NCNPR-USDA-ARSの科学協定号58-6408-2-0009; CDMRP助成賞＃W81XWH-09-2から0093米陸軍医学研究および資材コマンドによる。

1。 THP1細胞培養を維持し、サブカルチャー<ol><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃でRPMI-1640培地でTHP1細胞（10％FBSおよびpH7.4の）を維持する。 </li><li>継代培養細胞を1×10 6細胞/ mlを超えるの細胞カウントを防ぐために週に二度。これは、その変換能力を維持することが重要です。 </li></ol> 2。維持し、サブカルチャードノバンリーシュマニア前鞭文化<ol><li> Lを維持する26で10％FBSを含むRPMI-1640培地（重炭酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウムなし）℃でドノバン前鞭（S1、スーダン株） </li><li>サブカルチャー·Lドノバンは 20-25x10 6前鞭/ ml.Cautionの範囲で最高の細胞濃度で週2回前鞭：全てのメディアおよびソリューションは、使用前に室温に戻しておいてください。 </li></ol> 3。 9の種まきとTHP1細胞の分化6ウェルマイクロプレートと16室のガラス文化をスライドさせて取り付けます。 <ol><li> 10％熱不活性化FBSを含むRPMI-1640培地で4日齢の細胞培養から2.5×10 5細胞/ ml（細胞数は、10 6細胞/ mlを超えてはならない）の細胞数と希釈THP1文化を準備します。各16ウェルチャンバースライドの各96ウェルプレートと文化の4ミリリットルの培養の20ミリリットルを用意しました。 </li><li>希釈された培養細胞懸濁液にホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）を（THP1の分化のための）を追加します（DMSO中50μg/ mlのストックから10μl/20mlの培養）（希薄化後の細胞培養における最終のPMA濃度は次のようになります25 ng / ml）を。 </li><li>デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイを比較するには、clear、平底96ウェルプレートと16室、ガラス、顕微鏡文化スライドで同時にアッセイを設定します。 </li><li>各ウェルまたはチャンバへTHP1-PMAで処理した細胞を200μl分注します。 </li><li> 96 pウェルをインキュベート細胞のほぼ完全な差別化を可能にするために、5％CO 2インキュベーターで一晩37℃でlatesと16ウェルチャンバースライド、。 </li></ol>注：通常、懸濁液中で成長するTHP1細胞は、付着したマクロファージに分化されています。 4。 ドノバンリーシュマニア前鞭で形質転換されたTHP1細胞の感染<ol><li> ドノバンリーシュマニア前鞭との差別化されたTHP1細胞培養の感染、寄生虫の大半は感染metacyclicステージ（長い円筒形、〜5から6日齢の文化）である必要があります。 </li><li>寄生虫比1:10〜THP1細胞は、デジタル画像解析·直接計数アッセイと前鞭毛·レスキュー変態アッセイの両方に感染するのに最適です。 </li><li> Lの希釈した培養物を準備から： ドノバンは、2.5×10 6寄生虫/ mlの寄生虫数（寄生虫比は= 1:10 THP1細胞用）と前鞭2％のFBSを含むRPMI-1640培地で5から6日間培養したもの。 </li><li>ステップ3.5（THP1細胞培養の晩分化後）から、プレートとチャンバースライドを取り出して培地を除去し、無血清RPMI-1640培地で1回細胞培養物を洗浄してください。 </li><li>慎重に洗浄した後、PMA処理した血清を含まない、暖かい、RPMI-1640（〜37℃）培地、Lの希釈した培養液200μlに無血清培地を交換するとTHP1細胞をステップ4.3からドノバン前鞭（2.5×10 6寄生虫/ mlとなる）。各プレートと16ウェルチャンバースライドでTHP1細胞なしでTHP1寄生虫ない細胞や寄生虫のコントロールウェルを設定します。 </li><li> THP1細胞培養に寄生虫を追加した後、37℃でプレートやスライドをインキュベート℃、寄生虫は、分化THP1細胞に感染することができるように、24時間、5％CO 2を 。 </li></ol> 5。試験薬/化合物による感染マクロファージの治療<ol><li>テストアムホテリシンB、スクリーニングのための標準的な抗リーシュマニア薬としてペンタミジンとミルテフォシン。試薬テーブルで述べたように、水またはDMSO中の薬/試験化合物のストック溶液を調製する。 6濃度の各薬物化合物をテストします。 </li><li>直列に2％のFBSを含むRPMI-1640培地で（1:5）新鮮な96ウェルプレートまたは2 mlチューブ（チャンバースライド用）の標準的な薬剤および試験化合物を希釈します。この板における薬物/試験化合物の濃度は最終濃度の2倍です。 </li><li> L.に感染した培養プレートとチャンバースライドを洗うドノバンの前鞭（ステップ4.5から）無血清培地、RPMI-1640培地で少なくとも5回。各ウェル/チャンバーに100μlの培地（2％FBSを含むRPMI-1640）を追加します。複数回の洗浄では、非内在化前鞭の完全な除去を確実にするために必要である。 </li><li>各ウェルまたはチャンバに直列に希釈標準的な抗リーシュマニア薬または試験化合物から100μlの培地を追加します。