この作品は、yaは博士号を取得する前のフェローシップ（EDK）、NARSAD若手研究者賞（DK）とNIMHブレインズ賞（R01MH087495）（DK）をCIRMサポートされていました。

麻酔および鎮痛：30分麻酔の前には、鎮痛のために0.05 mg / kgを皮下ブプレノルフィンとラットを注入します。 30から40 mg / kgを腹腔内ペントバルビタールナトリウムで麻酔を開始します。この時点で、また（2 mg / kgを皮下投与）、さらに鎮痛薬として呼吸不全（0.4 mg / kg体重、皮下）とメロキシカムを防ぐためにアトロピンを注入します。 5分後、ラットはまだ携帯電話やつま先のピンチに応答する場合は、ラットが痛みに反応するまで、5 mg / kg体重（腹腔内）にペントバルビタールナトリウムのその後の用量を与える。最初の切開を行う前に、局所麻酔のための切開部位にリドカイン（5 mg / kgで、皮内）注射する。最初の注射後6〜8時間、鎮痛のために0.05 mg / kgを皮下ブプレノルフィンとラットを注入します。必要に応じて、これは通常は必要ありませんがブプレノルフィンは、6〜8時間ごと、その後注入することができます。 麻酔cのその他のフォームを注意することが重要です。興奮毒性病変の妨げになります。ケタミンは、げっ歯類の麻酔の一般的に使用される形式ですが、それはNMDA受容体拮抗薬であるため、たとえば、それは、NMDAで誘発される病変を妨げる可能性があります。病変のサイズを減らすことはありません誘導麻酔の方法を選択することが重要です。ガス麻酔が必要な場合は、ここで説明されたものを含め、ほとんどの定位装置は、ガスマスクアダプタを収容することができます。 注：資料は以下の特定の試薬 ​​や機器の表で詳しく説明されています。 1。ポンプとStereotaxの準備<ol><li>滅菌水で10μlのハミルトンシリンジを記入し、6シリンジポンプ、プログラマブルのキャディーにそれをマウントします。ポンプのクランプホルダーにシリンジのプランジャーの端を固定します。 </li><li>プレフィル針と1 mlのシリンジを用いて滅菌水でPE20チューブをガス滅菌。ケアされて、ハミルトンシリンジへのチューブの開放端をスライドさせチューブ内の気泡を避けるために、FUL。 </li><li>バレルスタイルの電極マニピュレータを用いた定位装置のアームへのチューブの30ga、フラットカット、1インチの注入針の端をクランプします。クランプと溝バレルの間に注入針を挿入します。チューブを平坦化し、流体の流れを制限することを避けるために、その中に金属針を含むチューブの部分上にクランプを固定します。 </li><li> &gt; 5μL/ minにポンプ速度を調整し、ポンプの電源をオンにします。水のビーズは、注入針の先端に表示されます。漏れがないことを確認するチューブの長さとそのジョイントをチェックしてください。 </li><li>滅菌綿棒でビーズに水を拭き取ると撤回するポンプを設定します。 2μlの気泡を取り消すことができます。バブルの上部には、チューブに表示されます。 </li><li>滅菌0.1M PBSでNMDAの20 mg / mlの溶液中での注入針の先端を浸しと4-5μlを撤回することができる。気泡は、滅菌水およびNMDA溶液との間表示されるはず先端インチそれは、NMDAは強力な神経毒であり、注意が、この溶液の調製と処理に使用されるべきであることに注意する必要があります。手袋および目の保護はすべての回でお勧めします。 </li></ol> 2。定位装置でラットをマウントします。 <ol><li> 図1は、定位装置の基本部分を示しています。耳に目のラインからネズミの頭を剃った後に、ラットの体が培地に設定された加温パッド上に置いて、一口バーの上にラットの前歯をロードします。舌が下顎で、一口バーの下にハングアップする必要があります。可能であれば、温度フィードバック加熱パッドが好ましいであろう。直腸温度を監視することにも理想的でしょう。 </li><li>親指と人​​差し指でラットの首を持って、右耳のバーを右に水平外耳道を移動します。それは固体の場所で休んでいるようなバーが感じるとすれば、はるかに頭の中にシンクしないように。