仕事はフィラデルフィアの小児病院から研究所開発賞によってサポートされています。

1。クロスリンククロマチン<ol><li> 100x20mm細胞培養皿で細胞を成長させる。細胞の量は、1〜細胞型に応じてディッシュあたり10万個の細胞の範囲とすることができる。約200万個の細胞は、一免疫沈降のために十分である。 </li><li>時折揺らしながら室温で10分間、1％ホルムアルデヒドでクロスリンク細胞。 </li><li>室温で5分間、125mMのグリシンとインキュベートの最終濃度を加えることによって架橋をクエンチ。 </li><li> 1Xリン酸で細胞を洗浄すると、二回デカントPBSを緩衝生理食塩水（PBS）、次にPBS 0.2 mlを加える。 </li><li>マイクロ遠心チューブにプラスチックセルスクレーパーで細胞を回収。 </li><li> 4で5分間2,000 rpmで、細胞をスピンダウン℃まで</li><li>上清を吸引。全細胞溶解用SDS溶解バッファーで再懸濁した細胞（1％SDS、10mMのEDTA、50mMのトリス-HCl pHは8.1）、またはそれらの核の抽出のためのペレットとして保つ。 </li><li>細胞を-80℃で保存することができます°Cまたは1つはimmediatを進むことができます超音波処理とイーリー。 </li></ol> 2。 （全細胞溶解のために3.5に進みます）核を準備<ol><li>各実験では、1Xプロテイナーゼ阻害剤と細胞溶解バッファー（5mMのパイプpH8.0で、85のKCl、0.5％NP-40）を補う。 </li><li>約10倍の細胞溶解バッファーでペレットボリュームで解凍細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>乳棒で10回ダウンス·均質化し、10分間、氷上でインキュベートする。 </li><li> 4°Cで5分のために4,000 rpmで遠心し、上清を廃棄し、核ペレットを保存します。 </li></ol> 3。超音波処理* <ol><li> SDS溶解バッファーとプロテイナーゼ阻害剤で使用するバッファの補充量をウォームアップ。 </li><li> SDS溶解バッファーで再懸濁し核ペレット（1-10万個の細胞あたりのバッファの約0.5ml）を</li><li>氷上で10分間インキュベートする。 </li><li>マイクロチューブにサンプル0.5mlのアリコートを追加します。 </li><li> 30秒で、45秒でMisonix超音波処理を用いたウェット、氷上で超音波処理オフ2の振幅設定で。理想的な断片サイズサイクル数は、第さまざまなサイクル数（例えば2、4、8、12、16、20サイクル以上）を試すことによって決定することができる。超音波処理装置の別のブランドは、しかし、条件は異なります使用してもよい。サイクル時間と量のオンとオフの数は実験が理想的な条件を決定するために行わなければならない。 </li><li>超音波処理の結果を確認すると、定量化を行うために、各サンプルの20μlのを収集します。試料の残りを-80℃で保存することができる</li><li> 0.1X TEバッファー30μlのを追加することによって、試料の20μlの希釈する。 </li><li> RNaseを1μlの試料を扱う37℃で1時間℃で、その後2時間62℃でプロテイナーゼKとインキュベートを1μlを追加します。 </li><li> 2％アガロースゲルでサンプルを20μlを実行します。 </li><li>次に光度計、分光光度計を用いて定量化するQIAクイックPCR精製キットを用いて試料の残量を精製する。 </li></ol> *ネイティブCHIについてP、microccocalヌクレアーゼ消化を剪断するDNAを用いてもよい。 4。ブロックアガロースビーズ* <ol><li>ビーズがすでにブロックされている場合、5.1に進みます。 </li><li>プロテインAまたはプロテインGアガロースを使用してください。 5免疫沈降（IPアドレス）の場合、50％ビーズスラリー（300μlのビーズペレット）600μlのを使用</li><li>ビーズを洗浄するために、4℃で1分間800回転でそれらをスピンダウンし、上清を捨てる。ゆっくり反転チューブが10倍で2ミリリットルチップ希釈バッファー（0.01％SDS、1.2mMのEDTA、167 mMのNaClを、1.1％トリトンX-100、16.7 mMのトリス-HCl pHは8.1）とのミックスよりも少し追加します。 4℃で1分間800回転で再びスピンダウンし、上清を捨てる。洗濯2回以上繰り返します。 </li><li>ブロッキング溶液に4℃で一晩回転させることによって、ビーズをブロックします。ブロッキング溶液のレシピについては、表1を参照してください。 </li></ol> 5。プリ明確なクロマチン<ol><li>雪解けは、氷の上でクロマチンを超音波処理した。 </li><li> 12,000 rpmでfでスピンダウンまたは4で10分間°C次にSDS（ホワイトペレット）を除去するためにすぐに氷の上に置く。 </li><li>上清を収集し、ペレットを廃棄し、必要に応じてサンプルを結合。 </li><li>計算（IPあたりのクロマチンの1-10 UG）に基づいて、実験に必要な量を取り出します。 </li><li>プロテイナーゼ阻害剤で補充ChIPの希釈バッファーで10倍クロマチンを希釈。 </li><li> IPごとブロックされるビーズを100μlを加える。 </li><li> 1時間4℃で回転させます。 </li></ol> 6。免疫沈降<ol><li> 1分間800回転でサンプルをスピンダウンし、上清を新しいチューブに移す。 </li><li> 1分と別のきれいなチューブへの転送のために800rpmで上清をスピンダウン。 </li><li> -20℃で、入力制御として機能するように、上清20μlのを保存</li><li>実験で行われるIPアドレスの数にアリコートクロマチンを。 </li><li>各サンプルにクロマチンの1-10 UGあたりの抗体の2 UGを追加します。 </li><li>回転に一晩4℃でインキュベートする。 </li><li>各IPサンプルにブロックされてビーズを100μlを加える。 </li><li> °C回転に4℃で1時間インキュベートする。 </li><li>ペレット1分間800 rpmでスピンダウンし、できるだけ上清の限りを捨てることによってビーズ。 </li><li>低塩免疫複合体の洗浄緩衝液で一回ビーズを洗浄。各チューブに緩衝液1mlを加え、5-8分間室温で回転、1分間800 rpmでスピンダウンし、上清を捨てる。 5回洗浄した（ 表2）の合計のためTE緩衝液で2回高塩免疫複合体の洗浄バッファーとLiClを免疫複合体の洗浄緩衝液で1回洗浄して繰り返します。 </li></ol> 7。溶出<ol><li>前日から解凍入力サンプルは、溶離液で処理することができます。 </li><li>溶出バッファー新鮮（ 表3）を作成します。 </li><li> IPと入力制御サンプルプラス1-2余分なサンプルのために必要な十分な溶出バッファーのマスターミックスを作る。 </li><li>各IPサンプルに100μlの溶出バッファーを追加し、15メートルのために室温でインキュベート回転にした。 </li><li> 1分間800 rpmでスピンダウンし、新しいチューブに上清を追加します。 </li><li>ビーズの各チューブに溶出バッファーの別の100μLを加え、回転で15分間室温でインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後15秒間ボルテックスし、1分間5,000 rpmでスピンダウンし、その後最初の溶出​​からの上清を上清兼ね備えています。 （不明な場合は、1分間5,000 rpmで再び上清をスピンダウン。ない上清中のビーズ上の残っていることを確認し、新しいチューブに上清を回収。 </li><li>入力制御サンプルの20μlに溶出バッファー180μLを加える。 </li></ol> 8。クロスリンクを逆転<ol><li>溶離液と入力コントロールの200μlに、5 M NaClを8μLを加える。 </li><li> 65℃で一晩水浴中でパラフィルムとインキュベートとシールチューブ。 </li></ol> 9。 DNA精製<ol><li> 37℃で1時間のRNase Aを1μlを各サンプルを扱う℃に</li><li> 4μを追加0.5 M EDTA、8μlの1Mトリス-HCl、ミックス、lのはその後2時間45℃で各サンプルとインキュベートするプロテイナーゼKを1μlを追加します。 </li><li> QIAクイックPCR精製キットを用いて試料を精製する。サンプルは-20℃で保存することができ℃、PCR検査は後日に行うことができます。 </li></ol> *あるいは、ChIPのグレードの磁気ビーズ免疫沈降部分にアガロースの代わりに使用することができる。 10。 PCR検査<ol><li> PCR検査のために、目的のタンパク質によって結合することが知られている領域のためのプライマーを使用する。また、ネガティブコントロールとして非結合領域のためのプライマーを使用しています。 </li><li>反応のための試薬を混ぜる。 1:100（ 表3）で入力サンプルを希釈する。 </li><li>反応を実行します。 PCRプログラム： </li></ol> 手順1：94℃3分 ステップ2：94℃20秒 59℃で30秒 72℃30秒 （少なくとも30 CYCLためのステップ2を繰り返します。ES） ステップ3：72℃2分<ol start="4"><li> 1％アガロースゲルでサンプルを実行する。 </li><li>濃縮はまた、リアルタイムPCRにより定量的に決定することができる。 </li></ol>