感染を設定各プレート/チャンバースライドで同時に薬剤を使わずにテッドTHP1細胞を制御します。 </li><li> 37でプレートとチャンバースライドをインキュベート℃、48時間、5％CO 2。 </li></ol> 6。チャンバースライド染色、薬物治療の感染と効果の定量化のための蛍光顕微鏡イメージングと画像解析<ol><li> 48時間のインキュベーション後、無血清RPMI-1640培地でチャンバースライドを3回洗浄する。スライドからプラスチック製のチャンバーをはがして、30秒間、メタノール中のスライドを浸漬することによって細胞を固定。乾燥させるための空気の流れの下で、バイオフード内でスライドしたままにします。 </li><li> （1:2,000）株式（10,000 X）を水で希釈することにより、SYBR Green Iの染色液（5倍）を用意します。 </li><li>私は、室温で15分間ソリューションを染色し、水で1回洗浄し、乾燥させるための空気の流れの下でスライドを残して希釈SYBR Greenで暗い条件下でスライドを染色する。 </li><li> STAIを完全にカバーガラスを置き封入剤の助けを借りて、NEDのスライド。 </li><li> THP1細胞のデジタル画像をキャプチャ：感染（ブランク）を使用せずに、感染症（コントロール）、感染した細胞は同行ニコンエクリプス90I蛍光顕微鏡を用いて種々の希釈液で異なる標準薬または試験化合物（ 図3、図5、図6））で処理NISの要素、AR 3.2ソフトウェアによる。 </li><li>マクロファージの核（大）と寄生虫核（キネトプラストと小）、国立衛生研究所（で開発された公に入手可能な、Javaベースの画像処理プログラムであるImageJは（ 図7）を使用してカウント<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbを。 info.nih.gov / IJ / download.htmlに</a> ）。 100当たりの無鞭毛の数がTHP1細胞を形質転換されたデータを表現する。 </li></ol> 7。パラサイト·レスキュー変態アッセイ：Lの制御溶解ドノバニ無鞭毛に感染したマクロファージ<ol><li>無血清RPMI-1640培地で5.5ステップ3倍から96ウェルマイクロプレートを洗浄します。 </li><li>異なる濃度、30、0.05％SDS処理でテスト異なる界面活性剤の中で秒は制御された溶解（救出寄生虫 &#39;生存能力の損失を最小限にして最大の細胞溶解）に最適です。 </li><li>最後の洗浄後、各ウェルからの無血清培地を除去し、各ウェルに、RPMI-1640（0.05％SDSを含む）の20μlを添加する。 30秒間、プレートを横に振ると、各ウェルに180μlの完全RPMI-1640（10％FBSを含む）を追加します。 </li><li>前鞭に救出無鞭毛の形質転換のための48時間26℃でプレートをインキュベートする。 </li></ol> 8。転換前鞭毛の定量分析（alamarBlueアッセイ） <ol><li> 26℃で48時間インキュベーションした後、すべての救出ライブ無鞭毛は前鞭（ 図1D）に変換されます。 96 pウェルの各ウェルにalamarBlue10μlを追加lates。 </li><li> 26℃で一晩プレートをインキュベートする。 </li><li>一晩インキュベートした後、544 nmの励起、590nmの発光でFluostar銀河光度（BMGラボテクノロジーズ）上の標準的な蛍光のプレートをお読みください。 </li><li> ExcelFit（ 図7-9）と計算のICこれらの曲線から50 / IC 90値（ 表1）を用いて用量反応曲線を（薬剤またはテスト化合物の％の成長対濃度）を準備します。 </li></ol> 9。寄生虫比率へTHP1細胞の標準化<ol><li>アッセイの感度を決定するために寄生虫比にTHP1細胞を標準化しています。注：低/高寄生虫番号/感染症スクリーニングの感度と選択性を損なう可能性があります。 </li><li>プロトコルはTHP1細胞の播種および使用差分除くリーシュ前鞭毛型感染（セクション3＆4）に関して上述に従って寄生虫比にTHP1細胞を標準化1:1.25などの寄生虫にTHP1細胞のerent比、1:2.5、1:5および1:10。 </li><li> 16チャンバースライド（画像解析用）と96ウェルプレート（寄生虫レスキューアッセイ用）寄​​生虫救出と画像解析アッセイを比較する形式で、両方の実験を設定します。 </li></ol> 10。制御された細胞溶解用の異なる界面活性剤の標準化<ol><li>この実験の主な目的は、大幅に救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えることなく、完全な/最大THP1細胞溶解を達成するTHP1細胞の制御された溶解するためのプロトコルを最適化することです。 </li><li>異なる濃度と治療の異なる期間（ 図2）などのTween 20、Tween 80を、トリトンX-100、NP-40およびSDSのような異なる界面活性剤をテストします。 </li><li>寄生虫に対する比THP1細胞は1:10であり、その他の条件は、上記のセクション1から8と同様である。 </li><li>別の処理時間をさらに0​​.05％のSDS処理をテストさらに制御された細胞溶解を最適化するための。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