安定した頭部の右側を押し、左耳をスライドさせラットの左横の外耳道にバ​​ーがあります。それは固体の場所で休んでているように感じるべきである。耳介は対称になりますと耳のバーに平らになるように表示されます。上耳介のフレアは、耳バーの不適切な配置を示しています。頭部は首の圧力に反応して揺れないようにしてください。 </li><li>鼻のバーを下にネジ止めします。穏やかである。鼻の骨は繊細で、鼻のバーがタイトである必要はありません。ラットが進む前に、まだ麻酔であることを確認します。 </li></ol> 3。手術のためのラットを準備する<ol><li>滅菌綿棒を使用して、静かに乾燥させると破片からそれらを保護するために、ラットの目の各々に獣医眼科潤滑軟膏の少量を置きます。 </li><li>同心円状に剃った領域のエッジに計画された切開部位から、2％クロルヘキシジン溶液を用いてラットの頭皮を拭く70％エタノールで三回続いた。より効果的な消毒が必要な場合はクロルヘキシジンスクラブを使用することもできます。10％ポビドンヨード液で拭いて終了します。準備された頭皮は無菌であり、唯一の滅菌材料で触れなければならない。 </li><li>さらにステップのドン滅菌手袋には、次の準備手術部位を扱いますので。 </li><li>開窓術は、手術部位を公開するように滅菌ドレープを配置します。 </li></ol> 4。外科ウィンドウの作成<ol><li> ＃10手術用メスの刃を使用して、頭皮の長手方向の中心線に沿って切開（長さ約2cm）を作る。切開は、目のラインより後方に開始する必要があります。非利き手の親指と人差し指で、切開の方向にテンション垂直で頭皮を保持します。 </li><li>滅菌した綿のヒントを使用して手術部位の端に頭蓋骨の表面を覆う筋膜を引き出します。それが表示できるように頭蓋骨をクリアするためにいくつかの力がかかります。 </li><li>手術のウィンドウを作成するために4つの湾曲した、滅菌hemostatsを使用しています。 EAのクランプ筋膜（NOT皮膚）その後CHの切開の前部と後部の側面の側面と、それによってオープン切開を引っ張って、完全に頭蓋骨を露出し、動物と一緒にクランプを置く。 </li></ol> 5。スカルを平準化し、パイロットホールを作成する<ol><li>ブレグマ、 図2に示すように頭蓋骨の3つの主要なプレートは、会う前のポイントを見つけます。針の先端がちょうどブレグマで頭蓋骨に触れるように点滴の針を移動します。背腹軸の座標に注意してください。 図3は、Stoelting定位デバイス上の座標を読み取る方法を示しています。 （注）この時点で、手袋は、もはや無菌でありません。また、直接無菌手術部位に触れるべきではありません。注意：非無菌定位装置に触れた後、外科医は、もはや無菌ではないと手術部位や手術部位に触れる機器の部品に触れないようにしてください。 </li><li> depicteとしてラムダ、頭蓋骨の3つの主要なプレートが満たす事後ポイントを見つけます。図2のd。少し点滴の針を上げ、ラムダにまっすぐに移動します。それだけでラムダで頭蓋骨に触れるまで針を下ろします。背腹軸の座標を読み取ります。頭蓋骨レベルであれば、ブレグマの読み値の0.1 mm以内となります。それがさらにオフこれ以上であれば、（邪魔にならない）針を上に移動し、いずれかの頭の端が再測定して高すぎる、となるに応じて、一口バープラットフォームを上げたり下げ、鼻のバーを緩めます。 </li><li>ブレグマを介して注入針を移動し、前後と内側·外側の座標を記録します。針は、脳アトラス12に従って興味のある脳領域の座標に基づいて移動する必要がありますどこに計算します。 BLAの場合は、前後の座標から2.8ミリメートルを減算し、どちらを左または右をターゲットにするかどうかに応じて内側·外側の座標から/に5.1ミリメートルを追加または減算します。計算された位置に注入針を移動します。 </li><li>旧姓を振るそれが配置された場所を追跡して、接続された無菌の歯科用ドリルビットとドレメルモト·ツールを使用して、その場所に直径の穴約2mmのドリルに注意しながら、邪魔にならないDLE。