Bu proje NIH (R21EB013717) ve IUPUI OVCR (RSFG) tarafından finanse edildi. Yazar, teknik yardım için Bayan Han Shih teşekkürler.

A. makromer ve Peptid Sentezi <ol><li> Köklü protokolleri kullanarak 4-kol PEG-norbornen (PEG4NB) ve photoinitiator Lityum arylphosphanate (LAP). 18,19 sentezlenmesi </li><li> Sentezlemek kimotripsin-duyarlı peptidi içeren bis-sisteyin CGGY ↓ C bir mikrodalga peptid sentezleyicisi (CEM Discover SPS), standart katı faz peptid sentezi ile (ok kimotripsin bölünme yeri ifade eder). <ol class="lalpha"><li> Reçine ve sentez ölçek ikame oranına göre ihtiyaç reçinesi (MBHA Rink-amid reçine) miktarı hesaplanır. 15 dakika boyunca bir reaksiyon kabına (RV) olarak dimetilformamid (DMF) içinde reçine şişer. </li><li> İzleme Fmoc-koruyan% 20 Piperidin ve DMF içinde 0.1 M HOBt ihtiva eden bir çözelti kullanılarak korumanın kaldırılması reçine grubu. Mikrodalga destekli Fmoc-korumasının giderilmesinden (bütün Fmoc-amino asit için) için, aşağıdaki tabloda listelenen parametrelerin kullanımı: <table border="1"><tbody><tr><td> Sentez ölçekli </strong&gt; </td><td> 0.1 mmol </td><td> 0.2 mmol </td></tr><tr><td> Güç </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Sıcaklık </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Zaman </td><td> 3 dk </td><td> 3 dk </td></tr></tbody></table></li><li> Deproteksiyon ardından, DMF ile reçine durulayın ve Fmoc (N-terminal amin maruziyeti) giderimi onaylamak için ninhidrin testi gerçekleştirin. Reçine 95 ° C&#39;de 2 dakika sonra mavi açmak gerekir </li><li> Başarılı bir korumanın kaldırılması, çift, aşağıdaki tabloda belirtilen parametreler ile bir aktive edici baz çözeltisi içinde C-terminali (sentezi N-terminali, C-ile çalışan) (DMF içinde 0.28 M Diizopropiletilamin (DIEA)) ilk Fmoc-amino asit sonrasında . <table border="1"><tbody><tr><td> Sentez ölçekli </td><td> 0.1 mmol </td><td> 0.2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Güç </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Sıcaklık * </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Zaman * </td><td> 5 dk </td><td> 5 dk </td></tr></tbody></table> * Kist ve O&#39;nun için, 50 ° C ve 10 dk rasemizasyonu azaltmak için kullanabilirsiniz. </li><li> Reçine durulayın ve niteliksel kaplin tamamlanması (N-terminal amin kaybolması) onaylamak için ninhidrin testi gerçekleştirin. Reçine 95 az 5 dk sonra net olmalıdır ° C Ninhidrin testi pozitif sonuç (mavi renk) dönerse kaplin adım (A.2.d) tekrarlayın. </li><li> Son bir koruma kaldırma adımı ile biten sırayla ilave amino asit için tekrarlayın deproteksiyon (adım A.2.b) ve kavrama (adım A.2.d). </li><li> , RV tahliye diklorometan içindeki 25 ml (DCM) ile reçine yıkayın. Bu adım bir üs olduğunu ve peptid dilinim engel olacaktır DMF, durulayın etmektir. </li><li> 250 m karıştırılarak yarılma kokteyli hazırlayın4.75 ml trifloroasetik asit (TFA), 0.125 ml Triisopropylsilane (TBS) ve 0.125 ml GKD 2 O. fenol g </li><li> Mikrodalga peptid synthesizer 30 dakika RV ve çatlatma içine bölünme solüsyonu ekleyin (Güç = 20 W; Sıcaklık = 38 ° C). </li><li> Vakum manifoldu kullanılarak 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne peptid solüsyonu toplayın. </li><li> 40 ml eter içinde çökelti yarılan peptid, girdap 5 dakika boyunca 3000 rpm&#39;de santrifüj tüpü ve peptid toplamak. </li><li> Süpernatant süzün ve adım A.2.k iki kez tekrarlayın. </li><li> Toplayın ve vakum peptid kurutun. </li><li> HPLC kullanarak peptid arındırın ve kütle spektrometresi ile karakterize. </li></ol></li></ol> B. Malzeme Hazırlanması ve Sterilizasyonu <ol><li> Makromer