我々は、CのnuIs25とCGCのためのピーター十王、 ショウジョウバエケージを維持するために、ショウジョウバエの株式、Tarjani Agarwalさんのために博士Krishanuレイに感謝エレガンス株。 SPKはマイケルノネの研究室でjsIs609を作った。我々は、マイクロ流体デバイスにおけるjsIs609動物のミトコンドリア輸送のタイムラプスイメージングで彼の助けArpan Agnihotri（BITSピラニ）に感謝。我々は、ゼブラフィッシュ胚を提供してくれるための博士VatsalaティルマとスーリヤPrakashさんに感謝しています。我々は、ナノテクノロジー（第SR/55/NM-36-2005）のための科学と技術 - センターの部門によってサポートされ回転するディスク共焦点顕微鏡の使用のNCBで博士クリシュナとCIFFに感謝します。我々はまた、議論のためKaustubh Rauさん、V. VenkatramanとChetana Sachidanandに感謝します。この作品は、DBTポスドクフェローシップ（SM）は、DSTのファスト·トラック制度（SM）とによる助成（SPK）によって賄われていた。 SAはSPKにDSTとCSIR補助金によって支えられている。

1。 SU8マスター作製<ol><li> Clewinソフトウェアを使用して、マイクロ流体構造を設計し、回路基板フィルム上に8μmの最小特徴サイズで65024 dpiのレーザープロッターを使用してそれを印刷してください。 </li><li> 1分間、20％KOH中で自然酸化で2センチ×2cmのシリコンウエハをきれいにし、脱イオン水ですすぎ、流れの層とそれに対応する制御層用ウェーハ各1。 </li><li>窒素ガスでピースを乾燥させ、4時間120℃のホットプレート上で脱水吹く。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。 </li><li>場所シリコン片スピナーチャック上を1つずつ真空の電源をオンにします。 〜20μlのヘキサメチルジシラザン（HMDS）とコート入れ、5 500rpmでSPIN150スピンナーを用い有するシリコン表面を覆う秒30秒間3000rpmで続く。 </li><li> SU8-2025（の〜1.5mlで完全にシリコンウエハをカバー<a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">します。http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm）と5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いて塗布ウェーハは30秒間2,000 rpmで続く。この紡績プロトコルは、Cの初期の幼生期の制御とフロー層に適しています〜40μmのレジスト膜厚を生成エレガンス 。 </li><li>スピン5〜500rpmでSPIN150スピンナーを用いて1.5ミリリットルSU8-2050秒での後期幼虫用の流層の製造に適しています〜80μmのレジスト膜厚を得るために30秒間2,000 rpmで続く虫 、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生およびそれらに対応する制御層のための基底流量層。 </li><li>上にSU8被覆層とのホットプレート上でシリコン片を置きます。ソフトベーク65で被覆されたシリコン片℃で10分間、95℃、続いて1分間。作品は次のステップに進む前に室温まで冷却することができます。 </li><li> SU8-2025コーティングされたシュールで露光ステージ上のソフトで焼いたシリコン片を置きUVランプが直面している一番上の顔。 Cの初期の幼虫のためにそれぞれフロー層と制御層パターンの設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8層の上にフォトマスクを置き、マスクが被覆層に対して平らであることを確認します。 UVランプのシャッターを開けて、15秒間、フォトマスクを介して200ワットのUVランプにソフト焼きSU8ウェハを公開します。 </li><li> Cの後期幼生期のための流層と制御層を作製する（ステップ1.6で調製した）SU8-2050コーティングされた部分で設計I（L1、 図1B）とデザインⅡ（L2は、 図1B）と、フォトマスクを使用エレガンス 。 SU8-2050（準備された私でコーティングされたウェーハ上ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためにそれぞれ基底流層と制御層の設計I（L1、 図1C）とデザインⅡ（L2は、 図1C）でフォトマスクを使用して、nステップ1.6）。 15秒200ワットのUVランプにフォトマスクを介してSU8表面を露出。 </li><li>上に被覆層を備えたホットプレート上に露出したシリコン片を置きます。 10分間95℃に続いて1分間、65℃でウェハを焼く投稿してください。作品は次のステップに進む前に冷却することができます。 </li><li> 20分間SU8現像液を使用した作品を開発しています。 iso-プロピルアルコール（IPA）のピースを洗浄し、乾燥した使用して窒素ガスを吹き付ける。 </li><li>上にSU8パターンでデシケーター中でシリコン片を置きます。 tricholoro50μlの（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気でコート部分を。 </li></ol> 注意事項：KOH処理、レジスト塗布現像中に化学処理のための安全対策を講じて下さい。シラン蒸気コーティングは、換気の良い場所にデシケーター内で行われるべきである。 SU8は、光への暴露の上からレジストを保護します。紫外線LIGと保護メガネを使用して、htのソース。 2。 