この作品は、NIHの/ NIBIB助成R00 EB009105（NFS）とP30-EB011317 NFS（へ）、NIHの/ NIBIB訓練助成T32 EB007509（AMW）に、ケース·ウェスタン·リザーブ大学学際アライアンス·インベストメント·グラント（NFSへ）によってサポートされていましたとケース総合がんセンター助成P30 CA043703（NFS）である。我々は、彼らのためにシュタインメッツラボ学部生の研究者に感謝ハンズオンサポート：ナディア唱、ケビン·チェン、ソウラヴ（SID）Deyさん、アリスヤン、サムアレクサンダー、クレイグD&#39;クルス、だからスティーブン鷺、ローレンランドルフ、ブライアン、ポールChariou 。

1。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）伝搬<ol><li>一日の15時間（100％の光、25℃、65％湿度）と夜の9時間（0％光、22℃、60％湿度）に屋内植物室制御を設定します。 </li><li> 表1のタイムラインによると、植物に接種する。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX、TMV、とBMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> 0日目：植物3ササゲ種子/ポット。 </td><td> 0日目：植物〜30 N. benthamianaの種/ポット。大さじ1肥料/ 5リットルの水で週に一度受精。 </td></tr><tr><td> 14日目：1工場/ポットで再ポットN. benthamianaの。 </td></tr><tr><td> 10日目：感染は、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりCPMV（5μg/50μL/葉）を使用してプライマリ·紅葉。 </td><td> 28日目：3〜fを感染IVEは、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりPVX、TMV、またはBMV（5μg/50μL/葉）の葉。 </td></tr><tr><td> 20日目：収穫の葉や店舗-80℃である。 </td><td> 42日：収穫の葉や店舗-80℃である。 </td></tr></tbody></table> 、成長して感染し、葉を収穫するための表1。タイムライン。 注：のみCPMV伝播が例として示されている。 2。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）精製 注：すべてのステップは氷上または4で行われる℃の<ol><li> （ 表2参照）冷緩衝液の2倍量を使用して標準的なブレンダーで冷凍葉の100グラムをホモジナイズする。寒冷紗の2-3層を介してフィルタリングします。 </li><li> PVXの場合、1M HClを用いてpHを6.5に調整してください。 0.2％（w / v）のアスコルビン酸および0.2％（w / v）のナトリウムsulfiを追加TE。 </li><li> 20分間5500 xgで粗製植物ホモジネートを遠心分離します。上清を収集します。 </li><li> BMVのため、層の10％（w / v）スクロース溶液5ml上清の25ミリリットル。 3時間と38.5パーセントのCsCl溶液（w / v）に再懸濁しペレット9000×gで遠心分離します。 5時間振とうして混合し、次にステップ2.12に進みます。 </li><li> 1:1（v / v）のクロロホルム:1-ブタノール0.7ボリュームを追加することで、植物材料を抽出します。 30-60分間混合物をかき混ぜる。 </li><li> 20分間5500 xgでソリューションを遠心分離します。上部の水相を回収します。 </li><li> PEG（分子量8000）、0.2MのNaClを追加して8％（w / v）である。 TMVは、1％（v / v）トリトンX-100を追加することも。少なくとも1時間撹拌し、少なくとも1時間放置します。 </li><li> 15分間、15,000×gでソリューションを遠心分離します。緩衝液10mlでペレットを再懸濁します。 PVXについては、0.5メートルに0.1％β-メルカプトエタノール及び尿素を追加</li><li> 30分間8000 xgで遠心し、上清を集める。 </li><li> 3時間16万xgで上清を超遠心。 5ミリリットルOバッファでペレットを再懸濁しvernight。 </li><li>バッファの10％、20％、30％、および40％スクロース（最も重い第一）の等量を使用して10から40パーセントショ糖勾配を準備します。勾配は室温で一晩平衡化させます。 </li><li>超遠心機は、2時間（BMVのため24時間）を100,000 xgで、ショ糖勾配上にペレットを再懸濁した。 </li><li>光散乱バンドを収集し、緩衝液に対して透析する。 </li><li> 4時にVNPs（下）と店舗を特徴付ける℃に長期保存には、-80℃で保存し</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMVおよびTMV </td><td> 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 38.5 mMのKH 2 PO 4 61.5 mMのK 2 HPO 4、 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0.5 Mホウ酸緩衝液（pH7.8） 0.5Mのホウ酸 NaOHを用いてpHを調整</td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA緩衝液（pH4.5） 250 mM酢酸ナトリウム 10mMのMgCl 2 2 mMのβ-メルカプトエタノール（新鮮追加） </td></tr></tbody></table> 表2各VNP用のバッファーとそのレシピ。 注：のみCPMV伝播が例として示されている。 3。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）キャラ<ol><li> VNPsの濃度を決定するために、UV /可視分光法を実行します。 <ol><li>光度計、分光光度計を使用してサンプルを2μlの吸光度を測定します。 </li><li>ランベルト·ベールの法則を用いて粒子と色素の濃度を測定（吸光度=εcl、εは吸光係数、cは濃度、lはパスの長さです。）パスの長さは光度は0.1 cmです。 VNP固有の吸光係数は、次のとおりです。 