マクロファージ無べん毛型モデルに基づく抗リーシュマニア薬スクリーニングのためのいくつかの方法があります。アッセイは、宿主動物からすなわち腹腔滲出細胞（PEC）は、末梢血単核球（PBMC）を回収したマクロファージで行うことができます6または骨髄由来マクロファージ（BMM）またはマウスなどの単球細胞株における（J774およびRAW264.7 ）7およびヒト（THP1、U937、HL-60）8球細胞。除した宿主細胞を使用するアッセイは、両方の寄生虫と宿主細胞数に対する薬物活性の交絡効果が考慮されることを確認する必要があります。マウスおよびラットのような様々な情報源から収集した差別化された初代マクロファージは自然の中で、非分裂ですが、これらの細胞調製物は、均一な細胞集団を持たない可能性があります。単球細胞由来の細胞株は、本質的に均質であるとマクロファージ無べん毛型ベースのスクリーニングのためのより良いモデルです。別の単球細胞株のうち、differentiated THP1細胞（ヒト急性単球性白血病細胞株）、非分裂組織化単分子膜を形成し、プライマリ、分離マクロファージへの魅力的な代替手段を提供することができます。 マクロファージ無べん毛型ベースのスクリーニングは、いくつかの方法で行うことができます。 9を数える直接細胞と寄生虫に基づいて古典的な顕微鏡検査は、労働集約的である。自動化の欠如は、このアッセイの有用性を制限する。細胞の計数には時間がかかりますし、染色法を通して寄生虫生存能力の判定が困難であるため、IC 50値の不正確な決定を与えるかもしれません。多くの蛍光色素およびモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーアッセイ10、11のために用いることができるが、これらのアッセイはまたのみに起因する一日に薬物治療の時間間隔の少ない感度と限界に制限されています。細胞内無鞭毛12,13,14の成長を定量化するための利用可能ないくつかのレポーター遺伝子アッセイがあります。オートマットedのスクリーニングは、レポーター遺伝子を用いた可能性がありますが、これらのアッセイはまた、いくつかの欠点を持っています。まず、これらのアッセイの大半は薬剤スクリーニング実験のための理想的でないかもしれませんレポーター遺伝子のエピソーム発現を維持するための薬剤選択が必要です。レポーター遺伝子が導入されることによって方法も寄生虫の生理学的特性に影響を与え、スクリーニングに影響を及ぼす可能性があります。レポーター遺伝子はエピソームプラスミドの一部である場合、レポーターの相対出力は、トランスフェクトされたプラスミドのコピー数（細胞から細胞へと変化する）ではなく薬14の活性に依存するかもしれません。変換されているいくつかのレポーター寄生虫は寄生虫がレポーター遺伝子を維持するために選択圧を必要としませんが、どちらかのゲノムアーキテクチャを破壊することによって、または単に外国のレポータータンパク質の存在15による生物学的影響があるかもしれません。いくつかのレポーター遺伝子ベースのアッセイでは、ある感度と背景活動16の問題。最も重要なのは、レポーター遺伝子発現アッセイは、GFPレポーターgene15特別に1、の多くが生死細胞内無鞭毛を区別しないことがあります。ルシフェラーゼレポーター遺伝子に基づくアッセイは、生者と死者の細胞内無鞭毛を見分けることができるが、これらのアッセイのための基質および細胞溶解バッファーは、大規模なスクリーニング17のために高価です。これらのデメリットとマクロファージ無べん毛型ベースの前のスクリーニングアッセイの限界を克服するために、我々は、この寄生虫救助や変態アッセイを開発し、最適化しました。このアッセイは、良好な均一性を持っており、宿主細胞として、自然の中で、非分裂アールTHP1細胞に基づいています。 ここで説明する寄生レスキュー変態アッセイアッセイは、細胞内の無鞭毛のデジタル画像解析·直接計数に基づいたアッセイに匹敵するものです。蛍光灯やDIC顕微鏡、デジタルIMAGマクロファージの核と寄生虫の核の計数差のためにはImageJによるe分析はさらに微視的計数分析を精緻化してきた。蛍光フィルターや微分干渉コントラスト（DIC）フィルタで画像をキャプチャすることは細胞内寄生体のより正確な計数のためのデジタル画像の画質を向上しています。蛍光およびDIC両方のイメージは明確なマクロファージ細胞のアウトラインおよび蛍光細胞核を有するデジタル画像を取得するためにマージすることができます。マクロファージの核と寄生虫の核は差はImageJで認識することができます。したがって、デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの両方が自動化と大規模なスクリーニングへの応用の可能性を持っています。