PDMSモールドの作製<ol><li>プラスチックカップの硬化剤5gでシルガード184ベースの50グラムを組み合わせることにより、10時01 PDMSを準備します。 〜3分間手動でコンテンツを混ぜる。ドガ、混合中に形成された全ての気泡を除去するためにデシケーター内部の混合物。 </li><li>気泡の形成を回避するために優しく、制御層のために、設計IIのSU8パターンをシリコンウェハ上に厚さ5mmのPDMS混合物を注ぐ。場合には気泡がすべての気泡を除去するために、低真空でSU8パターン上に、ドガPDMSを注ぐ中に形成される。 </li><li>私はスピナーチャック上に、フロー層のために、デザインのSU8-2025パターンでシリコンウェーハを置き、それらを保持するために真空をオンにします。 〜1 PDMSミックスのmlおよびコート5 500rpmでSPIN150スピンナーを用いてウエハをウエハをカバー秒30秒を1,500 rpmに続く。 </li><li>コート〜の設計I（L1、 図1B）の80μmのSU8-2050パターン付きシリコンウエハ上の1ミリリットルのPDMSミックスCの後期幼生期のためのフロー層5秒間500rpmでSPIN150スピンナーを用いelegansは 30秒間1,000 rpmで続く。コート35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生に対するフロー層設計I（L1、 図1C）のSU8-2050パターン付きシリコン片、上のPDMSミックスの厚い層。 </li><li>デザインのオーブンで焼くPDMSコーティングされたシリコン片IおよびCに対してPDMSを含む制御層に対応する設計IIとウェハ50℃の熱風対流式オーブンでエレガンス 、そして/またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生℃で6時間インキュベートする。 </li><li> CのSU8パターンIIを含むシリコン基板からのPDMS部分をカット鋭い刃を使用して線虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。ハリスのパンチャーを使ってPDMSモールドのメイントラップを接続する貯水池の上に約1mm径の小さな穴を開ける。 </li><li>パンチPDMSブロックを（制御用厚さ40μmの金型を含む置き上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイの上に層L2）。 PDMSの塗布面を上向きにして、同じトレイに厚さ40μmSU8デザイン私を含むPDMSコーティングされたシリコンウエハを配置します。プラズマクリーナーのチャンバ内のトレイを挿入し、2分間、真空をオンにします。その後、プラズマ電源をオンにし、チャンバの色は薄いピンクを回すまでチャンバ圧力を下げる。 2分間の低真空下で18ワット空気プラズマに両面を公開します。 </li><li> Cの後期幼生期のために厚さ80μmSU8マスター含むパターンIIから削除パンチPDMSブロックを配置上向きに制御層の成形面をプラスチックトレイに虫やショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。後でCの厚さ80μmデザインIを含有するシリコンウェーハ上に塗布し、対応焼きPDMS層のスピンを置く虫のステージやフラットPDMSコーティングされたのと同じトレイに同時にショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生urfaceは上向き。空気プラズマにさらさ上記の同じプロトコルを使用します。 </li><li> Cの2つのプラズマ処理された表面を置き虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生一緒に穏やかな圧力で、50℃の熱風対流式オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。 </li><li> CのSU8設計Iとシリコン基板から保税デバイスを切り取る虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生。パンチアクセス流路の入口と出口貯水池の穴。 </li><li> C用のプラスチックトレイに結合PDMSモールドを配置上向きに流動層設計の成形側とエレガンス 。きれいなガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）と同じプラスチック製のトレイの上に置きます。 PDMSモールドとプラズマチャンバー内のガラスカバースリップを含むトレイを挿入します。底装置のPDMS表面と2分間、低圧で18ワットの空気プラズマにガラスカバースリップを公開します。 Genでは2プラズマ処理された表面を置きTLE圧力、2時間50℃でそれらの熱風対流式オーブンで焼く。 </li><li>将来の使用のためのクリーンな環境に保管してください。 </li></ol> 3。 ショウジョウバエ /ゼブラデバイスの追加手順<ol><li>サイズの清浄なガラス表面X 2センチメートルtricholoroの50μl（1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル）シラン2時間デシケーター中で蒸気と2cmを公開します。 </li><li>スピン〜35秒500rpmでSPIN150スピンナーを用いてシラン化ガラス表面にステップ2.1で調製した10時01分のPDMSミックスの1ミリリットル。上向きにコーティングされた表面と6時間50℃の熱風オーブンでPDMSコーティングされたガラス基板を焼く。 PDMS層は、次の手順に進む前に室温まで冷却することができます。 </li><li>パンチのPDMSスペーサ層を形成するために、PDMSの中央にカスタム構築された鋭利な金属のパンチャーを使って被覆層。