CPMV：8.1 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） PVX：2.97 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） TMV：3.0 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） BMV：5.15 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） </li></ol></li><li>サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）によって粒子を分析します。 <ol><li>スーパーロース6サイズ排除カラムとÄKTAエクスプローラー、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）200μl中VNPsの負荷50から100μgを用いた。 </li><li> 260 nmの（核酸）、280 nmの（タンパク質）、および接続された任意の色素の励起波長に検出器を設定します。 </li><li> 72分間、0.5ml /分の流速で実行します。 </li><li>溶出プロファイルとA260：A280 nmはVNPの準備が純粋であるかどうか、および粒子が無傷で組み立てられているかどうかを示します。 以下A260：280比率は純粋VNPの準備を示します： CPMV：1.8±0.1 PVX：1.2±0.1 TMV：1.1±0.1 BMV：1.7±0.1 </li></ol></li><li>個々のコートタンパク質への準備と共役の純度を分析する（プレキャストNuPAGE）変性ビス - トリスアクリルアミド4-12％勾配ゲル電気泳動を行います。 <ol><li>リン酸カリウム緩衝液9μlの中の粒子の10μgを4倍LDSサンプルバッファーの3ミリリットルを追加します。ジスルフィド結合の高い数を減らすためのbmv 4X LDSサンプルバッファーおよびβ-メル​​カプトエタノールを3μlの追加の1μlを添加する。 </li><li> 100℃で5分間熱ブロックでインキュベート℃、 </li><li> SDSゲルにサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファー1X MOPSで1時間、200Vでサンプルを実行します。 </li><li>蛍光コートタンパク質を可視化するためにUV光下でゲルを文書化します。 </li><li>非蛍光性タンパク質は、1時間クーマシーブルー（0.25％（w / v）をクーマシーブリリアントブルーR-250、30％（v / v）メタノール、10％（v / v）の酢酸）で染色。 </li><li>一晩30％メタノール、10％酢酸で脱色。チャン必要であればGEはソリューションを提供します。 </li><li>白色光の下でゲルを文書化します。 </li></ol></li><li>透過型電子顕微鏡（TEM）により粒子の整合性を分析します。 <ol><li> DI水20μlに0.1から1 mg / mlに試料を希釈します。 </li><li>パラフィルム上のサンプルの20μlの水滴を置きます。 </li><li> TEMグリッドでドロップをカバーし、2分間放置します。ろ紙でグリッド上の余分な溶液をオフウィック。 </li><li>乾いたウィッキングその後DI水の降下に配置することにより、グリッドを洗ってください。 </li><li> 2パーセント20μlのドロップ（w / v）の2分間酢酸ウラニルに配置することにより、グリッドを染色。ろ紙汚れ過剰をオフウィック。 </li><li>もう一度水でグリッドを洗う。 </li><li>透過型電子顕微鏡下のグリッドを観察します。 </li></ol></li></ol> 4。 PEGおよびフルオロフォア、精製とキャラクタリゼーションとVNPsの化学的結合<ol><li>下記の反応のための計算の場合は、VNPsのモル質量は以下のとおりです。 CPMV：5.6×10 6 g / molで PVX：35×10 6 g / molで TMV：41×10 6 g / molで BMV：4.6×10 6グラム/モル</li><li>ワンステップN-ヒドロキシスクシンカップリング反応を用いたCPMVおよびPVXの表面リジンに染料とPEGコンジュゲート：のAlexa Fluor 647、スクシンイミジルエステルの2500モル当量（全モル過剰がVNPあたりモル過剰を参照してください）との4500同等追加NHSを- PEG（分子量5000）は、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液中でCPMVをDMSOに溶解した。 PVXで作業する場合、NHS-染料とNHS-PEGの万モル過剰を追加します。 CPMVおよびPVXの最終濃度が2 mg / mlとし、DMSO含有量となるようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。光から保護し、室温で一晩反応混合物をインキュベートする。 CPMVおよびPVXは、それぞれ300と1270にアドレス指定リジンを持っています。 （ 読者は上のさらなる読書のための以下の参照と呼ばれますCPMVおよびPVXの化学修飾：13-15）。 </li><li>ジアゾニウムカップリングによるTMVのチロシンと共役染料およびPEGが銅（I）触媒によるアジド - アルキン環が続く。 <ol><li> 0.3Mのp-トルエンスルホン酸一水和物、3.0 Mの亜硝酸ナトリウムを25μl、及び0.68Mの蒸留1時間4℃でアセトニトリルに溶解した3 - ethynylaniline75μlの400μlの混合することによりジアゾニウム塩（アルキン）を準備します。 </li><li> TMVの1.25ミリリットル（20 mg / mlの原液）のNaClを100mMを含むホウ酸塩緩衝液、pH 8.8の3.3ミリリットルを追加します。 </li><li>ジアゾニウム結合によってTMVにアルキンライゲーションハンドルを追加するには3時間、氷浴中でジアゾニウム塩（アルキン）溶液450μlで、TMVに反応する。解決策は、薄茶色に変わります。 TMVは抱合のための2140利用可能なチロシンを持っています。 </li><li>ステップ4.4で説明されるようにショ糖クッションを使用して最終生成物を精製する。 </li><li>アジド官能のAlexa Fluor 647及びPEG-アジド（MW 5000）usinを​​取り付けグラム銅（I）触媒によるアジド - アルキン環化（CuAAC）。 