ドリルが頭蓋骨を突き破るときのように慎重にドリル、それはおそらく硬膜と下に脳組織に損傷を与え、プルダウンする傾向があります。それを拡大するための穴を元通れば。 </li><li>滅菌綿棒で血を吸収します。 </li></ol> 6。神経毒の注入<ol><li>の位置に針バックスイングします。それは脳の表面に触れるまで針を下ろします。背腹軸の座標を記録します。これは、硬膜のレベルです。興味のある脳の領域に到達するために適切な値を減算します。基底外側扁桃体については、6.7ミリメートルを減算します。 </li><li>徐々に計算されたレベルに注入針を下ろします。その後も頭蓋骨の上に、それをバックアップ上げる。ないtに注意しながら、注入針の先端の詰まりを取るためにハミルトンシリンジのクリーニングワイヤーを使用して、非滅菌手袋を注入針に接触する線の端をイタイ。 </li><li> &gt;5μl/分でポンプを実行し、点滴の針から出てくる液体のビーズを参照していることを確認してください。されていない場合は、ワイヤーで詰まりを取る、もう一度やり直してください。 </li><li>徐々に希望の腹側/背側のレベルに点滴の針を下ろします。 </li><li> 0.1μL/ minの注入ポンプの速度を設定し、注入を開始します。 2分間注入する。 </li><li>注入が開始された後、黒のマーカーでチューブ内の空気の泡の両端をマークします。両端が移動しない場合は、針が詰まっています。注入を停止し、ワイヤーで詰まりを取る、針を上げ、再び下げ針、高流量で流れを確認し、もう一度試してください。 </li><li>注入が完了したら、ポンプを停止し、針の先端から離れて拡散するNMDAための5分待ちます。 </li><li>針0.5ミリメートルを上げ、1分間再び注入する。ニードル先端から離れて拡散するNMDA 2.5分待ちます。この余分な注入彼LPSは、BLAのすべての注入で覆われていることを確認してください。これは他の脳領域が必要であるかどうかは、実験的に決定しなければなりません。 </li><li>徐々に脳から針を抜き上げると邪魔に定位腕を振る。 </li></ol> 7。切開を閉じる<ol><li>ドンは、新しい滅菌手袋切開を閉じます。 </li><li>滅菌した綿のヒントを頭蓋骨上に余分な血を拭うと、筋膜からクランプを外します。 </li><li>ロンドンの鉗子を使用して、一緒に切開の両側を押してください。皮膚の内側のエッジが満たしている必要があり、皮膚の外側のエッジは、切開にカールすることを許可すべきではありません。切開閉じたキーを押しながら、しっかりと突起部を閉じるために、創傷クリップを適用します。切開の長さに沿って一緒に皮膚やステープルをプッシュし続けています。これは通常3-5創傷クリップを取ります。 </li><li>すべての創傷クリップを配置した後、それらが安全であることを確認し、再びステープルを挟まないように鉗子を使用しています。より安全なトン彼クリップ切開が治癒される前に、可能性は低く、ラットでは、それらを引き出します。 </li><li>綿棒10パーセントポビドンヨード溶液によるステープル切開とモビリティ（誘導30から45分という閉鎖麻酔、総手術時間が経過した後、通常1〜2時間）が復元されるまで、ホームケージとモニタにラットを返します。この時点では、ラットコロニー室に返されることがあります。一週間後、イソフルラン麻酔下のステープルリムーバーツールを使用してステープルを削除します。 </li><li>次のラットで使用する前に、すべての楽器の先端表面を殺菌するホットビーズ滅菌器を使用しています。楽器は、もはや15秒以上ビーズに浸漬されるべきか、彼らが扱うには余りにも熱くなることがあります。他の動物に使用する前に楽器が完全に冷却されるべきである。 </li></ol> 8。回復<ol><li>それはラットが病変次の日に発作活性を示される可能性があります。このような食料消費やGROとして脳の領域に応じて、破損、その他の動作oming影響を受けることがあります。それは、動物は、彼らがリカバリ時に正常な状態であることを保証するために日常的に監視することが重要です。