金属のパンチャーの形状は、 ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュのためのフロー設計（L1、 図1Cと同様に設計されている</strオング&gt;）。 </li><li> PDMSのスペーサ層と低真空でプラズマクリーナーを使用して単一の結合ブロック（ ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュの幼虫のためのステップ2.9で行われたフロー層と制御層）、18ワット空気プラズマにさらす。一緒に2つのプラズマ処理された表面に置き、50℃の熱風オーブンで焼く℃で2時間インキュベートする。 </li><li>ガラス、入口と出口の貯水池にパンチアクセスホールとステップ2.11で述べたように、プラズマクリーナーを使用してガラスカバースリップ（22×22ミリメートル、厚さ1号）に結合してから結合されたデバイスをカット。これは、〜500μmの流路高さと初齢ショウジョウバエの幼虫のための固定化装置を生産するでしょう。ゼブラフィッシュ幼生については、追加のボンディング工程とPDMSのスペーサ層製造プロセスを複製します。 PDMS-Sのデュアル層は30 HFPゼブラフィッシュの幼虫は900μmの流路高さを生成します。 </li></ol> 注意事項：デバイス製造時にほこりを避けてください。 2つのプラズマ洗浄された表面sは完全に適切なボンディングのための無料の塵にする必要があります。特別なクリーンルームは、デバイス中のほこりの蓄積を最小限にするために利用できない状況で、デシケーター中でデバイスに保管してください。 4。 PDMS膜を用いた<ol><li> 18ゲージ針（外径〜1.25ミリメートル）を介して加圧された窒素ガス供給レギュレータとメイントラップ溜め、もう一方の端にマイクロフレックスチューブ（内径〜1.6ミリメートル、外径〜4.8ミリメートル）の一方の端を接続しますテレビ画面に釘付けになっている。チューブ接続の中間で使用3方活栓は、メンブレン上のアプリケーションまたは圧力の放出を可能にする。 </li><li> Cの主なトラップのリザーバーに接続する前に、蒸留水の10cmカラムとPDMS装置に接続されたチューブを埋める虫および/ ​​またはショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生デバイス。 </li><li> 14 psiを読んで、目に向かって偏向メイントラップの膜を監視するために窒素供給のバルブを回し倒立顕微鏡の低倍率で電子流路。マイクロフレックスチューブ内水柱の長さは3方活栓がオープンされている圧縮されています。偏向膜のエッジは透過光（ 図1Iと1J）に表示されます。膜のたわみは、PDMS膜下ダスト粒子/気泡の変位を引き起こし、チャネルの境界にプッシュします。 </li><li>液体前面が閉じ込められた空気なしで完全にマイクロチャネルをいっぱいまで待ちます。 </li><li>その静止位置に膜を緩和する3方活栓を用いて圧力を解放します。 </li></ol> 5。 Cを挿入線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュデバイスに幼虫と柔軟性PDMS膜の下でそれらを固定化<ol><li> 1 LにH 2 O M9バッファ[3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1M MgSO 4で流路を埋める、AUTで滅菌oclaving] Cに対してエレガンス 18または1×PBS前10分間ショウジョウバエ /ゼブラフィッシュ幼生19日に[8 NaCl、0.2gのKCl、1.44gのNa 2 HPO 4、0.24gのKH 2 PO 4、H 2 O 1Lには、オートクレーブで滅菌する]を実験。 </li><li>シングルCを見つけ低倍率の実体顕微鏡を用いてのNGMプレート18（または寒天エッグプレートまたは液体培地で20手動dechorionated 30 HPFゼブラフィッシュの幼虫から初齢、ショウジョウバエの幼虫）で必要なステージの虫 。マイクロチップ内に緩衝液の少量を使用して、単一の動物を選んでください。バッファ内のより大きいショウジョウバエやゼブラフィッシュの幼虫を収容するために、その端部をカットしたマイクロチップを使用しています。 </li><li>流路入口から単一の生物を押してください。メイントラップの下に個々の動物を位置決めするためのピペッティング圧力を調整します。 </li><li>ゆっくりちゃんに対して動物を配置するためのPDMS膜の圧力を増加させるNEL境界および Cの14 psiの圧力でそれを固定する線虫 、 ショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュの幼虫の3 PSIの7 PSI。 </li><li>ビューの顕微鏡視野の中心に固定化された動物を置きます。高分解能明視野、蛍光イメージングのための希望の設定に倒立顕微鏡を使用しています。事前定義されたフレームレートで単一またはタイムラプス蛍光画像を取得する。 </li><li>トラップ圧力を解放し、低倍率で5〜10分間のために動物の運動を監視します。 </li><li>動物をフラッシュして、上記の手順を繰り返して、新鮮な動物を挿入します。 </li><li>シリンジを使用して適用された蒸留水を用いた廃棄物のリザーバーからすべての動物を洗う。将来の再利用のための注射器を使用して空気を押してチャンネルを乾かします。 </li></ol> 注意事項：メインチャネル内の流れに高いピペッティング圧力を必要とする動物は、トラップからのリリース後に貧しい運動/健康を示す傾向にあるとIMAは避けるべきである変更する。結晶することで、チャネルの詰まりを防止するためのバッファの任意のトレースの流路を清掃してください。油は高分解能イメージングのために使用されている場合は、その後の実験のために対雑音比の良い信号を維持できるようにするにはガラスカバースリップを清掃してください。

