このプロジェクトは、NIH（R21EB013717）とIUPUI OVCR（RSFG）によって賄われていた。著者は彼女の技術支援のためにハンさんのShihに感謝します。

A.マクロマーとペプチド合成<ol><li>確立されたプロトコルを使用して、4アームPEG-ノルボルネン（PEG4NB）と光開始剤リチウムarylphosphanate（LAP）。18,19を合成</li><li>マイクロウェーブペプチド合成装置（CEMディスカヴァーSPS）で標準的な固相ペプチド合成法を用いたキモトリプシン感受性のペプチドCGGY↓Cを（矢印はキモトリプシン切断部位を示す）を含むビス - システインを合成する。 <ol class="lalpha"><li>樹脂および合成スケールの置換率に基づき、必要に応じ樹脂（スケートリンクアミドMBHA樹脂）の量を計算します。 15分間反応容器（RV）にジメチルホルムアミド（DMF）中の樹脂を膨潤。 </li><li> DMF中の20％ピペリジンと0.1M HOBtを含む脱保護溶液を使用して樹脂からのFmoc-保護基を除去。マイクロ波アシストのFmoc-脱保護（すべてのFmoc-アミノ酸のための）のために、以下の表にリストされているパラメータを使用します。 <table border="1"><tbody><tr><td> 合成スケール </強い&gt; </td><td> 0.1ミリモル </td><td> 0.2ミリモル </td></tr><tr><td>パワー</td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td>温度</td><td> 75℃ </td><td> 75℃ </td></tr><tr><td>時間</td><td> 3分</td><td> 3分</td></tr></tbody></table></li><li>脱保護の後、DMFで樹脂を洗浄したFmoc（N末端アミンの露出）の削除を確認するニンヒドリンテストを実行します。樹脂は、95℃で2分後に青くなるはずです</li><li>成功した脱保護の後、カップル、次の表に示すパラメータを持つベーター塩基溶液（DMF中0.28 Mのジイソプロピルエチルアミン（DIEA））のC末端（合成はCからN末端から実行されます）の最初のFmoc-アミノ酸。 <table border="1"><tbody><tr><td> 合成スケール </td><td> 0.1ミリモル </td><td> 0.2ミリモル </td&gt; </tr><tr><td>パワー</td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td>温度* </td><td> 75℃ </td><td> 75℃ </td></tr><tr><td>時間* </td><td> 5分</td><td> 5分</td></tr></tbody></table> *嚢胞と彼のために、50℃、10分間、ラセミ化を減らすために使用します。 </li><li>樹脂を洗浄し、質的にカップリングの完了（N末端アミンの消失）を確認するためにニンヒドリンテストを実行します。樹脂は、95℃で5分間後に明確にする必要がありますニンヒドリン試験が陽性の結果（青色）を返した場合にカップリング工程（A.2.d）を繰り返します。 </li><li>最終脱保護工程で終わるシーケンス内の追加のアミノ酸に脱保護（ステップA.2.b）とカップリング（ステップA.2.d）を繰り返します。 </li><li> RVを排出し、25mlのジクロロメタン（DCM）で樹脂を洗浄してください。このステップは基本であり、ペプチド切断の妨げになるDMFを、洗い流すことです。 </li><li> 250メートルを混合することにより、切断カクテルを準備4.75ミリリットルトリフルオロ酢酸（TFA）、0.125ミリリットルトリイソプロピルシラン（TIS）と0.125ミリリットル蒸留H 2 O中のフェノールグラム</li><li>マイクロウェーブペプチド合成装置で30分間RVおよび開裂に切断溶液を加える（パワー= 20 W、温度= 38℃）。 </li><li>吸引マニホールドを用いて50 mlの遠心チューブ内のペプチド溶液を収集します。 </li><li>エーテル、渦ペプチドを収集するための5分間3000 rpmで遠心チューブと40mlに切断されたペプチドを沈殿させた。 </li><li>上澄み液を排出し、ステップA.2.kを二回繰り返す。 </li><li>真空中でのペプチドを採取し、乾燥させます。 </li><li> HPLCを用いてペプチドを精製し、質量分析法とそれを特徴付ける。 </li></ol></li></ol> Bの材料の準備と滅菌<ol><li>マクロマーが完全に溶けるまで、PBS中の20重量％PEG4NBソリューション、ボルテックス混合物を準備し、シリンジフィルターを用いてマクロマー溶液を滅菌する。 -20℃（準備アリコートで滅菌溶液を保存長期保管の場合）。 </li><li> PBS中で2重量％の光開始剤（LAP）の溶液を調製し、滅菌する。光から保護して室温で滅菌溶液を保管してください。 </li><li> PBS中のペプチド（CGGYC）を溶解、ボルテックス混合し、シリンジは滅菌のためのソリューションをフィルタリングします。アリコート使用するまで-20℃でペプチド溶液とストア（凍結融解サイクルを防ぐ）。 </li><li>エルマン試薬を用いて調製されたペプチド溶液中のチオール基（-SH）濃度（製造業者のプロトコールに従う）を決定します。このステップでは、チオール-エン写真クリックで反応に使用されるペプチド量を算出するために必要とされる正確なペプチド濃度（ すなわち 、[SH] / 2）を与える。 </li><li>かみそりの刃（ゲルの除去のための開口先端）を使用して滅菌した1ミリリットル使い捨て注射器の上の部分をカットしてゲル化金型を準備します。オートクレーブによる注射器の金型を滅菌する。 </li><li>所望のゲル製剤（ エン比= 1〜チオール ）と株式メイトの濃度に基づいてリアルでは、ポリマー、ペプチド架橋剤、光開始剤、および必要な緩衝液の必要量を計算します。 </li></ol> C.細胞の調製<ol><li> 、ハンクス平衡塩溶液（細胞培養培地（;、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 ng / mlのファンギゾンと抗生物質抗真菌及び50μMのβ-メルカプトエタノール、10％ウシ胎児血清を含む高グルコースDMEM）を平衡化37〜HBSSは、Ca 2 +、Mg 2 +のフリー）、およびトリプシン-EDTA℃に</li><li> CO 2インキュベーターからMIN6β細胞を含むフラスコを取り外し、層流フード内でフラスコを置く。 </li><li>フラスコから細胞培養培地を吸引除去し、HBSSで細胞を洗浄してください。 </li><li> 2Xの3ミリリットル（0.1％）、トリプシン-EDTAを用いて細胞をトリプシン処理し、37℃で4分間フラスコをインキュベート℃、5％CO 2。 <ul><li>注：使用2Xトリプシン溶液は、単一の細胞懸濁液にMIN6β細胞の完全な解離することができます。 </li></ul> &lt;/ LI&gt; <li>インキュベーション後、細胞を完全に分離するために静かにボンネットの表面にフラスコをタップします。顕微鏡を用いて細胞の剥離と解離を確認してください。 </li><li>トリプシンを中和するために、細胞培養培地の等量を追加します。穏やかにピペッティングにより良く混合し、1,000 rpmで5分間遠心し、正規のチューブに混合物を転送します。 </li><li>上清を吸引除去し、穏やかに4で細胞を再懸 - 培地5mlを。 </li><li>血球計数器では50％トリパンブルー緩衝液を用いて細胞密度を決定します。 </li></ol> D.ハイドロゲルの作製とセルカプセル化<ol><li>細胞は準備ができたら、ミックス（エン比1:1〜チオールに基づく）PEG4NB、CGGYC、LAPは、細胞溶液、およびマイクロチューブにHBSSの必要なボリューム。 </li><li>穏やかに均質な混合物を得るとシリンジ型に得られた溶液の25μlを追加するには、ピペットを用いて溶液を混ぜる。紫外光（365シリンジを公開2分間程度、5 mW / cm 2）を。 </li><li>以下の光重合、細胞培養培地を含む滅菌24ウェルプレートに飛び込むゲルおよび37℃、5％CO 2のヒドロゲルをインキュベートする。 </li><li>緩く付着した細胞と未架橋マクロマーを洗い流すために30分間、細胞培養培地中の細胞を含んだハイドロゲルを洗浄します。新鮮な培地にゲルを移します。 </li><li> 2〜3日ごとにリフレッシュ細胞培養用培地。 </li></ol>大腸菌細胞生存​​率アッセイカプセル化された細胞の形態は、（合成されたハイドロゲルは透明であるため）光顕微鏡を用いて観察することができます。細胞生存率を可視化し、LIVE / DEAD染色を使用して定量的にAlamarBlue試薬を用いて定性的に測定することができます。 E.1。 LIVE / DEAD染色<ol><li>室温でLIVE / DEAD染色試薬を解凍します。 </li><li>正規のチューブに染色されるサンプルの数（n）に応じてPBSを追加します。 <strオング&gt; PBS = N×500μl の合計体積 </li><li>カルセインAMおよびPBSを含む標準的なチューブにPBSを1mlあたりEthD-1の2μlのピペット0.25μlの。渦成分を混合するためのソリューションを提供します。 </li><li>オービタルシェーカー上で室温で1時間ライブ/デッド染色溶液（0.5ミリリットル/サンプル）中の細胞を含んだハイドロゲルをインキュベートする。 </li><li>パスツールピペットを用いて、色素溶液を除去し、PBSで2回サンプルをすすいでください。 </li><li>カバースリップやスライドガラス上にサンプルを置きます。共焦点顕微鏡を用いて細胞を観察した画像。 </li></ol> E.2。 AlamarBlueアッセイ<ol><li>細胞培養培地中で10 V / V％AlamarBlue溶液を調製します。 </li><li>インキュベーターからヒドロゲルを取り外し、ヒドロゲルとの接触をせずに、各ウェルの培地を吸引除去する。 </li><li> 16時間10パーセントAlamarBlue溶液500μlで細胞を含んだハイドロゲルと空井戸（ネガティブコントロール）をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション、ピペットを200μl以下マイクロプレートリーダー（：波長560nm、発光：59​​0nmで励起）を用いて96ウェルプレートとメジャー蛍光のAlamarBlue液。 <ul><li>高い細胞の代謝活動が高い蛍光測定値を与えるために染料を削減します。 </li><li>ブランクとして10％Alamarblue溶液の少なくとも二つのウェルを必ず含めてください。データを分析する場合、試料の蛍光測定値から平均化された空白の蛍光値を減算します。 </li></ul></li></ol> F.キモトリプシンはジェル侵食とスフェロイド回復を媒介<ol><li> HBBSと滅菌フィルター溶液中でトリプシン遊離α-キモトリプシン溶液の1 mg / mlの準備をします。 </li><li>完全なゲルの侵食が達成されるまで、穏やかに振とうしながら室温でキモトリプシン溶液中のヒドロゲル（各ゲルに500μl）をインキュベートする。 <ul><li> 25μlのゲルの場合、完全な浸食のための時間は約5分です。 </li></ul></li><li>の活性を低下させるために数分間氷上にプレートを置きキモトリプシン。 </li><li> 2分間300rpmで1ミリリットル管と遠心分離機で細胞溶液、4℃を転送します。 </li><li>慎重に牧草ピペットを用いて上清を除去し、優しくHBSS中のスフェロイドを再懸濁します。 </li><li> 24ウェルプレートに回収した回転楕円体溶液を移し、スフェロイドが落ち着くできるように氷の上にプレートを置きます。 </li><li>サイズの解析では、光学顕微鏡を用いた落ち着いたスフェロイドの位相コントラスト画像を取得する。尺度は、そのようなニコン要素ソフトウェアやImageJのようなソフトウェアを使用してスフェロイド直径を回復した。 </li></ol>回収されたスフェロイドのG.機能アッセイ G.1。回収された細胞のスフェロイドからグルコース刺激によるインスリン分泌<ol><li> 24ウェルプレート中で、1時間、2 mMの低グルコースKerbsリンガー液（KRB）500μlのゲルをインキュベートする。 </li><li>ゲルを侵食しF.6にステップF.1を用いた細胞スフェロイドを回復。 </li><li>いずれかをせずに慎重に上清を吸引し細胞スフェロイドと連絡し、2mMの低グルコースKRB500μlのスフェロイドを再懸濁する。 </li><li> 0.6mlのチューブに細胞スフェロイド溶液100μLを移し、細胞内ATPの定量化のための氷の上に置きます。 </li><li>半分に残りの細胞スフェロイド溶液（2マイクロ遠心チューブに）分割し、300 rpmおよび4℃で2分間遠心℃、 </li><li>上清を吸引（ほぼ底まで）および25 mMの高グルコース、KRBと2mM低グルコースKRB 1ml中の後半1mlの細胞スフェロイドの前半を再懸濁します。 </li><li>穏やかに24ウェルプレートに回収された細胞のスフェロイドを含む溶液をピペットと転送します。 ℃、5％CO 2で 37℃で1時間静置します。 </li><li>インキュベーション後、℃、1,000 rpmで、4℃で2分間微量遠心チューブと遠心分離機にソリューションを転送</li><li>インスリンを4で別のマイクロ遠心チューブや店舗℃に遠心分離管からの上清500μlをELISA法。 </li><li>インスリンELISA以下、製造業者のプロトコルを実行します。 </li></ol> G.2。 CellTiterグロアッセイ<ol><li> ATPの規格：10μMATP溶液を準備し、8つの標準ソリューションのシリーズを取得するために希釈を行う。 </li><li>白色96ウェルプレートに、細胞スフェロイド溶液（ステップG.1.6から）と基準の50μlを添加する。 </li><li>各ウェル含有試料と基準に、CellTiter Glo試薬50μlを追加し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて試料および標準のメジャー発光数とATPの基準によって生成された線形回帰曲線を用いて、試料のATP濃度のキャリブレーションを行います。 </li><li>試料中の総A​​TP濃度を決定し、1セルを含んだハイドロゲルで細胞内ATP濃度を得るために、試料希釈係数を掛けます。 </li></ol> G.3。インスリン分泌を決める<ol><li>天羽を計算低グルコース培地中に分泌されたインスリンの量を高グルコース培地中に分泌されたインスリンの量の比をとることによって回復スフェロイドから分泌されるインスリンのnt。 </li><li>回収した細胞スフェロイドの細胞内ATPのそれぞれの量を用いた細胞スフェロイドの定量インスリン含量を正規化します。 </li></ol>

