メーターで計られたマウスから分離された褐色脂質組織のエステルおよび非エステルタンパク質の両方の効率的なChIPシーケンシングを行うために使用されます。この技術の主な利点は、プロトコルが脂質組織からのクロマチン関連複合体の効率的な免疫沈降のために最適化されたことである。切開前に、安楽死させたマウスに70%エタノールをスプレーします。
背中を上に向けてマウスを置き、首に沿って切開します。次に、BATを肩の間の皮膚の真下に配置し、慎重に白い脂肪の薄い層を除去する。1%ホルムアルデヒドを15分間室温で15分間含有するPBSの10ミリリットルの各BATパッドをクロスリンクする。
15分後、BATに2.5モルグリシンを加えて交差リンクをクエンチし、最終的に125ミリモル濃度を得た。シェーカーの上に5分間置き、室温で150 RPMで回転させます。その後、BATパッドを500マイクロリットルの低張性リシスバッファーに移し、BATパッドごとに2つのステンレスビーズを追加します。
次いで、ビーズベースの組織ホモジナイザーを使用して、組織を細断する。最大電力で5分から始めます。必要に応じて、組織が均質化され、単一の細胞が分離されるまで時間を延長します。
サンプルを新しいチューブに移し、16,000 Gで摂氏4度で遠心分離機を10分間転送します。10分後、上清を新しいチューブに移し、細胞ペレットを氷の上に置きます。浮動細胞の損失を防ぐために16,000 Gで摂氏4度で上澄み物を遠心分離します。
次いで、最終的な上清を捨て、両方の細胞ペレットを1回プロテアーゼ阻害剤で300マイクロリットルのSDSライシスバッファーに一緒に再懸濁します。氷の上で10分間インキュベートします。次に、ライセートを超音波処理し、200〜500塩基対のDNA断片を長く生成する。
超音波処理の後、摂氏4度で16,000 Gで10分間遠心分離によって破片を取り除きます。免疫沈降を行うために、Chromatin溶液の1%をChIP入力として脇に置き、一晩で4°Cに入力を保ちます。次に、ChIP抗体を1ミリリットルのクロマチン溶液に添加し、同じ種の対応する免疫前IgGまたは正常IgGとの並列免疫沈降を行う。
あるいは、抗体コントロールを使用しないクロマチン溶液を1ミリリットル保存します。回転と摂氏4度で一晩インキュベート。免疫複合体を収集するには、50マイクロリットルのプロテインAアガロースを免疫複合体に50マイクロリットル加え、150RPMでの回転で摂氏4度で1時間インキュベートする。
1時間後、摂氏4度で1000倍Gで1分間遠心分離によりビーズをペレット化する。低塩洗浄バッファーの500マイクロリットルで列にビーズを転送することにより、増加するストリンジェンシーのバッファーを持つ0.45マイクロメートルPVDF遠心フィルターカラム上のビーズの順次洗浄を実行します。次いで、2500Gで3分間列にビーズをペレットにし、フロースルーを破棄する。
低塩洗浄手順に従って高塩洗浄バッファーで洗浄を繰り返します。次に、塩化リチウムで手順を繰り返し、最後に1回のTEで繰り返します。この剤を焼き終えた後、カラム内のペレットビーズに300マイクロリットルの溶出バッファーを加えて免疫複合体を溶出させる。400 RPMのシェーカーで室温で30分間インキュベートします。
続いて、2500Gでカラムを3分間回転させて、新鮮なチューブにエルテを回収する。一晩摂氏65度で収集されたエルテと入力をインキュベートして、クロスリンクを逆にします。DNAを回収するには、300マイクロリットルのフェノールクロロホルムIAAをエルトに加え、1対1の比率で入力し、渦を10秒間入力します。
次に、摂氏4度で21,000Gで20分間スピンダウンします。ペレットを保持し、上清を捨てます。ペレットを冷たい70%エタノールの1ミリリットルで洗います。
その後、摂氏4度で21,000Gで5分間スピンダウンします。上清を捨て、ペレットを空気乾燥させます。さらに手順を行うため、ペレットを70マイクロリットルのDNAseフリー水で再懸濁します。
野生型またはGPS2-Aノックアウトマウスから分離されたBATを用いたChIP Q PCRの例を以下に示します。異なる細胞株における核コードミトコンドリア遺伝子の発現にGPS2が必要であることが判明したので、GPS2の募集は、2つの特定の核コードミトコンドリア遺伝子で試験された。ミトコンドリアで高富化した組織の例としてマウス由来のBATにおけるNDUFV1およびTOMM20。
GPS2プロモーターの占有率は、GPS2-Aノックアウトマウスと野生型レターメイトで比較した。GPS2-AノックアウトマウスからBATの選択的標的遺伝子に対するGPS2結合の予想減少が認められた。ここで説明したプロトコルを用いて、RNAポリメラーゼ2と抑制ヒストンマークH3K9ME3との結合の増加を、野生型レターメイトと比較してGPS2-AノックアウトマウスからBATに記録した。
これらの結果は、選択された核コードミトコンドリア遺伝子に対するGPS2の募集を確認し、H3K9ME3の蓄積を防止するためにGPS2が必要であり、したがって標的プロモーター上のポール2転写活性の失速に必要であることを示した。ここで説明するプロトコルは、褐色脂肪組織に対して特異的に最適化された場合であっても、他のマウスおよびヒト組織からChIPを行うための評価されたツールを表す。フェノクロロホルムでの作業は非常に危険な場合があることを忘れないでください。
そのため、この試薬を使用している間、常にヒュームフードの下で動作することが非常に重要です。