tamamen eriyene kadar PBS, girdap karışım içinde ağırlık olarak% 20 PEG4NB çözelti hazırlayın ve bir şırınga filtresi kullanılarak makromer solüsyon sterilize edin. -20 ° C (hazırlamak alikotları de sterilize çözümü MağazaUzun süreli depolama için). </li><li> PBS içinde% 2 ağ photoinitiator (LAP) çözeltisi hazırlayın ve sterilize edin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında steril çözelti saklayın. </li><li> PBS içinde peptid (CGGYC) karışımı şırınga ile sterilizasyon için çözelti filtre girdap eritilir. Tablet -20 ° C&#39;de peptide çözeltisi ve mağaza kadar (donma-çözülme döngüleri engellemek için) kullanabilirsiniz. </li><li> Tiyol (-SH) Ellman maddesi kullanılarak hazırlanan peptid çözeltideki konsantrasyonu (üreticinin protokolünü takip) belirleyin. Bu adım, tiyol-ene foto-tıklamayla reaksiyonları kullanılmak üzere peptid miktarının hesaplanması için gerekli olduğunu (yani, [SH] / 2) doğru peptid konsantrasyonunu verir. </li><li> Bir jilet (jel kaldırılması için açık ucu) kullanarak steril 1 ml tek kullanımlık enjektör üst kısmını keserek jelleşme kalıpları hazırlayın. Otoklav tarafından şırınga kalıpları sterilize. </li><li> Istenen jel formülasyonu (ene oranı = 1 tiyol) ve stok dostum konsantrasyonları dayanarakrials, polimerin gerekli hacmi, çapraz bağlayıcı peptit, foto başlatıcı ve gerekirse tampon çözeltiler hesaplar. </li></ol> C. Hücre Hazırlanması <ol><li> , Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (hücre kültür ortamı (;, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 250 ng / ml Fungizone ile Antibiyotik Antimikotik ve 50 uM β-merkaptoetanol yüksek glikoz DMEM,% 10 fetal bovin serumu içeren) dengelemek 37 HBSS, Ca2 +, Mg2 + boş), ve tripsin-EDTA ° C. </li><li> CO 2 inkübatör MIN6 β-hücreleri içeren matara çıkarın ve laminer akış kaputu şişeler yerleştirin. </li><li> Flasks hücre kültürü medya aspire ve HBSS ile hücre durulayın. </li><li> 2X, 3 ml (% 0.1) Tripsin-EDTA kullanılarak hücrelerin Trypsinize ve 37 dakika süreyle 4 ° C&#39;de inkübe şişeler ve% 5 CO2. <ul><li> Not: Kullan 2X tripsin solüsyon tek hücre süspansiyonu haline MIN6 β-hücrelerinin tam ayrışma sağlar. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> İnkübasyondan sonra, tamamen hücreleri ayırmak için hafifçe başlık yüzeyi üzerinde şişeler dokunun. Bir mikroskop kullanılarak hücrelerin dekolmanı ve disosiyasyon onaylayın. </li><li> Tripsin nötralize etmek için hücre kültürü ortamı, eşit hacim ekleyin. Yumuşak pipetleme ile iyice karıştırın çözelti, daha sonra 1000 rpm&#39;de 5 dakika için standart tüp ve santrifüj ile karışım aktarın. </li><li> Süpernatant aspire ve yavaşça 4 hücreleri yeniden askıya - kültür ortamı 5 ml. </li><li> Hemasitometre% 50 Tripan mavisi tampon kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin. </li></ol> D. Hidrojel Fabrikasyon ve Hücre Kapsülleme <ol><li> Hücreler hazır edildikten sonra, karışım (ene oranı 1:1 &#39;lik bir tiyol göre) PEG4NB, CGGYC LAP, hücre solüsyonu ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde HBSS arasında gerekli miktarlar. </li><li> Nazikçe homojen bir karışım elde edilir ve bir şırınga kalıp ile ortaya çıkan solüsyon 25 ul eklemek için bir pipet kullanılarak çözelti karıştırılır. UV ışık (365 şırınga Açığanm, 2 dakika için 5 mW / cm 2). </li><li> Aşağıda, fotopolimerizasyon, steril bir 24 oyuklu plaka içeren bir hücre kültür ortamı içine dalma jeller ve 37 hidrojeller inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> 30 gevşek tutturulmuş hücreler durulayın dk ve un-çapraz makromerleri için hücre kültürü ortamında hücre