1mMのCuSO 4を 、2mMのAMGは、15分間室温で2mMのアスコルビン酸ナトリウムとコートタンパク質とインキュベート当たり染料およびPEG-アジド2当量を追加します。 TMVの最終反応濃度が2 mg / mlとなるようなバッファの音量を調整します。 （：16,17読者はTMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。 </li></ol></li><li>リジンとBMVシステイン変異体（cBMV）のシステインにPEGに染料を結合さ： <ol><li> 0.1MのTNKM緩衝液（50mMトリス塩基、50mMのNaCl、10mMのKCl、5mMのMgCl 2、pH7.4）にcBMVにDMSOに溶解オレゴングリーン488、スクシンイミジルエステルの2000モル当量を追加します。 BMVの最終濃度が1 mg / mlおよびDMSOのコンテンツであることそのようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。 4℃で一晩反応混合物をインキュベート℃で光から保護。 </li><li>遠心を使って浄化する粒子ステップ4.4で説明されるようにフーガのフィルタ。 </li><li>前と同じ反応条件を用いてPEG-マレイミド（MW 2000）の2000モル過剰を追加し、4℃で2時間反応混合物をインキュベート℃にcBMVは180反応性リジン及びシステインを持っています。 （：18読者はBMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。 </li></ol></li><li> 精製：2.5時間16万xgで40％（w / v）ショ糖クッションを通して溶液を渡します。バッファーでペレットを再溶解。あるいは、10kDaのカットオフスピンフィルターを使用して、適切な緩衝液に対して透析する。 </li><li> キャラクタリゼーション：UV /可視分光法、SDSゲル電気泳動、FPLC、およびTEM（ 図示されていない、しかし、 図6と図7を参照してください ）：PEG化および蛍光標識VNPsは、上述した方法を用いて分析されています。 </li></ol> 5。マウス異種移植モデルを用いて腫瘍標的とイメージング<ol><li>文化HT-29ヒト結腸癌細胞をRPMI培地で5％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充し、37℃で1％L-グルタミン℃、5％のCOのC 2 175cm 2の細胞培養フラスコを使用しています。 </li><li> 5分間37℃でトリプシン-EDTA 5mlでインキュベートすることにより、滅菌PBSと収穫で細胞を2回洗浄します。 RPMI培地5mlのトリプシンを不活性化する。 5分間、500×gで遠心分離して細胞を回収する。 5×10 6 cells/50μlの培地（トリパンブルーおよび血球計数器を用いて総細胞数を決定）で新鮮なRPMI中で4℃で再懸濁します。注射（すべてのソリューションおよび試薬は無菌に保つ）に先立ってマトリゲルの等量で混ぜます。 </li><li>調達6週齢のNCR nu / nuマウス、2週間アルファルファフリーダイエットでそれらを維持する。 [注：すべての動物の動物実験委員会の手続きが承認されなければならない。]無菌の18 1/2ゲージを用いて脇腹に5×10 6 cells/100μL/腫瘍（2腫瘍/マウス）の皮下注射による腫瘍異種移植片を誘導針。定期的に動物を監視します。ノギスを用いて腫瘍の大きさを測定し、腫瘍が20ミリメートル3（今後12日以内）の平均体積にまで成長することができます。 PBSおよびVNP（N = 3匹/群/時点）：ランダムに二つのグループにマウスを割り当てる。 1ミリリットル28ゲージインスリン注射器を用いて、静脈内の滅菌PBS尾静脈注射を100μlまたは10 mg / kgのVNP製剤によって管理します。 </li></ol> 注：生きた動物を用いて組織培養実験と研究が実証されることはありません。ハンズオンデモが組織の処理とデータ取得に制限されます。 HT-29腫瘍の異種移植モデルで参照するために、読者はrefに呼ばれています19 3つの手法がVNPsのホーミング腫瘍を評価するために使用されています： <ol start="4"><li> CO 2を使用して、異なる時間点（2、24、および72時間）で生け贄マウス：マエストロイメージングシステムを用いた蛍光イメージングガス。脇腹に腫瘍と一緒に動物や消費税、すべての主要な臓器（脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）解剖、パラフィルム上にティッシュを置いて、（800ミリ黄色励起および発光フィルターを用いた蛍光イメージング装置で分析組織における蛍光シグナル（VNPsに共役A647ラベル由来）の存在を検出するための露光）。画像を保存すると、ImageJ 1.44oソフトウェア（使用して蛍光強度を分析<a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ）。時間は他の主要な組織と腫瘍におけるVNPsの取り込みのパターンを比較してください。 </li><li>撮影後、半分に各組織を切断し、凍結切片および共焦点解析用OCTコンパウンドで半分を埋め込む。予め秤量したクライオバイアル内の他の半分を収集し、直ちにそれらを液体N 2を使用してフリーズ。 -80℃で保存さらなる処理のための準備が整うまでは、C。 </li><li> 蛍光定量：再コー​​ドは、組織の重みを。室温で凍結組織を解凍し、1mlのPBSを含む別々の50mlのFalconチューブの中に置いてください。ハンドヘルド組織ホモジナイザーを用いて、PBS中で2〜3分間組織をホモジナイズ後、マイクロチューブにホモジネートを転送します。非均質化された組織を除去するために13000×gで10分間ホモジネートを遠心分離します。 </li><li> 384ウェル黒色のUVプレートに各グループ（PBSおよびVNP製剤/時点）から組織からの上清をピペットで100μL添加します。プレートリーダーを用いて蛍光強度（励起/ EM波長665分の600）を評価します。組織重量によって得られた蛍光値を正規化します。 </li><li> 免疫組織化学：-20℃で凍結ミクロトーム切片（10μm）とストアを準備細胞核（DAPI）および内皮細胞マーカー（FITC標識抗マウスCD31抗体）の組織切片を染色します。蛍光標識VNPの血管および腫瘍内局在をマッピングする共焦点顕微鏡分析を行うsである。 </li></ol> 注：この手順は、実証されませんが、代表的なデータは、図8に示されている。免疫組織化学上の基準及び記載の染色法について、読者はrefに呼ばれています19