<ol>
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特別な利害関係は宣言されません。

説明されたプロトコルはステップ成長重合によって形成されたチオール - エンハイドロゲル中の細胞の容易なカプセル化の詳細を提示します。チオール官能基ノルボルネンの1:1の化学量論比は、このプロトコルで使用されていたものの、比率は、実験に応じて調整することができる。正しい処方に加えて、それはプレポリマー溶液中で均一性を維持することが重要です。具体的には、細胞が?...

ヒドロゲルは修復および再生組織のための足場材料として非常に優れたポテンシャルを有する親水性架橋ポリマーである。1月3日ヒドロゲルの高含水の栄養素と細胞代謝産物の酸素と交換の容易な拡散を可能にし、これらの全てが細胞の生存を維持するために重要です。また、ヒドロゲルは、彼らのcytocompatibilityが主因、ポリ（エチレングリコール）（PEG）から調製したものとして2合成ヒドロゲルはますます組織工学用途で使用されている。放出制御とその高い同調性による細胞送達のための優れたキャリアである組織のような弾力性、材料の物理的および機械的性質の高い同調性4-6 一般的に使用されるハイドロゲル·プラットフォームが、研究では、連鎖成長photopolymerizationsによって形成されたPEGアクリレート（PEGDA）ヒドロゲルは、カプセル化された細胞をドゥーリを損傷する傾向があることが示されているngのネットワーク架橋および in situ細胞カプセルインチ 7細胞の損傷は、主にヒドロゲルに架橋ポリマー鎖にPEGDA上のビニル基を介して伝播する光開始剤分子によって生成されたラジカル種に起因するものであった。残念ながら、これらのラジカル種は、特にそのような膵β細胞などのラジカル感受性細胞では、細胞のカプセル化中にストレスや細胞の損傷を引き起こす。8-10良く拡散し、細胞生存のためのより高いメッシュサイズを得るためには、より高い分子量はPEGDA多くの場合、細胞のカプセル化に使用されます。しかし、これは、重合速度を損なうと次善ゲル生物物理学的特性を引き起こします。7,11,12は、上記の欠点に加えて、それが原因の異質性と非分解性の性質にPEGDAハイドロゲルからの細胞構造を回復するのは非常に困難である架橋ネットワーク。プロテアーゼ感受性ペプチドを配合することができますが酵素による切断に感受性がそうでなければ不活性PEGDAヒドロゲルをレンダリングするために、PEGマクロマーバックボーンに、結合はしばしば高価な試薬を使用し、結果としてネットワークの中には、依然として、連鎖成長重合の性質による不均質性の高い学位を含む。13-15 最近では、段階成長チオール-エン光重合を介して形成されたPEG-ペプチドハイドロゲルは、連鎖成長重合によって形成されたハイドロゲルを介して細胞のカプセル化のための優先的な性質を示すことが示されている。チオール-エンヒドロゲルの7優れたゲル化動態は&quot;クリックに起因している&#39;チオールとエンの機能との間の反応の性質。 PEGDAの連鎖成長重合に比べて、チオール-エン反応は、より速くゲル化速度が得られる。少ない酸素が​​16,17チオール-エンヒドロゲルはまた、より高い重合効率と連鎖成長PEGDAヒドロゲル、7と比較してより良いジェル生物物理学的特性を有する阻害される、18 &lt;/ sup&gt;の光重合中にラジカル種による限られた細胞の損傷をもたらす。 ペプチド架橋剤を含む4アームPEG -ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びビス-システインにより形成された以前に、チオール-エンヒドロゲル、プロテアーゼ感受性ペプチドは細胞のカプセル化に利用されているような。のPEGヒドロゲルネットワークの7,18ハイ同調性が提供細胞の生存と活動を調査するための柔軟かつ制御可能な3次元微小環境、プロテアーゼ感受性ペプチド配列の使用はヒドロゲル内で自然に形成された細胞構成体の回復のための穏やかな方法を提供している。このプロトコルでは、4アームPEG-ノルボルネン（PEG4NB）とMIN6β細胞のカプセル化のためのキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGY↓C）を用いて製作段階成長光重チオール - エンハイドロゲルを利用しています。このプロトコルは、体系的にMIN6の生存、増殖およびスフェロイド形成を研究するためのテクニックを詳しく説明チオール - エンヒドロゲルでβ細胞。今後は、β細胞のスフェロイド回収し、回収スフェロイドの生物学的特性評価するための方法を提供する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 4アームPEG（20kDa） </td><td> Jenkemテクノロジー米国</td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-アミノ酸</td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIVE / DEAD細胞の生存キッ​​ト</td><td>インビトロジェン</td><td> L3224 </td><td>カルセインAMとエチジウムホモ-1を含む</td></tr><tr><td> AlamarBlue試薬</td><td> ABD Serotec社</td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo試薬</td><td>プロメガ</td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ロンザ</td><td> 17-512F </td><td>のCa +2およびMg 2なし</td></tr><tr><td> HBSS </td><td>ロンザ</td><td> 10547F </td><td>せずにのCa +2およびMg 2 </td></tr><tr><td>高グルコースDMEM </td><td> Hyclone社</td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>ギブコ</td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン遊離α-キモトリプシン</td><td>ワージントン生化学株式会社</td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td>マウスInusin ELISAキット</td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1ミリリットル使い捨て注射器</td><td> BD Biosciences社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