yüklü hidrojellerin yıkayın. Taze ortama jeller aktarın. </li><li> Yenile hücre kültürü ortamı her 2 ila 3 gün. </li></ol> E. Hücre Canlılık Testi Kapsüllü hücre morfolojisi (sentezlenmiş hidrojeller şeffaf olduğu için) ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Hücre canlılığı görüntülendi ve Ölü / canlı boyama kullanılarak ve nicelik AlamarBlue reaktifi kullanarak nitel ölçülebilir. E.1. Ölü / canlı boyama <ol><li> Oda sıcaklığında Ölü / canlı boyama reaktifleri çözülme. </li><li> Kurallı bir tüp içinde lekeli olmak için numune sayısı (n) göre PBS ekleyin: PBS = n&gt; toplam hacmi × 500 ul </li><li> Calcein AM ve PBS içeren standart tüp için PBS içinde 1 mL başına EthD-1, 2 ul pipetle 0.25 ul. Bileşenlerini karıştırmak için Vortex çözüm. </li><li> Bir orbital çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında 1 saat için canlı / Ölü boyama çözeltisi içinde hücre-yüklü hidrojeller (0.5 ml / numune) inkübe edin. </li><li> Bir Pasteur pipeti kullanarak, boya çözeltisi kaldırmak ve PBS ile iki kez durulama örnek. </li><li> Bir kapak kayma veya cam slayt üzerine örnek yerleştirin. Gözlemleyin ve konfokal mikroskop kullanılarak görüntü hücreleri. </li></ol> E.2. AlamarBlue Assay <ol><li> 10 v / hücre kültürü ortamında v% AlamarBlue çözeltisi hazırlayın. </li><li> Inkübatör hidrojellerin çıkarın ve hidrojel ile herhangi bir temas olmadan her kuyudan medya üzerinden aspire. </li><li> 16 saat boyunca% 10 AlamarBlue çözelti 500 ul hücre-yüklü hidrojeller ve içi boş bir kuyu (negatif kontrol) inkübe edin. </li><li> Pipet 200 ul, inkübasyon sonrasındabir mikroplaka okuyucusu (560 nm, emisyon: 590 nm&#39;de eksitasyon) kullanılarak 96 oyuklu plaka ve floresan ölçümü olarak AlamarBlue çözeltisi eklendi. <ul><li> Yükseköğretim hücresel metabolik aktivitesi yüksek floresans okuma vermek için boya azaltır. </li><li> Boşluk olarak% 10 Alamarblue çözüm en az iki kuyu dahil ettiğinizden emin olun. Verileri analiz ederken, örneklerin floresans okuma ortalama boş floresans değeri çıkarmak. </li></ul></li></ol> F. kimotripsin Jel Erozyon ve Sfero Kurtarma Yönlendirilen <ol><li> HBBS ve steril filtre çözelti içinde serbest Tripsin-α-kimotripsin çözeltinin 1 mg / ml hazırlayın. </li><li> Tam erozyon jel elde edilene kadar hafif bir sallama ile oda sıcaklığında kimotripsin çözelti, hidrojel (her bir jel için 500 ul) inkübe edin. <ul><li> 25 ul jel için, tam erozyon süresi yaklaşık 5 dakikadır. </li></ul></li><li> Faaliyet azaltmak için birkaç dakika buz üzerinde plaka yerleştirinkimotripsin. </li><li> 2 dakika için 300 rpm&#39;de 1 ml tüp ve santrifüj içinde hücre çözelti, 4 ° C aktarın. </li><li> Dikkatlice bir mera pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve yavaşça HBSS içinde sferoidler tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 24-plaka olarak kurtarılan spheroid çözümü aktarın ve sferoidler yerleşmek için izin vermek için buz üzerinde plaka yerleştirin. </li><li> Boyut analizi için, ışık mikroskobu kullanılarak yerleşmiş sferoidlerin faz kontrast görüntüler elde. Tedbir gibi Nikon Eleman yazılım veya ImageJ gibi yazılımları kullanarak spheroid çapları kurtarıldı. </li></ol> Kurtarılan sferoidlerin G. Fonksiyonel Tahlili G.1. Kurtarılan hücre sferoidler gelen glikoz uyarılmış insülin sekresyonu <ol><li> 24 çukurlu bir plaka içinde, 1 saat boyunca 2 mM glukoz Kerbs-Ringer tampon maddesi (KRB) 500 ul içinde jeller inkübe edilir. </li><li> Jel aşındırın ve F.6 adımları F.1 kullanarak cep sferoidler kurtarabilirsiniz. </li><li> Herhangi yapmadan dikkatlice süpernatant aspirehücre sferoidler temas ve 