くため、収穫のため、立方とスポンジの段階で成長している膜タンパク質の結晶クライオ冷却するためのステップバイステップの手順が設けられている。

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Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K ビュー.  Trinity College Dublin. 本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

生物学

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.