パラサイト·レスキュー変態アッセイにおける重要なステップは次のとおりです。THP1細胞培養の（a）の繰り返し洗濯リーシュマニア前鞭への暴露後、非インターンのほぼ完全な除去を確実にするために未実現前鞭とSDSで感染THP1細胞の（b）に制御された溶解。両方の手順も自動化を制御することができる、アッセイのスループットに妥協してはいけません。もしあれば、洗浄液の第二段階は、被験薬/化合物へのリーシュマニア感染THP1細胞の曝露後に、残りの非内在化寄生虫を​​除去します。パラサイト·レスキューフォーメーションアッセイは、既存の顕微鏡、レポーター遺伝子および画像解析アッセイ上の重要な利点があります。アッセイは、シンプル、堅牢で再現性のある大規模なスクリーニングのために自動化することができるため、新しい抗リーシュマニア創薬のための大規模な化合物ライブラリーのスクリーニングの重要なアプリケーションを持っている必要があります。さらに、アッセイはまた、in vitroでのリーシュマニア、臨床だけでなく、実験室での分離株の感染性を評価するために適用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA） </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> P1585 </td><td> THP1細胞の分化に必要。 </td></tr><tr><td> RPMI-1640培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> LAB-TEKチャンバースライドシステム（16商工会議所） </td><td>サーモサイエンティフィックヌンク</td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td>クリア、平底96ウェルプレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353075 </td><td>プレートは96ウェルプレートアッセイを実行する</td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> A4888 </td><td>標準的な抗リーシュマニア薬（2 mg / ml）をDMSOに溶解</td></tr><tr><td>ペンタミジンイソチオン酸土LT </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> P 0547 </td><td>標準的な抗リーシュマニア薬（2 mg / ml）をDMSOに溶解</td></tr><tr><td>ミルテフォシン</td><td> EMD Biosciences社、米国</td><td> 475841 </td><td>標準的な抗リーシュマニア薬は、無血清RPMI-1640培地（新鮮な準備）（2 mg / ml）の中に溶解</td></tr><tr><td>スチボグルコン酸ナトリウム</td><td> EMD Biosciences社、米国</td><td> 567565 </td><td>標準的な抗リーシュマニア薬は4％FBSを含むRPMI-1640で準備します。 （1 mg / ml）を</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90I </td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー</td><td> BMG </td><td>ポーラースターギャラクシー</td><td></td></tr><tr><td>ミディアムを装着</td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> AlamarBlue </td><td> ABD Serotec社</td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Iを</td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイ。 </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン80 </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> Sigma-Aldrich社、米国</td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td>カルビオケム</tD&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

a parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular leishmania donovani amastigotes in thp1 human acute monocytic leukemia cell line

リーシュマニア症は、主に途上国を中心に、最貧困層に影響を与え、世界で最も顧みられない病気の一つです。 350万人以上の人々は、リーシュマニア症に罹るリスクがあるとみなされ、約2万人の新たな症例は毎年1を発生しています。 ドノバンリーシュマニアは内臓リーシュマニア症（VL）、病気の最も致命的なフォームの原因物質である。リーシュマニア症を治療するために利用可能な薬剤の選択が2に限定され、現在の治療法は限られた効果を提供し、多くは治療用量で有毒である。また、ファーストライン治療薬のほとんどはすでに増加多剤耐性3のためにそれらの有用性を失っている。抗リーシュマニア薬の現在のパイプラインもひどく消耗しています。持続的な努力は、新しい抗リーシュマニア創薬パイプラインを豊かにするために必要であり、この努力は、in vitroスクリーニングモデルにおいて適当の可用性に依存しています。 in vitroの前鞭4、無菌無鞭毛アッセイ5 においては、主しかしながら、細胞内の無鞭毛と比較して有意な細胞の、生理学的、生化学的および分子の違いに適切でないかもしれない抗リーシュマニア薬のスクリーニングのために使用されます。マクロファージ無鞭毛モデルとアッセイはリーシュマニア症の病態生理学的条件に最も近いと考えられ、したがって、in vitroスクリーニングにおいて最も適していますされています。隔離された初代マクロファージに代わる差別化、非分裂ヒト急性単球性白血病細胞（THP1）（魅力的）、および細胞内無鞭毛に対する種々の化合物の抗リーシュマニア活性を測定するために使用することができる。 ここでは、純粋な化合物とprod自然をスクリーニングするためのドノバンリーシュマニアを用いた in vitro で感染、分化THP1細胞と寄生虫の救助や形質転換試験を提示UCTS抽出物および細胞内リーシュマニア無鞭毛に対する有効性を決定する。アッセイは、次の手順が含まれます。Lとマクロファージの（1）非分裂マクロファージ、（2）へのTHP1細胞の分化は、感染ドノバン metacyclic前鞭、無鞭毛と無鞭毛前鞭へのライブ（6）変換（3）試験薬による感染細胞の治療、（4）感染マクロファージの制御された溶解、（5）リリース/レスキュー。アッセイは前鞭に変換する能力への影響を最小限に抑えながら実行可能な細胞内無鞭毛のほぼ完全な救済を実現するためにリーシュマニア感染THP1細胞の制御された溶解用洗剤処理を使用して最適化された。別のマクロファージ：前鞭比が最大の感染を達成するために試験した。感染の定量は、救出リーシュマニア無鞭毛はアラムによって前鞭、その成長の評価には、ライブの転換を介して実行されました96ウェルマイクロプレートでarBlue蛍光分析。このアッセイは、現在使用されている顕微鏡、トランスジェニックレポーター遺伝子とデジタル画像解析アッセイに匹敵するものです。このアッセイは、堅牢であり、生死無鞭毛を区別しないことがあり、レポーター遺伝子および画像解析アッセイに比べて唯一のライブ無鞭毛細胞を測定します。また、このアッセイは抗リーシュマニア薬の現在のパネルで検証されていて正常に純粋な化合物や天然物フラクション（Tekwani ら未発表）のライブラリの大規模スクリーニングに適用されています。