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	<li>Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPERdb2:+an+enhanced+and+web+API+enabled+relational+database+for+structural+virology.">VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology.</a> Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).</li><li>Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+of+engineering+viral+nanoparticles.">The art of engineering viral nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).</li><li>Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting.">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li><li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X.">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li><li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus.">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、in vivoでの腫瘍イメージングのためのVNPsとその応用の化学修飾のためのアプローチを提供します。ここで紹介する動物蛍光イメージング、蛍光定量、および免疫組織化学の技術は生体内分布を研究し、腫瘍がホーミング評価するのに役立ちます。これらの技法は、EPR効果による腫瘍へのナノ粒子のアクセスに関する貴重な情報を提供します。種々の分析方法?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VNP production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indoor plant chamber</td>
			<td>Percival Scientific</td>
			<td>E-41L2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5)</td>
			<td>Burpee</td>
			<td>51771A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N. benthamiana seeds</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carborundum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C192-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-mix BX potting soil</td>
			<td>Premier Horticulture</td>
			<td>713400</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer</td>
			<td>JR Peters</td>
			<td>77860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.2 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 32 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>369694</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLA-3000 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>07149</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS-34 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 Plus centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene bottle</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355607</td>
			<td>For SLA-3000 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357002</td>
			<td>For SS-34 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td>For pelleting and 50.2 Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop2000c</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerEase 500 pre-cast gel system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI8675EU</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&Auml;KTA Explorer 100 Chromatograph</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-4062-66</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>392302</td>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro 2</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>In vivo imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tearor</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>985370-395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Libra 200FE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Chemicals and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-ethynylaniline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>498289-5G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well black plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353285</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X LDS sample buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A385-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 azide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20006</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td>10 kDa cut-off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>36891-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A74-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP101-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>42285-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>157574</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-801K</td>
			<td>P5 grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102406</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid sodium salt</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>35268-0050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412P-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-mal</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-ML-2k</td>
			<td>MW 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-N3</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-AZ-5k</td>
			<td>MW 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-NHS</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG1-SC-5k</td>
			<td>MW 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer*</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-6149</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-toluenesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13902-0050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>42435-0050</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfite</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0628-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S6-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>FCF-400Cu</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3446I-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Tissue Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12483-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31800-089</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td>175 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Animal Studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18% Protein Rodent Diet</td>
			<td>Harlan Teklad</td>
			<td>Teklad Global 2018S</td>
			<td>Alfalfa free diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329410</td>
			<td>28 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AHN3637</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCR nu/nu mice</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>CWRU School 
			of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td>18 1/2 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>4583</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral nanoparticles for in vivo tumor imaging