2 mM glukoz KRB 500 ul sferoidler tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 0.6 ml tüp hücre parçacıklarının küresel çözüm 100 ul aktarın ve hücre içi ATP ölçümü için buz üzerine yerleştirin. </li><li> Yarı kalan hücre küremsi çözeltisi (iki mikrosantrifüj tüpleri içine) bölünmüş ve 300 rpm, 4 az 2 dakika süreyle santrifüj ° C. </li><li> Aspire süpernatant (hemen hemen altına) ve 2 mM glikoz düşük KRB 1 ml 25 mM yüksek glikoz KRB ve ikinci yarım, 1 ml hücre parçacıkları arasında birinci yarı tekrar süspansiyon. </li><li> Yavaşça 24-plaka kurtarıldı cep sferoidler içeren çözelti Pipeti ve aktarmak. 37, 1 saat boyunca plaka inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> İnkübasyondan sonra, 2 dakika 1,000 rpm&#39;de ve 4 ° C için bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj ile çözelti aktarmak </li><li> Insülin için 4 başka bir mikrosantrifüj tüp ve mağaza ° C santrifüje tüpten 500 ul aktarınELISA. </li><li> Insülin ELISA aşağıdaki üretici protokolünü uygulayın. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Assay <ol><li> ATP standartları: 10 uM ATP çözeltisi hazırlayın ve 8 standart çözümleri bir dizi elde etmek için seri dilüsyonları gerçekleştirin. </li><li> Beyaz bir 96 kuyulu plaka 50, hücre küremsi çözeltisi ul (adım G.1.6) ve standartlar ekleyin. </li><li> Her bir oyuğa içeren örnekler ve standartlar için, CellTiter Glo reaktif 50 ul ekleyin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sonrasında, bir mikroplak okuyucu ve ATP standartlarına göre üretilen bir lineer regresyon eğrisi kullanarak kalibre örnek ATP konsantrasyonları kullanılarak örneklerin ve standartların ölçü lüminesans sayımı. </li><li> Örnekteki toplam ATP konsantrasyonunu belirleyin ve bir hücre yüklü hidrojel hücre içi ATP konsantrasyonu elde etmek için numune seyreltme faktörü ile çarpın. </li></ol> G.3. Insülin salınımı belirleyin <ol><li> Amou hesaplayıninsülin nt düşük glikoz ortamda salgılanan insülin miktarı yüksek glikoz orta salgılanan insülin miktarı oranı alınarak geri kazanılmış sferoidler salgılanır. </li><li> Kurtarılan hücre parçacıkları arasında intrasellüler ATP ilgili tutar ile hücre parçacıkları arasında sayılabilir insülin içeriği Normalize. </li></ol>

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine.">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li><li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+in+controlled+release+formulations:+network+design+and+mathematical+modeling.">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li><li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions.">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li><li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+elastase+responsive+delivery+from+poly(ethylene+glycol)+hydrogels.">Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).</li><li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+beta-cell+microenvironments.">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments.</a> Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).