定量分析は、24、48、72及び96時間後の薬物治療のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの両方に対して行われた L.の直接計数法、感染症のドノバン感染マクロファージ（THP1細胞）は、次式により算出した： <img alt="式（1）" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" />無鞭毛（無鞭毛体の核を計数することによって決定）/ 100 THP1細胞（THP1細胞核でカウントカウントすることによって決定される）（ 図7）が感染したTHP1細胞の割合は異なる規格や試験化合物の効果を分析するためのより正確な尺度で変換は、この数値を直接化合物の全体的な効果に関連しているため、どちらの減少により、以前のいくつかの論文で報告されたようにマクロファージ細胞やマクロファージcells.Infectionから寄生虫の全摘出の寄生虫の様々な時間間隔の異なる希釈（ 図10および表1）に異なった標準薬で治療感染THP1細胞のデジタル画像から算出した。デジタル画像解析ダイレクト·カウント·アッセイのための読み出し寄生レスキュー変態アッセイのための読み出しである相対蛍光単位（RFU）であったが、無鞭毛infection/100が、THP1細胞を形質転換した直接感染マクロファージから救出ライブリーシュマニア無鞭毛の数に比例し、前鞭に変身。 alamarBlueアッセイは日常リーシュ前鞭抗リーシュマニア薬のスクリーニングのために使用されます。 アッセイは、最初に標準化され、 リーシュマニア感染THP1細胞の制御された溶解用に最適化された。目的は、洗剤treのための条件を最適化することでした救出無鞭毛の生存率への影響を最小限に抑えながらTHP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらすatmentは、 図1は、完全なアッセイプロトコールの顕微鏡図を示す。 リーシュマニア無鞭毛に感染無傷THP1細胞を図1Aに見ることができます。 図1Bは、界面活性剤処理後のTHP1細胞の溶解を、 図1Cは、部分的に前鞭と図1Dに変換された救出リーシュマニア無鞭毛は、中に無鞭毛のほぼ完全な変換を展覧前鞭およびその後続の増殖。これらの形質転換前鞭の成長を定量的alamarBlueの添加とマイクロプレートリーダーで蛍光の測定を使用して監視できます。 NP-40（ 図2A）およびTriton X-100（ 図2B）を用いた治療は、感染したTHP1細胞を溶解しますが、それはまた、生存能力に影響を与えたと救出無鞭毛の転換。ツイーン20（ 図2C）およびTween 80（ 図2D）を用いた治療は、形質転換された前鞭の低い数字によって示されるように無鞭毛の不完全な救助に結果THP1細胞の最適な溶解を起こさなかった。 30秒（ 図2E）、0.05％SDSを用いた治療では、 リーシュマニア感染THP1細胞のほぼ完全な溶解をもたらしたと救出無鞭毛の生存率および変換に影響を及ぼさなかった。さらなる最適化は、SECが実行可能なリーシュマニア無鞭毛（ 図2F）の最高救助をもたらした20から30、0.05％SDSを用いた細胞のその治療を示した。その後の実験では、30、0.05％SDSを用いた治療は秒が使用されました。 SDSの治療のための手順は、単一または複数のプレートでも同じです。複数のプレートには、SDS処理はマルチチャンネルピペットで列ごとに実装されました。無血清培地は、全8プレートの1列のウェルと20＆ムーから削除されました、0.05％SDSのlは同じ列の8ウェルで添加し、10％FBSを含むRPMI-1640で30秒後に希釈した。アッセイの初期の標準化の間に、プレートは非内在化前鞭を顕微鏡でチェックした。 5洗浄液の最小値は、標準化合物と3回の洗浄で感染マクロファージ細胞の治療のステップ5の前に寄生虫の除去のために必要であったSDSの治療のステップ7の前に必要であった。このように、細胞を8回洗浄し、目に見える非内在化前鞭は、感染したTHP1細胞の制御溶解前に残っていなかった。 デジタル画像解析と直接計数 リーシュマニア感染THP1細胞のデジタル画像は、（ 図3 SYBR Green Iを用いた染色特性キネトプラストDNAによるマクロファージの核と細胞内リーシュマニア核の両方が蛍光フィルターで観察した後にニコンエクリプス90I蛍光顕微鏡で捕獲された）。さらに、感染したTHP1細胞の画像もDIC下に捕獲された。両方のイメージがマージされたときに、細胞内の無鞭毛を持つTHP1細胞の輪郭が（ 図4）をより明確に見られた。 ImageJのソフトウェアは、これらの画像を分析するために使用された。 ImageJは国立衛生研究所（で開発パブリックドメイン、Javaベースの画像処理プログラムである<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ）。 ImageJはJavaプラグインと記録可能マクロを介して拡張性を提供するオープン·アーキテクチャで設計されています。カスタム収集、解析および処理プラグインはImageJのビルトインエディタとJavaコンパイラを使用して開発することができます。 ImageJのでTHP1細胞核および寄生虫の核のカウント差のために、画像はImageJの年にオープンしました。セルカウンタは、ソフトウェアのプラグインで解析オプションで発見された。画像は初期化され、セルカウンタータイプ1はTHP1 cに選ばれましたエル核と細胞カウンタータイプ2は寄生虫核（ 図3）に選ばれました。差のカウントは少なくとも200 THP1細胞核及びこれらTHP1細胞核内に存在する細胞内無鞭毛のために行われました。寄生虫レスキューアッセイおよび画像解析法の比較は別のマクロファージとTHP1細胞の感染性を評価するために作られました。前鞭毛比：前鞭比（ 図4）図5は、別のマクロファージでTHP1細胞で差感染性を表します。どちらの方法でも同等の結果とマクロファージが認められた：1:10前鞭毛の比率が最適かつ再現性の感染性をもたらした。 