ナノ材料の使用は、材料科学と医学に革命を起こす可能性を秘めています。現在、異なるナノ粒子の数は、イメージング及び治療への応用が検討されている。植物由来のウイルス粒子（VNPs）が定義されたサイズと形状を持つ自己組織化bionanomaterialsとみなすことができる。シュタインメッツのラボで研究中の植物ウイルスは直径30nmのが、どちらもササゲモザイクウイルス （CPMV）とブロムモザイクウイルス （BMV）によって形成された正二十面体粒子が挙げられる。我々はまた、以下の植物ウイルス由来の棒状、糸状の構造を開発している：18 nmで、300 nmの寸法、および糸状粒子515を形成ポテトウイルスX（PVX）で剛体棒を形成したタバコモザイクウイルス （TMV）、長さと幅で13 nmのナノメートル（ リーダーがレフリーと呼ばれています。VNPsの詳細については、1および2）。 プランタで大規模に容易に製造することができる、非常に安定していて、生体適合性である。また、VNPsは、特に遺伝子組み換えや化学バイオコンジュゲーション法3を用いて操作することができる&quot;プログラマブル&quot;単位です。 VNPsの構造を原子レベルの分解能に知られており、変更は原子レベル4、現在の最先端の技術を有する合成ナノ材料を用いて達成することができないコントロールのレベルで空間的な精度で行うことができる。 本稿では、 緑豆ungiuculataとNicotiana benthamianaのプラントで CPMV、PVX、TMV、とBMVの伝播を記述します。各VNPための抽出と精製プロトコルが与えられている。精製し、化学的に標識VNPsのキャラクタリゼーションのための方法が記載されている。そこで、本研究ではchに焦点を当てるフルオロフォア（ 例えばのAlexa Fluor 647）、ポリエチレングリコール（PEG）とVNPsのemicalラベリング。染料は、5月10日 VNPsの追跡および検出を容易にし、8,11その薬物動態を向上させながら、PEGはタンパク質性ナノ粒子の免疫原性を低減します。我々は、マウス異種移植腫瘍モデルを用いてPEG化VNPsのホーミング腫瘍を実証している。マエストロイメージングシステムを用いて組織ex vivoでの蛍光イメージングの組み合わせは、均質化された組織における蛍光定量、および共焦点顕微鏡は、生体内分布を研究するために使用されています。 VNPsは細網内皮系（RES）を経由してクリアされます。ホーミング腫瘍が強化された透過性と保持（EPR）効果12を介して受動的に達成されます。 VNPナノテクノロジーは、画像に強力なプラグ·アンド·プレイ·テクノロジーであり、 生体内での病気のサイトを扱います。今後はへの薬物貨物や臨床的に意義のあるイメージング部分、ならびに組織特異的リガンドを運ぶためにVNPsを開発しているがんや心臓血管疾患で過剰発現分子の受容体を標的とする。