ヒドロゲルは、培養治療に関連する細胞または組織のための組織のような弾力性と高透磁率を有する三次元微小環境を提供する親水性架橋ポリマーである。ポリ（エチレングリコール）（PEG）誘導体から調製されたヒドロゲルはますます彼らの同調可能とcytocompatible特性に起因して部分的には、組織工学の様々なアプリケーションに使用されています。このプロトコルでは、B細胞、膵臓MIN6をカプセル化するためにPEG-ペプチドハイドロゲルを作製するために、チオール - エン段階的成長photopolymerizationsを利用した。ゲルは4アームPEG - ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGYC）によって形成された。 PEGの親水性及び非汚染性の性質は、3Dで細胞の生存と増殖のためcytocompatible微小環境を提供しながら、キモトリプシン感受性のペプチド配列（の使用C GGY↓C、矢印は酵素切断部位を示している一方、端末の嚢胞アイネ残基）はチオール - エン架橋のために追加されたハイドロゲル内に形成細胞構成物の迅速な復旧を可能にします。以下のプロトコルがためのテクニックを詳しく説明します：チオール - エンヒドロゲルでMIN6β細胞の（1）カプセル化、（2）定性的および定量的な細胞生存率アッセイ細胞の生存と増殖を決定するために、（3）細胞スフェロイドの回復は、キモトリプシン媒介ゲルを用い浸食、そして回収されたスフェロイドの（4）の構造と機能の解析。

<html> 図1-4ショーカプセル化のための代表的な結果、生存、増殖、スフェロイド形成、およびチオール-エンヒドロゲルで回転楕円体の回復を図1に PEG4NBとCGGYCを使用して（1）段階成長チオール-エン光重合の反応の概略図を示し、（表面浸食のメカニズムを次の2）キモトリプシン媒介ゲル浸食。ライブ/デッド染色とAlamarBlueアッセイを使用して得られた図2?...

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Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

次のプロトコルは、チオール - エン写真クリック反応により形成された段階成長PEG-ペプチドハイドロゲルで、膵β細胞をカプセル化するための技術を提供する。この材料プラットフォームは、細胞のカプセル化のためのcytocompatible微小環境を提供していますが、また、ヒドロゲル内に形成されたセル構造のユーザ制御の迅速な復旧を可能にするだけでなく。

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K ビュー.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. 次のプロトコルは、チオール - エン写真クリック反応により形成された段階成長PEG-ペプチドハイドロゲルで、膵β細胞をカプセル化するための技術を提供する。この材料プラットフォームは、細胞のカプセル化のためのcytocompatible微小環境を提供していますが、また、ヒドロゲル内に形成されたセル構造のユーザ制御の迅速な復旧を可能にするだけでなく...

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

生物工学

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

カプセル化と 3 D の細胞の免疫染色のエラスチン様タンパク質ゲルの生産

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

多細胞スフェロイドの手頃な価格の酸素顕微鏡支援バイオファブリケーション

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...