parasite-rescue/transformationアッセイおよびデジタル画像解析のための条件が最適化された後、これらのアッセイの有用性は、抗リーシュマニア薬スクリーニングのために評価した。 リーシュマニア感染THP1細胞は、規格の異なる濃度で処理したすなわちNTI-リーシュマニア薬アムホテリシンB、24〜96時間の範囲の異なる時間間隔のペンタミジンとミルテフォシン。寄生虫の実験は、/形質転換試験は三重で行われた救出し、計数法直接細胞の実験は二重に行った。 図6は、未処理およびリーシュマニア感染感染感染していない、コントロールが、THP1細胞を処理した対照の顕微鏡画像を示す。用量反応曲線は、寄生虫の救助や形質転換試験（形質寄生虫対薬物の濃度）と画像解析アッセイ（amastigotes/100 THP1細胞の数）（図7-9）から調製した。薬剤のIC 50は ExcelFitによって計算し、 表1に示されている。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイは、同等の結果を示した。デジタル画像解析ダイレクトカウンティング-Assayは、24および48時間薬剤tの初期の時点の間が最適であったreatments、パラサイト·レスキューフォーメーションアッセイは、薬剤処理後24から96時間の間に全ての時点で報告された値とより一貫性のある結果を示した。デジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキューフォーメーションアッセイによる結果の違いは、デジタル画像解析ダイレクトカウンティングにおける薬物治療の初期の期間中に非現実的な無鞭毛の存在が原因である可能性がありアッセイ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> 図1： ドノバンリーシュマニアの顕微鏡ビューは前鞭への救助や変換を無鞭毛。 - リーシュマニア無鞭毛に感染付着THP1細胞、B -制御された溶解Cの後付着、感染THP1細胞-感染THP1マクロファージ細胞Dから救出無鞭毛からドノバンリーシュマニアの前鞭を一変- TRANの成長と増殖sformed ドノバンリーシュマニアの前鞭。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> 別の洗剤でリーシュマニア感染 THP1細胞から無鞭毛のTHP1細胞と救助の溶解の図2。前鞭にライブドノバンリーシュマニアの無鞭毛とその変換の最大救助を達成するために感染したTHP1細胞の制御された溶解の最適化分析。洗剤の2つの濃度（0.05％及び0.1％）と治療のための2つの期間（30秒、60秒）を試験した。 RFU =相対蛍光単位。各バーは、重複観測値の平均を表しています[A]は 、NP-40治療はTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた。[B]のトリトンX-100 treatmentはTHP1細胞の溶解を引き起こし、また救出無べん毛型原虫の生存能力に影響を与えた[C]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解を引き起こした[D]のTween 80は無鞭毛を救出するTHP1細胞の部分的な溶解が発生していました。【E 】SDS処理はTHP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、0.05％/ 30秒で救出無鞭毛の生存率に影響を及ぼさなかった。【F 20から30、0.05％SDSで]治療秒THP1細胞のほぼ完全な溶解を引き起こし、生寄生虫を救出前鞭に変身する無鞭毛。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> 図3 Leishmani in vitro で感染し、分化THP1細胞の蛍光デジタル画像ドノバンの無鞭毛。特性kDNAも各寄生虫の核と見られる場合があります。マクロファージの核（MN）（1）および寄生虫の核（PN）（2）感染症の定量的評価のために、ImageJの解析ソフトウェアで差動でマークされ、差動でカウントすることができます。定量はamastigotes/100 THP1細胞数として行われました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> 図4デジタル画像解析ダイレクトカウンティング·アッセイ（下のパネル）と寄生レスキュー変態アッセイ（上段）との比較。マクロファージ：1:10前鞭毛の比率が最適な感染をもたらした。どちらも、同等の結果を示した。寄生虫レスキューアッセイは、いくつかのバックグラウンド値を示した。各バーのショーでは、重複値の平均。 <img alt="図5" srC = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg&quot; /&gt; 図5異なるTHP1によってリーシュマニアに感染前鞭THP1細胞：前鞭毛型比。 amastigotes/100 THP1細胞数などの定量的な結果を図4に示されている。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> 図6：異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬による治療後ドノバンリーシュマニアの無鞭毛に感染THP1細胞のデジタル画像（蛍光灯+ DIC）。 結果はamastigotes/100 THP1細胞数として定量化と未処理のコントロールと比較して％の成長率を計算し、IC 50値を決定するために使用された。 <img alt="図7" fo：コンテンツの幅= &quot;4.75in&quot;のfo：srcは= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg&quot;を &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot; /&gt; 図7：抗リーシュマニア薬スクリーニング（Amophotericin B）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> 図8のためのデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較NTI-リーシュマニア薬スクリーニング（ペンタミジン）。