この資料に記載されているすべての手順はLandesamtエリーゼのためにお大事にウントSoziales、ベルリン、ドイツのガイドラインおよび規制に準拠して行った。 プレ外科処置 1。モノフィラメントの調製<ol><li>管腔内フィラメントを調製するための、8-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を用い、13ミリメートルそれぞれの長さに切断した。 </li><li>モノフィラメントのコーティングについては、Xantopren M粘膜、（ヘレウスKulzer GmbH社、ハーナウ、ドイツ）は、活性剤溶液（ベーター、ユニバーサルプラス、ヘレウスKulzer GmbH社、ハーナウ、ドイツ）のドロップを追加することでアクティブに使用された。 </li><li>それは完全にそれで覆われていたまで、モノフィラメントをゆっくりシリコーンを通して引っ張られました。そうすることによって、モノフィラメントを均一にシリコーンで被覆される。活性化コーティング材料を迅速しっかりとドライになりますので、あまりにも長い間待っていることは避けてください。 </li><li>シリコーンは、固化を開始する前に、それは一枚の紙の上に引いて、フィラメントから過度のシリコーンを取り除くことをお勧めします。そうすることによって、シリコーン層は200μmの厚さに近似間引くことができる。 </li><li>シリコーンで覆われたモノフィラメントのベースは、それが一晩乾燥させるために、粘土に立ち往生した。 </li></ol>コメント：理想的には、唯一の滅菌又は少なくとも消毒モノフィラメントは、手術部位で無菌性を確保するために使用されるべきである。モノフィラメントの品質が9を悪化させる可能性があるので、実際には、手作りのモノフィラメントの滅菌または消毒は非常に困難である。従って、代わりに、市販の滅菌モノフィラメントを使用することが好ましいかもしれない。 2。手術器具のと動物の作製<ol><li>すべての外科用器具は、70％のエチルアルコール中に維持した。さらに、事前のそれぞれの新しい外科手術には、すべての手術器具は慎重に洗浄したndは70％エチルアルコールを用いて消毒する。 </li><li>手術領域を徹底的に横断する前に、すべての動物において70％のエチルアルコールを使用して消毒した。消毒部位は完全に切開を行う前に乾燥させた。これはmicroabrasionsとその後の皮膚の炎症9の原因と毛皮の追加のクリッピングは実行されませんでした。 </li></ol>外科手術 3。 LDFプローブとLDFモニタリングの位置付け<ol><li>麻酔導入のために、マウスをイソフルラン70％N 2 O、2.5％が気化器を使用して、30％の酸素からなるガス混合物に曝露した。麻酔を維持するため、イソフルラン濃度を1.5％に減少した。マウスは、外科手術全体マスクを呼吸を介し​​て自発的に呼吸していた。 </li><li>直腸温度プローブを挿入し、マウスは頭頂頭を露出する定位フレームに固定した。手術中に、マウスが上に載っていた37.0の一定のコア温度を確保するサーモスタット制御の加熱パッド、±0.5℃の矢状正中切開（約1センチメートルの長さ）は頭頂頭蓋骨を露出させて行った。 </li><li>頭蓋骨の左側には、慎重に解剖され、光ファイバプローブは、瞬間接着剤を使用してブレグマから頭蓋骨2ミリメートル尾から5mm横に直接固定されました。その後、創傷縁部を注意深く脳低体温並びに感染症を回避するために適合させた。 </li><li>マウスは首の腹側を露出するために振り向いた。光ファイバプローブは、プローブ·アダプタ（;ヤルフェッ、スウェーデンマスタープローブ418-1、Perimed）を接続を介して、LDFデバイス（PeriFLUXシステム5000、Perimed、ヤルフェッ、スウェーデン）に接続した。 </li></ol>コメント：周りにマウスを回している間、光ファイバプローブは、それが頭蓋骨から途切れることを回避するために慎重に曲げなければならない。 <ol start="5"><li> LDF装置は、ラップトップのCOMに接続したコンピューター。 LDF値の連続記録は、Windows用PeriSoft（バージョン2.50、ヤルフェッ、スウェーデン）を使用して開始された。 図1 BCCAO及び再灌流中10 LDF記録から得られた平均CBFコースを示しています。 </li></ol> 4。二国間の総頚動脈閉塞<ol><li> 3.1で説明したように麻酔を維持した。マウスは、その裏面上に置いた。動物のしっぽや足を粘着テープを使って加熱パッドに固定した。サジタル腹側正中切開（〜1センチメートル長さ）を行なった。 </li><li>両方の唾液腺を注意深く分離し、基本的なCCAのを視覚化するために動員された。 </li><li>両方のCCAのは慎重にこれらの構造を損なうことなく、それぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から分離した。迷走神経の操作は重要な心臓ARRの発生の可能性を秘めている副交感神経系の一時的または永続的な機能不全につながる可能性があるhythmiaあるいは不可逆的な心停止。したがって、迷走神経の任意の操作を回避するために重要である。緩い5-0絹縫合糸ループは、各CCAのまわりました。 </li><li>小さなシリコンチューブ（直径2ミリメートル）はCCAと両側に絹縫合糸の間に挿入した。縫合糸が締められたときに、このチューブは、（ 図4）動脈壁の損傷を避けるためにCCA年代のスプリントとして使用した。 </li><li>両方のCCAは、シルク縫合糸を締めて、一分間閉塞された。 LDF信号が基準信号の&lt;10％に減少されただけのマウスは、研究に含まれていた。両方のCCAの再開後、5分再灌流期間が開始されました。 LDFによる完全な再灌流を確保しました。不完全な再灌流（CBF すなわち &lt;90％の回収率ベースラインCBFと比較して）を持つ動物は除外した。 BCCAOの1分間再灌流の5分のシーケンスが合計BCCAO duratiのために二度繰り返した3分。 図1の上BCCAO再灌流時に10 LDF記録から得られた平均CBFコースを示しています。手順の中で、それは首が生理食塩水を用いたウェット巻き続けることをお勧めします。 </li><li>最後の再灌流後、すべてのチューブと縫合糸と​​同様に頭蓋骨に取り付ける光ファイバプローブを除去し、傷を縫合されたとリドカイン軟膏（Xylocain 2％、アストラゼネカ社、ヴェーデル、ドイツ）がために、必要に応じて繰り返して傷に適用された鎮痛管理。 </li><li>彼らは完全に意識を取り戻していたまで、マウスは予備加熱（30℃）の回収ボックス（MediHEAT.は株式会社ブラフ、カンブリア州、英国PecoServives）に移した。その後、マウスをその動物のケージに戻した。 </li></ol> 5。中大脳動脈閉塞<ol><li>マウスは、直腸温度プローブを挿入し、マウスを頚部の腹側を露出させる加熱パッド上に配置された、再麻酔した。その後、彼らはワットEREはBCCAOのセクションで説明し固定した。 </li><li>長い7-0絹縫合糸を使用して恒久的な合字は左近CCAを中心としましたし、スレッドを穏やか蚊クランプ（ 図4）を用いて尾側に引っ張られました。 </li><li>もう永久リガチャーは左外頚動脈（ECA）とスレッドが（ 図4）動物の右側の方に引っ張られたのまわりました。 </li><li>左ICA周囲の結合組織を注意深く動員され、舌下神経を穏やかにICAの遠もちろん良い概要を取得するために解除された。左に左のICA曲がる翼口蓋動脈（PPA）は右側（ 図4）の近位ICAのコースを次ながら。 </li></ol>コメント：尾方向に右折した識別される別の動脈があります。これは可変CCAの分岐から、またはPRのいずれかから発信さ後頭動脈であり、ECAのoximal一部（ 図4）。 <ol start="5"><li>緩い縫合糸ループを5-0絹糸を使用して、近位ICAのまわりました。 </li><li>小さ ​​な微小血管クランプを使用して、ICAを一時的に5-0ルーズ縫合糸ループ（ 図4）に対して遠位に閉塞した。 </li><li>小切開だけ微小血管はさみ（ 図4）を使用して、CCAの分岐前にCCAの遠位部で行われました。 </li><li>予め選択されたシリコーンで覆われたモノフィラメントは、小さな切開部を介してCCA内に導入し、微小血管クランプ（ 図4）で停止するまで、ICAに押し込まれた。 </li><li>それは（ 図4）停止するまでモノフィラメントがICAに深く進められつつmicroclampは慎重、ICAから削除されました。コメント：あなたは、ペンのようにそれを保持しないように、この時点では、左手で鉗子を反転。これにより、より簡単に鉗子でフィラメントをつかむのに役立ちます。血管クランプアプリケータは右手で開催されるべきである。それはほぼ切開側からの出血を防ぐために、ICAの周りに緩い5-0縫合糸を締めなければならない場合があります。 </li><li>モノフィラメント先端の正確な位置は、それがICAにはなくPPAに進出されたかどうかをチェックするために同定された。モノフィラメントの先端が近位PPAに導入した場合、フィラメントは優しくICA / PPA分岐直前に引き戻されました。そっと右側に近ICA少し引きながらそれは、再びICAにモノフィラメントを進めることを試みた。そうすることによって、遠位ICAの自然経過は、簡単にICAにアクセスすることをシミュレートした。 </li><li>モノフィラメントがほぼ完全にICAに進入した後、近位ICA周りルーズ5-0縫合糸ループを適所にフィラメントを保持するために締め付けられた。その後、すべての絹糸が短縮され、皮膚の傷を縫合した。 </li><li>手術中の流体損失replenたそれは完全な意識を取り戻しまで、その後、生理食塩水の腹腔1.0mlを注入することによってished、マウスは予熱された回収ボックスに移した。 </li><li>再灌流のために、マウスは再麻酔し、モノフィラメントは慎重に近ICAの周りに5-0絹縫合糸を緩めた後、削除されました。その後、5-0縫合糸は、出血を防ぐために慎重に再び締めした。 </li><li>完全な止血を確認した後、首の傷口を縫合した。 </li><li>痛みの軽減の必要に応じて、リドカイン軟膏を繰り返し皮膚に局所的に適用し、それを完全に意識を取り戻した回収ボックスまで、マウスを予備加熱（30℃）に移した。 </li><li>成功MCAO手続きのための最初のヒントとして、動物の旋回回りを観察した。機能障害の重症度をマウス10用に変更Bedersonスコアを用いて定量した。この修​​正Bedersonスコアによると、神経学的スコアは我々0（正常な運動機能）、1（マウスは尾によって解除された胴体と対側前肢の屈曲）、2（マウスを平らな面に尾で開催されたときに反対側に旋回が、通常次のように等級を再安静時の姿勢）、3（安静時の反対側に傾いて）、および4（無自発運動活性または死んだ）。 </li></ol> 6。 BCCAO偽手術 BCCAO偽手順については、マウスは、唾液腺が動員されたとCCAのが暴露された、本物のBCCAO PCの手続きの期間麻酔した。それは頸動脈や迷走神経への直接操作は偽の手順の間に避けられることが重要です。 CCAの操作は、内皮細胞から血管作動性化合物の放出につながるまたは動脈内腔の中に地元の血栓症を誘発することができ、その内皮層を損傷する可能性があります。その結果、血栓塞栓症は、偽手術後に発生することがあります。これは、番目の主要な交絡因子となる電子手続き。一方、迷走神経の操作はかなりの不整脈、あるいは不可逆的な心停止の発生の可能性を秘めている副交感神経系の一時的または永続的な機能不全につながる可能性があります。したがって、BCCAO中に迷走神経の任意の操作を回避するために重要である。 手術後 7。音量測定の梗塞梗塞の大きさの評価のために、マウスはMCAO後72時間生存した。その後動物は深く麻酔し、脳を除去し、梗塞体積測定用ヘマトキシリン​​（Papanicolauのプロトコルを使用して）と、メチルブタンでスナップ凍結切片や染色した。脳切片を、画像解析装置（MCIDコア7.0 Rev.2.0に、GEヘルスケアナイアガラ社）を用いて決定し、Lin らの方法に従って浮腫について補正した600μmの間隔で梗塞容積で収集した。7,11 </&gt;（商標）。 8。試験対象患者基準我々は3つのBCCAOエピソードの各々の間に90％以上でLDF-測定CBFの減少を持っていた唯一の動物が含まれていた。理想的には、LDFの監視はBCCAO中の両方大脳半球で実行する必要があります。実用性のために、我々は、後でMCAOにさらされる左半球でLDFの監視を行った。このアプローチは、6,12前に記載されている。各BCCAOエピソード後の再灌流は、（ベースライン値にすなわち復帰）完了する必要がありました。持続マウスを麻酔下に保持された時間を低減する理由から、我々は、MCAO手術の際CBFを監視していなかった。しかし動物の別のグループでのパイロット研究では、MCAOの手術中LDFによるCBFを監視した。マウスのこのグループでは、一貫してCCA閉塞前のベースラインと比較して90％によってCBFの減少を測定した。さらに、モノフィラメントCBFを除去した後、それぞれの&gt; 90％にまで回復したCCA閉塞後の基準値。これらLDF基準は一貫梗塞ボリューム7文学と結果には確立されている。我々は唯一のMCAO後に麻酔から回復した後、少なくとも1のBedersonスコアを持っていた動物が含まれていた。さらに、MCAO、どれが頭蓋内出血の兆候を示さなかった後72時間生存した唯一の動物が研究に含まれていた。