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

PDMSマイクロ流体デバイスは、したがって、任意の透明/半透明モデル生物のin vivoイメージング高分解能のために使用することができる光学的に透明である。当社のデザインはそのまま生きた動物における細胞およびサブ細胞事象の高倍率時空イメージングに適しています。ソフトリソグラフィ技術を用いて微細加工は、モデル生物の様々なサイズのためのデバイスの寸法を簡単に操作...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>大学ウェハ</td><td> 150ミリメートル（100）メックグレードのSSPのSi </td><td></td></tr><tr><td> Clewinソフトウェア</td><td> WieWebソフトウェア</td><td>バージョン2.90 </td><td></td></tr><tr><td>レーザープロッタ</td><td>ファインラインイメージング</td><td> 65024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td>マイクロケム</td><td> SU8-2025、SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td>開発者</td><td>マイクロケム</td><td> SU8開発</td><td></td></tr><tr><td>シラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184 </td><td></td></tr><tr><td> UVランプ</td><td>オリエル</td><td> 66943 </td><td> 200W水銀灯オリエ</td></tr><tr><td>熱風炉</td><td>ウルトラ·インスツルメンツ</td><td>カスタムメード</td><td> 50℃に設定</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td> IKA社のラボ用機器</td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td> Harrickプラズマ</td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td>スピナー</td><td>半導体製造装置</td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.SPS-Europe.com</a> </td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>ゴールドシール</td><td> 22 X 22ミリメートル、厚さ1号</td><td></td></tr><tr><td>線虫C. elegans </td><td> 線虫の遺伝学センター（CGC） </td><td> e1265、ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> ショウジョウバエ </td><td>ブルーミントン</td><td> P {chaGAL4} / CYO、UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ</td><td>インドの野生型</td><td>野生型</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>シグマ</td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロニードル</td><td>シグマ</td><td> Z118044 </td><td> 1cmの片に切断</td></tr><tr><td> 3方活栓</td><td>シグマ</td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td>ハリスパンチャー</td><td>シグマ</td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td>圧縮窒素ガス</td><td>地元のガスサプライヤー</td><td></td><td>圧力を制御するレギュレータを使用して、 </td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡&lt;/ TD&gt; <td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>アンドール＆オリンパス</td><td>横河電機回転するディスク共焦点顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td> ImageJの</td><td>国立衛生研究所</td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / IJ</a> </td><td> Javaベースの画像処理プログラム</td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