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> 図9抗リーシュマニア薬スクリーニング（Mitefosine）のデジタル画像解析·直接計数アッセイと寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。 IC 50（μg/ ml）の値がExcelfitによって用量応答曲線から計算した。<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2">試験薬物</td><td colspan="2"> 24時間</td><td colspan="2"> 48時間</td><td colspan="2"> 72時間</td><td colspan="2"> 96時間</td></tr><tr><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td><td> IACA B </td><td> PRTA C </td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td> 0.24±0.03 </td><td> 0.17±0.01 * </td><td> 0.12±0.04 </td><td> 0.20±0.07 </td><td> 0.06±0.01 </td><td> 0.06±0.01 </td><td> 0.11±0.03 </td><td> 0.10±0.03 </td></tr><tr><td>ペンタミジン</td><td> &gt; 10 </td><td> 2.55±1.16 * </td><td> 2.88＆PLusmn; 0.58 </td><td> 1.43±0.91 </td><td> 1.24±0.35 </td><td> 1.52±0.16 </td><td> 0.71±0.63 </td><td> 0.98±0.33 </td></tr><tr><td>ミルテフォシン</td><td> 0.38±0.02 </td><td> 0.19±0.08 * </td><td> 0.24±0.06 </td><td> 0.30±0.08 </td><td> 0.36±0.02 </td><td> 0.16±0.06 </td><td> 0.21±0.15 </td><td> 0.17±0.10 </td></tr></tbody></table> 表1デジタル画像解析ダイレクトカウンティングアッセイおよび抗リーシュマニア薬スクリーニングのための寄生レスキュー変態アッセイの比較。感染したマクロファージは、異なる期間の標準的な抗リーシュマニア薬の異なる濃度で処理した。値がExcelfit（ 図7-9）により用量応答曲線から計算したIC 50（μg/ ml）の時間後に薬物治療; ます b IACA =画像解析と直接計数アッセイ; C PRTA =寄生のRescue and形質転換試験。与えられた値は、μg/ mlのようにIC 50（寄生虫成長の50％阻害を引き起こす薬物の濃度）であり、少なくとも3つの実験の平均値±SDである。 * IACAとIC 50値と比較して（&lt;0.05）は統計学的に異なる。

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A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

感染THP1細胞と寄生虫の救助や変態アッセイ<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em&gt;ドノバンリーシュマニア</em&gt;抗リーシュマニア薬スクリーニングのために最適化されています。アッセイはTHP1細胞、前鞭感染、被験薬は、感染したマクロファージの制御された溶解、無鞭毛の救助、前鞭と蛍光分析によるモニタリング前鞭毛の成長と増殖への変換を用いた治療の分化を伴う。

細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em&gt;ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における&gt;無鞭毛

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

22.1K ビュー.  University of Mississippi. 感染THP1細胞と寄生虫の救助や変態アッセイ in vitroでとドノバンリーシュマニア抗リーシュマニア薬スクリーニングのために最適化されています。アッセイはTHP1細胞、前鞭感染、被験薬は、感染したマクロファージの制御された溶解、無鞭毛の救助、前鞭と蛍光分析によるモニタリング前鞭毛の成長と増殖への変換を用いた治療の分...

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Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

ハムスターの背部皮膚における皮膚リーシュマニア症：Antileishmanial薬剤のスクリーニングのための有用なモデル

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

免疫・感染学

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

ゼブラフィッシュのMyc誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病における側方集団の単離

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...