</li><li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids.">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells.">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+mimicry+with+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function.">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li><li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5'-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway.">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li><li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function.">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li><li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides.">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li><li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K-sensitive+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption.">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li><li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly(ethylene+glycol)+diacrylate+hydrogels.">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li><li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+of+poly(ethylene+glycol)+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis.">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li><li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-ene+click+chemistry.">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li><li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-click+chemistry:+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis.">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li><li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization.">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005 (2009).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li><li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly(ethylene+glycol)+hydrogels.">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Açıklanan protokol adım büyüme fotopolimerizasyon oluşturduğu tiyol-ene hidrojeller hücrelerin kolay kapsülleme ilgili ayrıntılar sunuyor. Tiol fonksiyonel grupların norbornen 1:1 bir stokiyometrik oran bu protokolde kullanılan iken, oran deneyler bağlı olarak ayarlanabilir. Doğru formülasyon ilave olarak, bu ön-polimer solüsyonu içinde homojenlik sağlamak için önemlidir. Özellikle, jel özellikleri hücre ve varyasyon topaklanma önlemek için çok hücre iyi ön polimer çözeltisi içinde dağ...

Hidrojeller. Tamir ve rejenere dokular için iskele malzemesi olarak olağanüstü potansiyele sahip hidrofilik çapraz polimerlerdir hidrojellerin 1-3 su içeriği yüksek oksijen ve hücre canlılığı korumak için çok önemlidir her hangi besin ve hücresel metabolik ürünlerin, değişimi kolay difüzyon verir. Buna ek olarak, hidrojel kontrollü serbest bırakma ve yüksek tunability bağlı olarak hücre dağıtım için mükemmel taşıyıcılar. Örneğin poli (etilen glikol) (PEG) gibi hazırlanan 2 sentetik hidrojel artan bir şekilde büyük ölçüde onların cytocompatibility için, doku mühendisliği uygulamalarda kullanılır, doku malzemelerin fiziksel ve mekanik özellikleri gibi esneklik ve yüksek tunability. 4-6 Yaygın olarak kullanılan bir hidrojel platformu rağmen, çalışmalar zincir büyüme photopolymerizations oluşturduğu PEG diacrylate (PEGDA) hidrojellerin kapsüllü hücreleri Duri zarar eğilimi olduğunu göstermiştirng ağ çapraz ve yerinde hücre encapsulation. 7 hücresel hasarı büyük ölçüde hidrojeller içine kroslink polimer zincirleri PEGDA üzerine vinil gruplar aracılığıyla yaymak photoinitiator molekülleri tarafından oluşturulan radikal türleri bağlandı. Ne yazık ki, bu radikal türleri de özellikle pankreatik β-hücreleri gibi radikal duyarlı hücreler için, hücre kapsülleme sırasında stres ve hücre hasarına neden. 8-10 amacıyla daha iyi difüzyon ve hücre canlılığı, yüksek molekül ağırlıkları PEGDA için daha yüksek bir mesh boyutu elde etmek için genellikle hücreye yoğunlaştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, bu polimerizasyon kinetiğini bozmakta ve sub-optimal jel biyo-fiziksel özelliklere yol açmaktadır. 