リーシュマニア感染における食作用に関連するメカニズムは、よくわかっていません。.ここでは、宿主細胞へのリーシュマニア相互作用中の硬化の初期状態を評価する方法について説明します。この技術は主な利点として提示され、リーシュマニア食作用の異なる状態およびいくつかのタンパク質の関与の研究を可能にする。
この技術は、細菌、酵母による感染、または他の種類の細胞による飲み込みなど、他の種類の研究にも拡張できることは注目に値します。この技術を試す人々は、Nucleofector溶液への細胞の曝露時間に注意する必要があります。さらに、最大2つのプラスミドを使用してトランスフェクションのテストを開始することをお勧めします。
手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の学生であるアマンダ・レブーカスです。まず、20万個のTHP-1細胞、またはヒト単球由来のマクロファージを、13ミリメートルのガラスカバーガラスを備えた24ウェルプレートに、ウェルあたり500マイクロリットルのRPMIで播種します。5%二酸化炭素下で摂氏37度で24時間インキュベートし、0.9%生理食塩水で細胞を2回洗浄し、完全なRPMI培地で細胞をインキュベートします。
10寄生生物が1宿主細胞比率で細胞にリーシュマニア種の固定期を加え、次いで、摂氏4度で10分間720倍gで遠心分離する。細胞を摂氏4度で5分間インキュベートした後、0.9%生理食塩水で細胞を2回洗浄して、内在化していない前鞭毛虫を除去します。添加したRPMI培地で細胞を摂氏37度で1時間インキュベートした後、細胞を4%PFAで15分間固定します。
次に、好みの封入剤を使用してカバーガラスを取り付けます。次に、蛍光顕微鏡下でランダムフィールド中の少なくとも400個の細胞をカウントします。リーシュマニア誘発PV生合成を調べるには、10ミリリットルの完全RPMI培地(10ミリリットルあたり100ナノグラム/ミリリットルPMA、および50マイクロモルからメルカプトエタノール)を含む75平方センチメートルの組織培養フラスコに1500万個のTHP-1細胞を48時間播種することにより、プラスミドによるTHP-1細胞のトランスフェクションを開始します。
その後、0.9%生理食塩水で細胞を1回洗浄し、非酵素的細胞解離溶液を用いて細胞を剥離する。その後、室温で5分間250倍gで遠心分離する。次に、THP-1細胞を1ミリリットルのRPMI培地に再懸濁し、ノイバウアーチャンバーでカウントを行います。
細胞を再び250倍gで室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄する。200万個の細胞を100マイクロリットルのNucleofector溶液に再懸濁し、蛍光タンパク質でタグ付けされた0.5マイクログラムの目的のタンパク質のプラスミドコーティングとともにインキュベートします。THP-1細胞および核酸を含む懸濁液をヌクレオフェクターキュベットに移す。
次いで、NucleofectorプログラムY1を用いて細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を回収し、13ミリメートルのガラスカバーガラスを含む24ウェルプレート上の500マイクロリットルのRPMI培地にシードします。細胞と完全なRPMI培地を摂氏37度で0.5、2、4、6、12、および24時間インキュベートします。
13ミリメートルのガラスカバーガラスを室温のままにし、取得の少なくとも30分前に光から保護してください。吸収ティッシュでカバーガラスをきれいにします。次に、対物レンズに液浸オイルを一滴加え、スライドを追加します。
オイルがスライドに触れるまで対物レンズを上に動かします。顕微鏡の焦点を観察および調整し、オイルで63倍の対物レンズを選択します。LIQAプログラムを開き、488、552、および405波長のレーザーを調整します。
画像の解像度を 1024 x 1024 として選択します。ライブボタンをクリックした後、Zスタックを設定し、開始オプションを押します。画像の取得を待ってから、ツールで最大投影オプションを選択します。
実験を保存し、TIFF 形式の画像をコンピューターにエクスポートします。結果は、リーシュマニア・ブラジリアンシスLCLとリーシュマニア・ブラジルリエンシスDLの両方が同様にマクロファージに結合することを示しました。また、宿主細胞によるリーシュマニア・ブラジリアンシスLCLおよびリーシュマニア・ブラジルジエンシスDL貪食に関しても差は認められなかった。
Leishmania Braziliensis LCLまたはLeishmania Braziliensis DLによって誘導された寄生性液胞(PV)へのLC3の動員を感染細胞で比較した。感染の4時間後、リーシュマニアブラジル人LCLおよびリーシュマニアブラジル人DL感染マクロファージにおいて、LC3で装飾されたPVの同様の割合が観察されました。したがって、結果は、リーシュマニアブラジルエンシスLCLおよびリーシュマニアブラジルエンシスDLが、LC3リクルートに関するPVの結合、食作用、および生合成中に同様にマクロファージと相互作用することを示しました。
代表的な顕微鏡画像は、PLC-GFP、Rab5-GFP、Rab7-GFPプラスミドを用いたTHP-1細胞の効率的なトランスフェクションを示しました。このプロトコルを試す人々は、温度インキュベーションに注意を払い、顕微鏡サンプルを光、すべてのタイプから保護する必要があります。リーシュマニア食作用を引き起こす同定されたタンパク質の発現を調節することは、リーシュマニア感染の結果におけるこれらのタンパク質の重要性を実証する。
この手法を、治療戦略の開発のための寄生虫の確立と標的同定に関連するさまざまなタイプの病理学研究とメカニズムに拡張することができます。