マイクロ流体デバイスを作製は、小さな生物に関するin vivo研究のためのアクセス可能な微小環境を提供します。シンプルな製造プロセスは1-3ソフトリソグラフィ技術を用いて、マイクロ流体デバイスのために用意されています。マイクロ流体デバイスは、 生体内レーザー顕微2,6と細胞イメージング4,7 のサブ細胞イメージング4,5、のために使用されている。in vivoイメージング生物の固定化を必要とします。これは、吸引5,8を使用して達成されている、先細チャネル6,7,9、変形可能な膜2-4,10、追加の冷却5、麻酔ガス11、温度感受性ゲル12、シアノアクリレート接着剤13や14のような麻酔レバミゾールと吸引、15。一般的に使用される麻酔薬は、シナプス伝達16,17に影響を与え、細胞内神経輸送4に有害な影響を有することが知られている。本STにおけるudy我々はそのような線虫Caenorhabditis elegans（線虫C. elegans）、ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの幼虫のようにそのまま遺伝的モデル生物の麻酔フリー固定化を可能にするポリジメチルシロキサン（PDMS）装置による膜を実証している。これらのモデル生物は、それらの小さい直径および光学的に透明または半透明の体のマイクロ流体デバイスを用いたin vivo研究では適しています。本体の直径はCの初期の幼虫のために約10μmから約800μmの範囲虫やゼブラフィッシュ幼生と高解像度タイムラプスイメージングのための完全な固定化を達成するために、異なるサイズのマイクロ流体デバイスを必要とします。これらの生物は、液体カラムを通して圧縮窒素ガスによる圧力を用いて固定し、倒立顕微鏡を用いて結像​​される。トラップから解放動物が10分以内に通常の歩行に戻ります。 我々は、Cのタイムラプスイメージングの4つのアプリケーションを実証エレガンスすなわち、神経細胞におけるイメージングミトコンドリア輸送、輸送欠損変異株、グルタミン酸受容体輸送とQ神経芽細胞の細胞分裂における前シナプス小胞輸送。映画などから得られたデータは、マイクロ流体固定化は麻酔動物（ 図1Jと3C-F 4）と比較した場合、携帯電話とサブ細胞事象のin vivoデータ取得の有用かつ正確な手段であることを示している。 デバイスの寸法は Cの様々な段階のタイムラプスイメージングを可能にするように変更されました線虫 、 ショウジョウバエの初齢幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。感覚神経細胞にGFP（syt.eGFP）でタグシナプトタグミンでマーク小胞の輸送はそのまま初齢ショウジョウバエの幼虫のコリン作動性感覚神経細胞で発現シナプス小胞マーカーの指示の動きを示しています。似たようなデバイスが〜30時間後に受精（HPF）でハートビートのタイムラプスイメージングを行うために使用されています幼虫をゼブラフィッシュ。これらのデータは、我々が開発したシンプルなデバイスが生体内でいくつかの細胞生物学的および発達現象を研究するためのモデルシステムの様々に応用できることを示す。

図1に示すように、フロー層（レイヤ1）と制御層（レイヤ2）：固定装置は、接着層2で作製した二層のPDMSブロックです。主なトラップは、レギュレータと液柱（ 図1A）を介して膜上必要（3-14 psi）の圧力を適用するための3ウェイストップコックを介して窒素ガスボンベに接続されています。偏向膜は C を固定する異なる次元（ 図1Bおよび<str...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;無傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。デバイスは、心拍、細胞分裂や細胞内輸送などの多数の神経プロセスのタイムラプスイメージングを実行するために、これらのモデル生物を固定化するために変形されたPDMS膜を利用しています。我々は、この装置の使用方法を示す、別のモデルシステムから収集したデータの様々なタイプの例を示しています。

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K ビュー.  NCBS-TIFR. シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されましたイメージング Cエレガンス無傷ショウジョウバエ幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。デバイスは、心拍、細胞分裂や細胞内輸送などの多数の神経プロセスのタイムラプスイメージングを実行するために、これらのモデル生物を固定化...

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

誘電泳動と層流を用いたマルチチャネルマイクロ流体デバイスの分離ビーズと細胞

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

生物工学

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

テキスタイル上の有機電子デバイスのためのシンプルでスケーラブルな製造方法

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...