<ol>
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M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. 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Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ごく最近他の転写因子2,3で実証されているように、それは、現在のChIP-以降を用いてタンパク質-DNA相互作用アソシエーションのゲノムワイドなプロファイルを行うことが可能である。成功したシークエンシングの結果への鍵は、高品質のクロマチン免疫沈降DNAテンプレートの生成である。 DNAテンプレートが生成され、適切に濃縮されたことが確認された後、一?...

長年にわたり、特に所定のタンパク質のゲノムワイド、転写因子のクラスのものに拘束され、規制を受けた遺伝子のセットを識別するために満たされていない必要があった。 オドムら 1は、系統的にヒト肝及び膵島であらかじめ指定された転写調節因子によって占有された遺伝子を同定するためのプロモーターマイクロアレイと結合しクロマチン免疫沈降（チップ）を使用しました。その後、ジョンソンら 2総合的全体哺乳類ゲノムにわたるタンパク質-DNA相互作用をマッピングするために直接超高スループットDNAシークエンシング（チップ-SEQ）に基づく大規模なクロマチン免疫沈降アッセイを開発しました。テストケースとして、彼らは、生体内でヒトゲノムに1946の場所にニューロン制限サイレンサー因子（NRSF）の結合をマップしました。 iの両方を促進結合位置のシャープな解像度（+ 50塩基対）を表示されたデータ、モチーフとNRSF結合モチーフの同定ゾル化。これらのChIP-seqのデータはまた、高感度、特異性および統計的信頼度（P &lt;10 -4）、新しい候補の相互作用を推定するために重要である特性を有していた。 ロバートソンら 3もでSTAT1ターゲットをマッピングするためにのChIP-seqのを使用したインターフェロン-γ（IFN-γ）で刺激し、 生体内でのヒトのHeLa S3細胞を刺激していない。のChIP-seqのことで、15.1と1290万一意にマッピングされたシーケンスが読み取り、0.001未満の推定偽発見率を使用して、彼らはそれぞれ、刺激し、刺激されていない細胞では41582と11004推定STAT1結合領域を同定した。 STAT1インターフェロン応答性結合部位の4-8を含むことが知られている34の遺伝子座のうち、チップseqが24（71％）を発見。のChIP-seqのターゲットは知らSTAT1結合モチーフに類似した配列に富んでいた。 2既存のChIP-PCRデータとの比較が示唆セットのChIP-seqの感度は70％と92％の特異性との間であったことは、少なくとも95％であった。さらに、それは、チップseqの深さを配列とともに増加低く、分析の複雑さと感度の両方を提供することが明らかになった。 このように、 &quot;次世代の&quot;ゲノムシーケンシング技術は、費用対効果的に古い技術9経由で生成することができます順序の量の大きさの増加の1-2注文を提供します。のChIP-seqの方法は、したがって、直接哺乳類タンパク質-DNA相互作用の3の効果的プロファイリングに全ゲノムカバレッジを提供。 2006年には、転写因子2 7-様（TCF7L2）2型糖尿病と遺伝子の変異の強い関連は10を発見されました。他の研究者は、すでに独立して自然 11,12年に出版、2型糖尿病の最初のゲノムワイド関連研究から、興味深いことに、さまざまな民族ではこの知見を複製しています</s他の場所で&gt;、 科学 13-15と16,17アップ、最強協会はTCF7L2と確かにあったが、これは今では2型糖尿病の中で最も重要な遺伝子の発見は18-20をこれまでに考えられている。また、TCF7L2は癌リスク21,22にリンクされている;大腸癌を含む癌の数、のゲノムワイド関連研究によって明らかになった8q24の軌跡は、極端なアップストリームに起因することが示されたときに確かに、この接続がより明らかになりましたTCF7L2結合要素はMYC 23,24の転写を駆動する。このように、この重要な転写因子によって調節下流の遺伝子を決定することに大きな関心がある。 方法論の例としてTCF7L2と経験をもとに、本論文では、高品質のチップのDNAテンプレートを生成する方法を概説します。チップは高レゾールを構築するために、後続の配列決定のために、HCT116、結腸直腸癌細胞株において行った複雑な形質の病因におけるその重要な役割にさらなる洞察を得るための努力でTCF7L2 25により拘束遺伝子のutionマップ。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

クロマチン免疫沈降（ChIPの）を組み合わせて、超並列配列決定は、in vivoでの転写因子によって結合哺乳類のDNA配列のレパートリーを識別するために利用できる場所のChIP-シーケンシング（のChIP-seqの）メソッドを直接、全ゲノムカバレッジを提供する。 &quot;次世代&quot;ゲノムシーケンシング技術は、費用対効果的にこうして直接哺乳類の効果的なプロファイリングに全ゲノムカバレッジを提供するためのChIP-seqの方法を可能に古い技術の上に生成することができます順序の量で大きさの増加1-2受注を提供タンパク質-DNA相互作用。 成功したChIP-seqのアプローチの場合、人は最高のシークエンシング結果を得るために、高品質のチップDNAテンプレートを生成する必要があります。説明はすなわち最も強く、2型糖尿病の病因に関与する遺伝子のタンパク質産物の経験、転写因子の転写因子7のような2（TCF7L2に基づいています）。この因子はまた、種々の癌に関与している。 概説病因におけるその重要な役割にさらなる洞察を与えて、TCF7L2によって結合する遺伝子を決定するために配列決定を介して高解像度のマップを構築するために、HCT116、結腸直腸癌細胞株に由来する高品質のChIP DNAテンプレートを生成する方法である複雑な形質の。

クロマチンは、超音波処理されており、RNアーゼおよびプロテイナーゼで処理された後、2％アガロースゲル上で実行するサンプルは、所望の大きさのDNAの大部分でスメアを提示しなければならない。いくつかの異なるサイクルが試験される場合、サイズが徐々に減少がサイクル数が増加する（ 図2）として見られるべきである。 プロトコルの免疫沈降部が完?...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K ビュー.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

生物学

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...