この作品は、JEL、およびHA、FCA、とJDCのトロントフェローシップの大学にオンタリオ州のHIV治療ネットワーク研究オペレーティング·グラント（ROG-G645）と保健研究の新しい奨励賞のカナダ研究所（MSH-113554）でサポートされていました。著者らは、細胞を提供するためのスクリップス研究所（カリフォルニア州ラホーヤ）、エボラウイルスGPの発現ベクターと一般的なアドバイスでマーニーフスコ、Dafnaアベルソン博士とエリカOllmannサファイアに感謝します。

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	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

10層の細胞の工場は、蛋白質のミリグラム量の生産のための効果的な容器です。このようなローラーボトル、振盪フラスコまたはスピナーフラスコのような他の伝統的な船、上のセルファクトリを使用する主な利点は、追加の実験装置を購入する必要がないということです。標準的なCO 2インキュベーター（〜6.0立方フィート）は、簡単に4つの10層の細胞工場（ 図2）を収...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td>コメント</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ（BCIP / NBT）液体基質溶液</td><td>シグマ</td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤、100X </td><td>インビトロジェン</td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td>抗HAアフィニティマトリックス、クローン3F10 </td><td>ロシュ社</td><td> 1815016 </td><td></td></tr><tr><td>抗HAマウスmAb、クローン16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、処理されたT75 cm 2の組織培養</td><td>コー​​ニング</td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、処理されたT225 cm 2の組織培養</td><td>コー​​ニング</td><td> 431082 </td><td></td></tr><tr><td>治療-1,6 - ウェル組織培養細胞培養プレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td>セルファクトリ、10層のCellSTACK </td><td>コー​​ニング</td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td>セントラオメガ5Kカセット</td><td>ポール</td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td>セントラオメガ30Kカセット</td><td>ポール</td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーガラスカラム、1.0×10センチメートル</td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン</td><td>シグマ</td><td> 17850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>シグマ</td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS）、不活化熱</td><td>インビトロジェン</td><td> 12484-028 </td><td></td></tr><tr><td>トランスフェHDトランスフェクション試薬</td><td>プロメガ</td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuiceトランスフェクション試薬</td><td> EMD /メルク</td><td> 70967から6 </td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG F（ab &#39;）2をアルカリ性</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 31324 </td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ標識抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマグルチニン（HA）ペプチド、100 mgの</td><td> Genscript </td><td>カスタム合成</td><td></td></tr><tr><td> （シーケンス：YPYDVPDYA 95％純度） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> HouseholD漂白剤（4％w / vの次亜塩素酸ナトリウム） </td><td>様々なブランドが利用可能です</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イモビロン-P PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td>ミニプレップのプラスミド精製キット、PureLinkクイック</td><td>インビトロジェン</td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrepプラスミド精製キットPureLink HiPure </td><td>インビトロジェン</td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3を </td><td>シグマ</td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY発現ベクター</td><td>インビトロジェン</td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> 100Xペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、滅菌1X </td><td>シグマ</td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン（PEI）、線形25kDaの</td><td> Polyscience </td><td> 23966 </td><td></td></tr><tr><td>ミルク乾燥粉末をすくい取る</td><td>カーネーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES真空ろ過装置、 </td><td>ミリポア</td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmの、500mlの容量</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA、0.05％（w / v）の</td><td>インビトロジェン</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20を</td><td>シグマ</td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td>バルプロ酸</td><td>シグマ</td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td>タンジェンシャルフローシステムセントラ</td><td>ポール</td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2の加湿インキュベーター、標準6.0立方。フィート</td><td>様々なブランドが利用可能です</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動およびトランスファーユニット</td><td>様々なブランドが利用可能です</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター、37°C </td><td>様々なブランドが利用可能です</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

細菌における組換えタンパク質の発現、一般的にE.大腸菌は 、蛋白質のミリグラム量の発現のための最も成功した戦略であった。しかし、原核生物宿主は、多くの人間は、ウイルスまたは真核生物の外国の高分子の毒性に起因するタンパク質、タンパク質の折り畳み機構の違い、または特定のCO-または細菌の翻訳後修飾の不足のための発現に応じてではありません。酵母（P.パストリスもしくはS.セレビシエ ）1,2、バキュロウイルス感染昆虫（S. frugiperdaまたは T NI）セル3、 および in vitro翻訳システムにおいて 、無細胞に基づく発現系は、2,4は正常にするために使用されている哺乳動物のタンパク質を生成します。直感的に、ベストマッチは、適切な翻訳後修飾を含む組換えタンパク質の生産を確保するために哺乳動物宿主を使用することです。哺乳動物細胞株の数（ヒト胚キッドネイ（HEK）S V40 larget T-抗原（COS）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）などを運ぶO riginで293、C V-1細胞）は、正常ヒトタンパク質の数ミリグラムの量を過剰発現するように利用されてきた5-9しかし、哺乳動物細胞を使用することの利点は、多くの場合、安定発現細胞株を開発するコストが高く、特殊な実験装置の要件は、低タンパク質の収量と、長い時間によって打ち消されています。コストを低く維持しながら、より高速な収率と生産するタンパク質を増加し、多くの学術的、商業的な研究所の主要な要因である。 ここでは、時間とコスト効率に優れ、接着HEK 293T細胞から分泌されるヒトタンパ​​ク質の発現のための2つの部分から成る手順を説明します。このシステムは、構造生物物理学的および生化学的研究のために機能的な蛋白質のミリグラム量にグラムを生産することが可能です。最初の部分は、目的の遺伝子の複数の構文が生成さです。並行して一時的に小さなスケールの付着HEK 293T細胞にトランスフェクションのd。細胞培養培地中に分泌された組換えタンパク質の検出および分析は、ベクトルでエンコードされたタンパク質精製タグに対する市販の抗体を用いたウェスタンブロット分析によって実行されます。その後、大規模なタンパク質の生産に適したコンストラクトを一過性に10層の細胞工場でポリエチレンイミン（PEI）を用いてトランスフェクトされる。馴化培地リットルボリュームに分泌されるタンパク質は、抗-HAアフィニティークロマトグラフィーによって精製してタンジェンシャルフローろ過を使用して、管理しやすい量に集中している。このプラットフォームのユーティリティは、サイトカイン、サイトカイン受容体、細胞表面受容体、本質的な制限要因、およびウイルスの糖蛋白質のミリグラム量を表現する能力によって証明されています。このメソッドは、成功した三量体エボラウイルス糖タンパク質5,10の構造決定で使用されています。 2インキュベーター以外の追加の機器は、必要ありません。この手順は、急速にそのようなタンパク質複合体、抗原と抗体、ワクチン、または困難な細胞株の形質導入のためのアデノウイルスまたはレンチウイルスの生産のためのウイルス様粒子の生産の共発現として、より複雑なシステムに拡張することができます。

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A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.0K ビュー.  University of Toronto. ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。