このような流動食、高カロリーの食品、または追加の鎮痛などの支持療法が必要なことがあります。麻酔による死亡率は5％未満、通常は以下のラットの低い割合で発生します。他の原因による死亡率（感染、出血）は非常にまれである。麻酔の回復後の苦痛の兆候は、将来の研究から除外するために発生しますが、極めて稀である可能性があります。それが期待されるべきであるとして、 図4は、手術後最初の数日間の間に体重減少を示しています。体重は1週間以内に回復する必要があります。 </li></ol> 9。代表的な結果一週間以上のNMDA注入後、病変はクレ紫色対比と明視野顕微鏡を用いて可視化することができます。脳は0.1M PBSとfrozの30％スクロース中で平衡化し、氷冷4％パラホルムアルデヒドで灌流されるべきEN。彼らはその後1:6〜1時12分のシリーズで、30〜60μmでスライスし、標準的なクレシルバイオレットで対比を受ける前に、ゼラチンコートスライドガラスへ取り付ける必要があります。病変は&quot;ハゲスポット&quot;または病変後に細胞死に起因する染色減少クレシルバイオレットの領域に対応する必要があります。 図5AおよびB BLAとCEAの代表的な病変を示しています。この画像は、高解像度スキャン（1200 dpi）のフラットベッドスキャナを使用して得られた。病変を可視化するためには、見当違いの病変が存在することができるようにターゲット領域を周囲の組織の多くによってセクションのシリーズを対比染色するのに役立ちます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> 図1。定位セットアップ。この図は、ラベルに関連する部分を持つラットの定位を示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> 図2。ラットSKUにブレグマとラムダでしょう。この図は、ブレグマとラムダの位置を示しています。すべての座標はブレグマを基準にして測定されています。ラムダは、頭蓋骨が水平になっていることを確認するために使用されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> 図3。定位座標を読み込んでいます。この図面は、標準的な定位読みを示しています。小数点の左側の桁を取得するには、右側のマーカーを使用しています。ラベルの数字は、十の位（= 10、2 = 20すなわち、1）に対応しています。ラベルの数字の間にハッシュマークは、単一の単位（1-9）に対応しています。ゼロの行は、stereotaxが設定されているものを整数で示します。ここで、ゼロの行は読み取りが10と11の間であることを示す、10と11のマ​​ーカーの間にあります。小数点の右側にある番号を確認するには、左側にマーカーを使用しています。左のハッシュマークは1単位の差を表すそれぞれのラベルが付いていないハッシュで、0から10までの番号が付けられていますその隣のもの。右側にあるハッシュマークで最高のアップ左ライン上のハッシュマークのいずれかは、座標の読みの最初の小数点以下の桁数を示しています。ここで、番号右側のハッシュマーク（＃）で最高の最大9行に左に対応するのハッシュマークは、小数点以下の桁数は9ですので。最後の読書は10.9 mmである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> 図4。手術後の体重の変化はこのグラフは、定位手術を受けたラット（n = 17）の平均（±SEM）の重量を示していますか（n = 6）の手術を持っていませんでした。 0日目は、手術の日です。手術後、ラットの体重は手術後2〜3日で減少し、一日5から6の周りに増加した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> 図5。興奮毒性病変の例）この画像は&quot;ハゲと30μmの冠状スライス上クレシルバイオレットの対比を示しています。基底外側扁桃体のNMDA病変からスポット &quot;。白い矢印は病変の概要を説明します。それはない病変を持っていない脳スライスの反対側と比較することができます。中心核扁桃体のB）同様の病変。