<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" /> 
 Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352...

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Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

17.1K ビュー.  Case Western Reserve University. 植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。

ビデオ: Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

生物工学

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. HerDox is formed by non-covalent self-assembly of a tumor targeted cell penetration protein with the chemotherapy agent, doxorubicin, via a small nucleic acid linker. A combination of electrophilic, intercalation, and oligomerization interactions facilitate self-assembly into round 10-20 nm particles. HerDox exhibits stability in blood as well as in extended storage at different temperatures. Systemic delivery of HerDox in tumor-bearing mice results in tumor-cell death with no detectable adverse effects to non-tumor tissue, including the heart and liver (which undergo marked damage by untargeted doxorubicin). HER2 elevation facilitates targeting to cells expressing the human epidermal growth factor receptor, hence tumors displaying elevated HER2 levels exhibit greater accumulation of HerDox compared to cells expressing lower levels, both in vitro and in vivo. Fluorescence intensity imaging combined with in situ confocal and spectral analysis has allowed us to verify in vivo tumor targeting and tumor cell penetration of HerDox after systemic delivery. Here we detail our methods for assessing tumor targeting via multimode imaging after systemic delivery.

This article details the procedures for optical imaging analysis of the tumor-targeted nanoparticle, HerDox. In particular, detailed use of the multimode imaging device for detecting tumor targeting and assessing tumor penetration is described here.

標的ウイルスタンパク質の分析はHER2 +腫瘍に配信ナノ粒子

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

変性コラーゲンストランドを画像化する<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;生体外</em&gt;リテーナ入りコラーゲン模倣ペプチド写真·トリガブリダイゼーション経由

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...