<ol>
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J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice:+a+redox+sensitive+mechanism?.">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?.</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li><li>Li, L., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+improves+short-term+and+long-term+neurological+outcome+after+focal+brain+ischemia+in+adult+rats.">Isoflurane preconditioning improves short-term and long-term neurological outcome after focal brain ischemia in adult rats.</a> Neuroscience. 164, 497-506 (2009).</li><li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesth. Analg. 96, 233-237 (2003).</li><li>Spratt, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+method+of+thread+manufacture+improves+stroke+induction+rate+and+reduces+mortality+after+thread-occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+young+or+aged+rats.">Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats.</a> J. Neurosci. Methods. 155, 285-290 (2006).</li><li>Zarow, G. J., Karibe, H., States, B. A., Graham, S. H., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats:+effect+of+suture+insertion+distance+on+cerebral+blood+flow,+infarct+distribution+and+infarct+volume.">Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats: effect of suture insertion distance on cerebral blood flow, infarct distribution and infarct volume.</a> Neurol. Res. 19, 409-416 (1997).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

我々の研究では、BCCAOの3つのシーケンスは、それぞれ1分間持続し、5分間の再灌流に続いて、IT早いを誘導するのに十分な虚血PCの刺激であることが示されている。 さらに、我々は、使用される前処理プロトコルは、特筆すべき術後合併症、脳、無死亡におけるアポトーシスの徴候で安全とマイナー侵襲的な処置であることを実証した。いくつかの異なった前処理プロト?...

虚血性脳卒中は、高い死亡率と莫大な社会経済的負担を1と疾患である。最近の数十年間を通して集中的な実験や臨床科学の努力にもかかわらず、急性虚血性脳卒中患者のための治療の選択肢は、2つは非常に限られたまま。それとは対照的に、先進国の高齢者の割合の増加は劇的に今後数十年間3で虚血性脳卒中患者の発生率と有病率が増加します。したがって、虚血性脳卒中患者における新たな治療戦略のための差し迫った必要性がある。 一つのアプローチは、有害な刺激に対処するために、脳の内因性の適応のメカニズムの更なる理解を得ることである。この脳由来神経も虚血プレコンディショニング（PC）または虚血耐性（IT）として知られており、脳に適用非損傷侵害刺激は、一時的な耐性を誘導する現象について説明しているその後の有害虚血4に対して。 IT早い、PC数時間後に数分以内に発生し、4を発生する数時間の待ち時間を必要とする、ITを遅らせ：ITは、2つの異なる時間ウィンドウで発生します。 これまでのところ、脳内のITの研究は、ITが遅れに焦点を当てている。ましては、ITの早期のメカニズムに知られています。本研究の目的は、適切なPCの刺激として、ITを遅らせ誘導する確立刺激誘導することで二国間の総頸動脈閉塞（BCCAO）を確立することである一過性局所脳虚血（中大脳動脈閉塞によって誘発される、MCAO）に対するITの早期C57BL6で/ Jマウス。 外科的処置（BCCAOとMCAO）の両方で、レーザードップラーフローメトリー（LDF）による脳血流のモニタリング（CBF）を行なった。 BCCAOを麻酔し、自発的に呼吸したマウスで行った。両方の総頸動脈（CCA）が暴露されたおよび60のために閉塞秒灌流の5分が続く。このBCCAO /再配列を2回繰り返した。手術後、マウスはすぐに回復し、機能障害の兆候を示さなかった。排除するために、上記のBCCAOプロトコルは、脳内の遅延細胞死には至らなかった、我々はBCCAO後TdTを媒介たdUTP-ビオチンニック末端標識（TUNEL）染色72時間（または偽手術）を実行した別のグループ。 MCAO 5-7げっ歯類では局所脳虚血の誘導のために広く確立されたモデルです。外科的処置は、標準操作手順（SOP）8を用いて行った。左CCAを露出させた後、シリコンで覆われたモノフィラメントことにより、前大脳動脈（ACA）までウィリスの円内に内頸動脈（ICA）を介して前進および遠位CCA、中大脳動脈の原点（に導入したMCA）が定義された期間のために閉塞していた。本研究では、我々通常、線条体及び大脳皮質の脳領域が関与するMCA領域における虚血性病変をもたらすMCAOの使用45分、。 我々の研究では、早期にITは、PCの刺激としてBCCAOを使用することの時間プロファイルを分析した。我々のデータは、BCCAO MCAOとの間の最適な時間遅延は、ITが30分であることを早期に誘導するために、示された。 このビデオでは、我々は両方の外科手術、 すなわち BCCAOとMCAOのデモンストレーションを行います。