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	<li>Kirby, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+amygdala+regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+and+fear-related+activation+of+newborn+neurons.">Basolateral amygdala regulation of adult hippocampal neurogenesis and fear-related activation of newborn neurons.</a> Mol. Psychiatry. , (2011).</li><li>Goosens, K. A., Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextual+and+auditory+fear+conditioning+are+mediated+by+the+lateral,+basal,+and+central+amygdaloid+nuclei+in+rats.">Contextual and auditory fear conditioning are mediated by the lateral, basal, and central amygdaloid nuclei in rats.</a> Learn Mem. 8, 148-155 (2001).</li><li>Korz, V., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+modulation+of+hippocampal+long-term+potentiation+under+stress+and+no-stress+conditions+in+basolateral+amygdala-lesioned+and+intact+rats.">Bidirectional modulation of hippocampal long-term potentiation under stress and no-stress conditions in basolateral amygdala-lesioned and intact rats.</a> J. Neurosci. 25, 7393-7400 (2005).</li><li>Bhatnagar, S., Vining, C., Denski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chronic+stress-induced+changes+in+hypothalamic-pituitary-adrenal+activity+by+basolateral+amygdala.">Regulation of chronic stress-induced changes in hypothalamic-pituitary-adrenal activity by basolateral amygdala.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1032, 315-319 (2004).</li><li>Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+hippocampal+long-term+potentiation+in+basolateral+amygdala-lesioned+rats.">Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats.</a> Brain Res. 656, 157-164 (1994).</li><li>Ikegaya, Y., Saito, H., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basomedial+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+contribute+to+the+induction+of+long-term+potentiation+in+the+dentate+gyrus+in+vivo.">The basomedial and basolateral amygdaloid nuclei contribute to the induction of long-term potentiation in the dentate gyrus in vivo.</a> Eur. J. Neurosci. 8, 1833-1839 (1996).</li><li>Carter, R. N., Pinnock, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+amgdala+lesions+block+the+memory-enhancing+effect+of+8-Br-cAMP+infused+into+the+entorhinal+cortex+of+rats+after+training.">Basolateral amgdala lesions block the memory-enhancing effect of 8-Br-cAMP infused into the entorhinal cortex of rats after training.</a> Eur. J. Neurosci. 15, 905-910 (2002).</li><li>Roozendaal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+memory+consolidation+depend+on+functional+interactions+between+the+medial+prefrontal+cortex+and+basolateral+amygdala.">Glucocorticoid effects on memory consolidation depend on functional interactions between the medial prefrontal cortex and basolateral amygdala.</a> J. 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利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介する定位方法は、NMDAの注入を介して、特定の脳領域の興奮毒性病変を可能にします。基本的な定位の方法は、サイト固有の方法で薬理学的および生物学的な種々の薬剤を注入するために適応させることができます。また、脳アトラス12の彼らの定位座標で定義されている脳の領域の様々なターゲットに適合させることができます。マウスなど他の種への適応は、より小さ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> N-メチル-D-アスパラギン酸98パーセント</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td>デュアルラボ標準定位w/45度。耳バー</td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td>別のベンダー：Kopfは注意の*注：複数のベンダーから購入する場合は、定位アクセサリーの互換性を保証</td></tr><tr><td> 10μlのSYR SPECIAL（* / * / *） </td><td>ハミルトン</td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td>ドレメル元麻布ツール</td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td>別のベンダー：Kopfは</td></tr><tr><td>カーバイドバリ、ハンドピースHP、サイズ2 </td><td>シャイン歯科</td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> 6シリンジプログラムをStoeltingプログラマブルポンプ</td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td>別のベンダー：Kopfは</td></tr><tr><td>ステンレス鋼316皮下正規ウォールチューブ30ゲージ0.0123 &quot;外径×0.00625&quot;内径x 0.003 &quot;ウォール（注入針） </td><td>スモールパーツ</td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20チューブ（点滴チューブ） </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td>反射クリップ、9mmの、非滅菌</td><td>ケントサイエンティフィック株式会社</td><td> INS500346 </td><td>別のベンダー：ファイン科学ツール</td></tr><tr><td> 9ミリメートルクリップの反射クリップアプライヤ</td><td>ケントサイエンティフィック株式会社</td><td> 12031から09 </td><td>別のベンダー：ファイン科学ツール</td></tr><tr><td>湾曲したハートマンの止血剤</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13003から10 </td><td></td></tr><tr><td>ロンドン鉗子</td><td>ファインSceinceツール</td><td> 11080から02 </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 2％クロルヘキシジン液</td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td>別のベンダー：PetSolutions </td></tr><tr><td> 10％ポビドンヨード液</td><td> CVS </td><td> SKU＃739575 </td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>ハーバード装置</td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1特定の試薬 ​​や機器の表。