7,11,12 yukarıda bahsedilen dezavantajlara ek olarak, bağlı bir heterojen ve non-parçalanabilir olmaları PEGDA hidrojeller elde edilen hücre yapıları geri kazanılması için çok zordur Çapraz bağlı ağ. Proteaz-duyarlı peptidler dahil edilebilirkenenzimatik yarılma duyarlı aksi asal PEGDA hidrojeller işlemek için PEG makromer omurga içine, konjugasyon genellikle pahalı reaktifler kullanır ve çıkan ağlar nedeniyle hala zincir polimerleşme doğası heterojenlik yüksek derecede içerir. 13-15 Son zamanlarda, adım-büyüme tiyol-ene fotopolimerizasyon yoluyla oluşmuş PEG-peptid hidrojeller zincir büyüme fotopolimerizasyon oluşan hidrojeller fazla hücre kapsülleme için tercihli özelliklerini gösterdikleri oylandı. Tiyol-ene hidrojellerin 7 üstün jelleşme kinetiği &#39;tık atfedilir tiyol ve ene işlevleri arasındaki reaksiyon &#39;doğası. PEGDA zincir-büyüme polimerizasyonu ile karşılaştırıldığında, tiyol-ene reaksiyonu olan hızlı jelleşme oranı ile sonuçlanır. Daha az oksijen 16,17 Tiyol-ene hidrojeller de yüksek polimerizasyon verimi ve zincir-büyüme PEGDA hidrojeller, 7 göre daha iyi jel biyofiziksel özelliklere sahip inhibe edilir , 18 &lt;/ Sup&gt; hangi fotopolimerizasyon sırasında radikal türlerinin neden sınırlı hücresel hasar ile sonuçlanır. Daha önce, tiyol-ene hidrojeller 4-kol, PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve bu gibi bis-sisteyin içeren peptit çapraz bağlayıcılar, oluşan proteaz-duyarlı peptidler hücre kapsülleme için kullanılmıştır. PEG hidrojel ağların 7,18 yüksek tunability bir sunmaktadır hücre canlılığı ve etkinliği araştırmak için esnek ve kontrol edilebilir 3D mikroçevrede, proteaz duyarlı peptid dizisi kullanımı hidrojeller içinde doğal olarak oluşan hücre yapıları kurtarma için hafif bir şekilde sağlıyor. Bu protokolü biz 4-kol PEG-norbornen (PEG4NB) ve MIN6 β-hücre kapsülleme için kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGY ↓ C) kullanarak fabrikasyon adım büyüme photopolymerized tiyol-ene hidrojeller kullanmaktadır. Bu protokol sistematik MIN6 hayatta kalma, proliferasyon ve sfero oluşumunu incelemek için teknikler ayrıntılandırdığıtiyol-ene Hidrojellerde β-hücreleri. Biz daha fazla β-hücre spheroid kurtarma ve iyileşti sferoidlerin biyolojik karakterizasyonu için bir yöntem sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 4-kol PEG (20kDa) </td><td> Jenkem Teknolojisi ABD </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-amino asit </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ölü / Canlı hücre canlılığı kiti </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Calcein AM ve Etidyum homodimer-1 içerir </td></tr><tr><td> AlamarBlue reaktifi </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo reaktifi </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Ca +2 ve Mg +2 olmadan </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> OlmadanCa +2 ve Mg +2 </td></tr><tr><td> Yüksek Glikoz DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-serbest α-kimotripsin </td><td> Worthington Biyokimyasal Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Fare Inusin ELISA kiti </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml tek kullanımlık şırınga </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Hidrojeller kültürleme terapötik açıdan anlamlı hücreleri veya dokuları için esneklik ve yüksek düzeyde geçiş doku gibi olan bir üç-boyutlu, çapraz bağlı hidrofilik mikroçevrede sağlamak polimerlerdir. Poli (etilen glikol) (PEG) türevi kullanılarak hazırlanmıştır Hidrojeller giderek artan bir şekilde ayarlanabilir ve cytocompatible özellikleri nedeniyle kısmen, doku mühendisliği çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır. Bu