<table border="1">
<tbody>
<tr>
	<td>Name of the instrument</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number/model</td>
</tr>
<tr>
	<td>Binocular surgical microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Stemi 2000 C</td>
</tr>
<tr>
	<td>Light source for microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>SteREO CL 1500 ECO</td>
</tr>
<tr>
	<td>Heating pad with rectal probe</td>
 <td>FST</td>
 <td>21061-10</td>
</tr>
<tr>
	<td>Stereotactic frame</td>
 <td>David Kopf</td>
 <td>Model 930</td>
</tr>
<tr>
	<td>Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>91460-11</td>
</tr>
<tr>
	<td>Dumont forceps #5</td>
 <td>FST</td>
 <td>11251-10</td>
</tr>
<tr>
	<td>Dumont forceps #7</td>
 <td>FST</td>
 <td>11271-30</td>
</tr>
<tr>
	<td>Mircovascular clamp</td>
 <td>FST</td>
 <td>00398-02</td>
</tr>
<tr>
	<td>Clamp applicator</td>
 <td>FST</td>
 <td>00072-14</td>
</tr>
<tr>
	<td>Springscissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>15372-62</td>
</tr>
<tr>
	<td>Needle holder</td>
 <td>FST</td>
 <td>12010-14</td>
</tr>
<tr>
	<td>Needles	</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td>BER 562-20</td>
</tr>
<tr>
	<td>5-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
<tr>
	<td>7-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein,Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
<tr>
	<td>8-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
</tbody>
</table>

bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia

証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング - 脳への非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 / Jマウスにおける一過局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するコンディショニング刺激として二国間の総頸動脈の動脈閉塞を確立しています。このビデオでは、我々はこの研究のために使用される方法のデモンストレーションを行います。

両方のCCAのが（ 図1）閉塞されたときに我々のBCCAOプロトコルが（&gt; 90％）即時かつ深遠CBFの削減となりました。 CCAの再開は、LDF（ 図1）によって監視として再灌流を完了するために導いている。 PC後、動物は、機能障害の兆候を示さなかった。さらに、死亡率がありませんでした。 TUNEL染色、動物の別のグループにBCCAO後72時間を行ったがBCCAO（データは示されてい?...

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング（PC） - 脳の非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 / Jマウスで一過性局所脳虚血（中大脳動脈閉塞、MCAOによって誘発）に早期に虚血耐性を（IT）を誘導するためのプレコンディショニング刺激として二国間の総頸動脈閉塞（BCCAO）を設立。

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

bilateral-common-carotid-artery-occlusion-as-an-adequate

Research

JoVE Journal

Medicine

28.8K ビュー.  Charité - Universitätsmedizin Berlin, Germany. 証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング（PC） - 脳の非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 / Jマウスで一過性局所脳虚血（中大脳動脈閉塞、MCAOによって誘発）に早期に虚血耐性を（IT）を誘導するためのプレコンディショニング刺激として二国間の総頸動脈閉塞（BCCAO）を設立。

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Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

医学

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

マウスにおけるレーザードップラー流量計の指針と虚血性脳卒中に対する腔内中大脳動脈閉塞（MCAO）モデル

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

ラットにおけるレーザードップラー血流計の指針と虚血性脳卒中のエンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞モデル

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

エンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞中大脳動脈を可視化するために頭蓋窓を利用

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

成体マウス静脈性高血圧モデル：外頸静脈吻合部の総頸動脈。

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

ラットにおける同種血血栓による虚血性脳卒中のための塞栓中大脳動脈閉塞（MCAO）

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

持続的な障害と皮質虚血を研究するために高齢ラットにおける一般的な頸動脈閉塞と永久遠位中大脳の実行

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

生体内でウサギの一般的な頚動脈内皮細胞への遺伝子導入

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

耐久性のある遺伝子発現により一般的な頚動脈移植に頸静脈の家兎モデル

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...