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

げっ歯類及びヒトを含む哺乳動物、の多くの行動の関数は、離散的な脳の領域によって主に媒介される。動作や他の実験成果のための様々な脳領域の肥えた関数の一般的な方法は、関数の局所アブレーションを実装することです。ヒトでは、ローカライズされた脳病変を有する患者集団は、多くの場合、損傷部位の基本的な機能を明らかにすることを期待して、赤字のために研究を行っている。げっ歯類で、一つは実験的に特定の脳領域の病変を誘発することができる。 病変は、いくつかの方法で達成することができます。電解病変は、局部的な損傷を引き起こす可能性がありますが、種々の細胞型と同様に病変部位の近くに起こる他の脳領域からの横断繊維を損傷します。細胞型特異的プロモーターを用いた遺伝学的手法は、サイト固有のターゲットを有効にすることができます誘導。これらの手法は、ターゲットの脳領域に応じて複雑で、常に実用的ではありません。 Excitot定位手術を用いた有酸素病変は対照的に、地元のグリア細胞に損傷を与えたり、繊維を通過することなく、興奮性ニューロンをlesioningの中で最も信頼性の高い実用的な方法の一つである。 ここでは、興奮性毒、基底扁桃体複合体にN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）、定位注入するためのプロトコルを提示します。解剖学的指標を用いて、我々はターゲットの脳領域の位置を決定し、ちょうどターゲット上記の場所に注射針を下げるために定位座標を適用します。その後、近くのニューロンの興奮毒性死、その結果、脳に我々の興奮性毒を注入する。選択した我々の実験対象はラットですが、同じ方法は、機器や座標の適切な調整を、他の哺乳動物に適用することができます。 このメソッドは、基底扁桃1-6、他の扁桃核6、7、海馬8、耳鼻咽喉科など、脳の領域の様々に使用することができますorhinal皮質9と前頭前皮質10。また、そのようなウイルスベクター1、11のような生物学的化合物を注入するために使用することができます。基本的な定位技術はまた、目的の化合物より長期の暴露を可能にする、より恒久的な浸透圧ポンプの注入に適応することができます。

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

定位座標を使用して、興奮性毒を注入することにより、特定の脳領域の対象とアブレーション（s）は記載されています。この手法はまた、ラット脳内に他の化学物質の注入に適応することができます。

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

stereotaxic-surgery-for-excitotoxic-lesion-specific-brain-areas-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.3K ビュー.  University of California Berkeley. 定位座標を使用して、興奮性毒を注入することにより、特定の脳領域の対象とアブレーション（s）は記載されています。この手法はまた、ラット脳内に他の化学物質の注入に適応することができます。

ビデオ: Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

行動神経科学のための齧歯類定位手術と動物福祉のアウトカムの改善

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

神経科学

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are valuable tools to understand the neural mechanisms involved in locomotor recovery after SCI and to design therapies for clinical populations. There are several experimental SCI models including contusion, compression, and transection injuries that are used in a wide variety of species. A hemisection involves the unilateral transection of the spinal cord and disrupts all ascending and descending tracts on one side only. Spinal hemisection produces a highly selective and reproducible injury in comparison to contusion or compression techniques that is useful for investigating neural plasticity in spared and damaged pathways associated with functional recovery. We present a detailed step-by-step protocol for performing a thoracic hemisection at the T8 vertebral level in the rat that results in an initial paralysis of the hindlimb on the side of the lesion with graded spontaneous recovery of locomotor function over several weeks. We also provide a locomotor scoring protocol to assess functional recovery in the open-field. The locomotor assessment provides a linear recovery profile and can be performed both early and repeatedly after injury in order to accurately screen animals for appropriate time points in which to conduct more specialized behavioral testing. The hemisection technique presented can be readily adapted to other transection models and species, and the locomotor assessment can be used in a variety of SCI and other injury models to score locomotor function.

The rat thoracic spinal hemisection is a valuable and reproducible model of unilateral spinal cord injury to investigate the neural mechanisms of locomotor recovery and treatment efficacy. This article includes a detailed step-by-step guide to perform the hemisection procedure and to assess locomotor performance in an open-field arena.

ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...