protokol, pankreas MIN6 b-hücrelerinin kapsüllenmesinde PEG-peptid hidrojeller imal tiyol-ene adım büyüme photopolymerizations kullanılmıştır. Jeller 4 kollu PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGYC) tarafından oluşturulmuştur. PEG hidrofilik olmayan kirlenme doğa, 3D hücre canlılığı ve çoğalma için cytocompatible mikroçevrede sunarken kimotripsin duyarlı peptid sekansı (kullanımı C GGY ↓ C, ok enzimi bölünme yeri gösterir iken terminali kisteine artıkları) tiol-ene çapraz bağlama için ilave edildi içinde hidrojel oluşturan hücre yapıları hızlı bir iyileşme sağlar. Aşağıdaki protokol için teknikler ayrıntılarına: tiyol-ene hidrojeller olarak MIN6 β-hücrelerinin (1) Kapsülleme, (2) nitel ve nicel hücre canlılığı deneyleri hücre hayatta kalma ve çoğalma belirlemek için, (3) hücre parçacıkları arasında Recovery kimotripsin-aracılı jel kullanılarak erozyon ve kurtarılan sferoidlerin (4) yapısal ve fonksiyonel analiz.

<html> Rakamlar kapsülleme, hayatta kalma, proliferasyon, sfero oluşumu ve tiyol-ene Hidrojellerde spheroid kurtarma için 1-4 gösterisi temsilcisi sonuçlar. Şekil 1 PEG4NB ve CGGYC kullanarak (1) adım büyüme tiyol-ene fotopolimerizasyon reaksiyonu şematik ve ( Bir yüzeye erozyon mekanizması aşağıdaki 2) kimotripsin aracılı jel erozyonu. Canlı / Ölü boyama ve AlamarBlue testi kullanılarak elde edilen Şekil 2 ve 3 mev...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Recovery of Î²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels at JoVE.com

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K Görüntüleme.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Video: Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

Biyokimya

Fabrikasyon ve ardından tümör sferoidlerinin PEG hidrojellerinde 3D kapsüllenmesi

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth. Here, we designed an in vitro 3D glioblastoma model for spheroid encapsulation to mimic the tumor extracellular microenvironment. First, we formed square pyramidal microwell molds using polydimethylsiloxane. These microwell molds were then used to fabricate tumor spheroids with tightly controlled sizes from 50-500 &#956;m. Once spheroids were formed, they were harvested and encapsulated in polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels. PEG hydrogels are a versatile platform for spheroid encapsulation, as hydrogel properties such as stiffness, degradability, and cell adhesiveness can be tuned independently. Here, we used a representative soft (~8 kPa) hydrogel to encapsulate glioblastoma spheroids. Finally, a method to stain and image spheroids was developed to obtain high-quality images via confocal microscopy. Due to the dense spheroid core and relatively sparse periphery, imaging can be difficult, but using a clearing solution and confocal optical sectioning helps alleviate these imaging difficulties. In summary, we show a method to fabricate uniform spheroids, encapsulate them in PEG hydrogels and perform confocal microscopy on the encapsulated spheroids to study spheroid growth and various cell-matrix interactions.

Yazar Spotlight: Glioblastoma Mikroçevre Çalışması için İn Vitro Hidrojel Modeli

Here, we present a protocol that enables fast, robust, and cheap fabrication of tumor spheroids followed by hydrogel encapsulation. It is widely applicable as it does not require specialized equipment. It would be particularly useful for exploring spheroid-matrix interactions and building in vitro tissue physiology or pathology models.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi