この作品は、ナノシステム研究センター（CNS）、無のNSF賞の下で国立科学財団によってサポートされている国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク（NNIN）のメンバーで、一部で実施された。 ECS-0335765。 CNSは、ハーバード大学の一部である。

整列機能心筋組織を生成するためのプロトコルは、大きく3つの部分に分けることができます。ソフトリソグラフィ技術を用いてマイクロパターンマスタの製造は、次のプロトコルの一部とは見なされませんが、確立された方法6に基づいて行うことができる。 1。 PDMS基板上にフィブロネクチンのマイクロコンタクトプリンティング<ol><li>ミックスシルガード10時01分硬化剤の比率をベースと脱ガス気泡を除去するためにデシケーターを使用して、アセンブリで184（ダウコーニング）のPDMSエラストマー。 </li><li> 20μm幅と室温または65℃で4時間で2日間のどちらかに20μmの間隔で区切られた2μmの背尾根、°Cが微小構造のPDMSスタンプを取得すると以前に製造されたマスターに対してPDMSを硬化させる。 </li></ol> *デシケーター中で硬化は非常に任意の気泡を除去することをお勧めします。 <ol start="3"><li>ガラスカバースリップ（ 例えば上にスピンコートPDMS15μmの厚さであっても薄いとPDMS基板を製造するために車間スピンコーターを用いて2分間5,000 rpmで22x22のmm）です。 </li><li>埃や汚れの粒子を除去するために、70％エタノールでスタンプをきれいにしてください。空気が乾燥してみましょう。 </li></ol> *スタンプが複数回使用することができますが、定期的にPDMSスタンプを更新する時間をかけて表面の摩耗により推奨されます。 <ol start="5"><li> 275ミリトルで1分間、SPIプラズマPrep IIプラズマクリーナーとプロセスに置きスタンプはPDMSの表面が親水性にする。 </li></ol> *酸素プラズマ処理は監視すべきである。長い治療時間は、エラストマーの割れが発生することがあります。 <ol start="6"><li> 1分間、70％エタノールでスタンプを滅菌する。圧縮空気で素早く乾燥。 </li></ol> *さらなるステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットで行うべきです。 <ol start="7"><li> Fでスタンプ表面を覆うibronectin液（蒸留H 2 O中の50μg/ ml）を。それが吸着する少なくとも10分してみましょう。 </li><li>スタンプからフィブロネクチンソリューションを振り払うと圧縮空気で素早く乾燥。 </li><li> 2分間スタンプおよびPDMS基板間の等角接触を確立し、しっかりと押してください。 </li><li>蒸留H 2 Oでマイクロパターン基板をすすぐ最初に使用しない限り、4℃で2週間の最大のddH 2 O中で保管してください。蒸留H 2 OのストアPDMSスタンプ</li></ol> 2。ダブルトランスジェニック胚性幹細胞株の維持まず、培養マウスES細胞については、次のメディアを準備します。 マウス胚線維芽細胞（MEF）ミディアム：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、ES細胞や分化グレード、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（P / S） 胚性幹細胞（ESC）ミディアム：DMEM、15％FBSをES細胞グレード、非必須アミノ酸（NEAA）1％、0.5％、P / S、0.2％白血病阻害因子（LIF）、0.0007％2 - メルカプトエタノール（2-ME）を<ol><li>蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン滅菌0.1％コート6ウェルプレート</li><li>円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにMEFを加え、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。 MEF-培地に再懸濁したMEF。 </li><li>ウェルに吸着、吸引過剰ゼラチンおよびadd MEFの後。 MEFは1日、添付することができます。 </li></ol> * 3 6ウェルプレート用の千万のMEFで十分のアリコート。 <ol start="4"><li> MEFには添付している場合には、円錐管で解凍アリコートから50 mlのPBSにES細胞を追加し、5分間1,000 rpmで、それらを遠心分離します。再懸濁したESは、ESC-培地中の細胞とMEFを含むウェルに追加します。合流点に到達するまで、ESC-培地で培養したES細胞。 </li></ol> *一度ES細胞は継代はのrequです、合流点に達している繁茂を回避し、ES細胞コロニーを維持するために、赤外発光ダイオード。 <ol start="5"><li>継代のためにES細胞を準備します。吸引ESC-培地と滅菌PBSで1回洗浄します。 </li><li> PBSを吸引除去し、トリプシンの500μlを添加する。 37℃で3.5分プロセス℃まで</li><li> ES細胞コロニーを打破​​し、ESC-培地500μlでそれを中和するために、上下に数回トリプシン溶液をピペット。 </li><li>ご希望の比に応じて通過したES細胞は、通路1月30日に先に調製したMEFを持つ別のウェルに33μlの転送など 。 ESC-培地でES細胞を維持。 </li></ol> * 1/30の通過率は、ES細胞が3日以内にコンフルエントに到達することができます。通過したES細胞は、あなたのin vitro分化のスケジュールに従って。 （3）二重トランスジェニック胚性幹細胞株および心臓前駆細胞の単離とその種のインビトロ分化まず、followiを準備ES細胞のin vitroでの分化に必要なNGメディア： 適応-ミディアム：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、15％FBSをES細胞グレード、1％NEAA、0.5％、P / S、0.2％、LIF、0.0007％2-ME 分化ミディアム：IMDM、15％のFBS分化グレード。 1パーセントNEAA、0.5％、P / S、0.1Mアスコルビン酸の0.35％、0.0007％2-ME <ol><li> ES細胞がコンフルエントに達したときのin vitro分化に起動します。蒸留H 2 Oおよび37℃で15分間吸着させ、それを聞かせて℃のゼラチン無菌の0.1％のコート10cmの培養皿を</li></ol> * in vitroでの分化過程の期間に注意してください。心臓前駆細胞を単離することができるようになるまで、それは8日かかります。それに応じてあなたの実験を計画します。 <ol start="2"><li>以前のように収穫したES細胞。吸着、吸引過剰ゼラチン後、準備された文化にES細胞懸濁液の約1/3-1/2追加適応-培地を含む料理をお楽しみいただけます。 2日間の培養細胞。 </li></ol> *あなたの実験によると適応のためのES細胞の量を選択してください。 <ol start="3"><li>収穫は1を使用してPBSを含む50mlコニカルチューブにES細胞を適応した。トリプシンの5ミリリットル。 5分間1,000 rpmで解離したES細胞を遠心分離し、分化培地で再懸濁します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて15cmの培養皿で10μlのドロップあたり約1000個の細胞の胚様体（EB）を作る。 37℃で2.5日間滴をぶら下げとしてプレートや文化EBを反転℃に</li><li> 2.5日後、1 37℃でさらに3.5日間分化培地や文化、それらを使用して℃に6月8日15cmの培養皿のプールのEB </li><li> 3.5日後には、円錐形の50mlチューブにEBSを収集し、それらを約5分間、底に沈むことができます。上清を吸うと滅菌PBSでEBを洗う。 EBをAPPRための底に再び沈むましょうoximately 5分。 </li><li> 2でそれらを処理することにより、EBを解離する。 37℃の水浴中で2分間トリプシンを5ml℃〜そっとチューブを振る。次に、2を追加します。 5トリプシン溶液に滅菌PBSミリリットルと10ミリリットル血清ピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。 7.5パーセントのFBS ES細胞または分化グレードおよびPBS中の0.01％DAPIを含むFACS緩衝液10mlでトリプシンを中和する。 </li><li> 5分間1,000 rpmで解離EBを遠心分離し、FACS緩衝液約1mlに再懸濁します。 1mlのピペットで細胞塊を分解するのに約8から10回上下にピペッティング。 </li></ol> *解離EBの推定量に応じて、FACS緩衝液を追加します。あまりに高度に濃縮された細胞は、FACSの間に詰まらせることがあり、あまりにも低濃度の細胞が不必要にFACSの時間を延長することがあります。 <ol start="9"><li>取得するために35μmのセルストレーナーで滅菌丸底チューブに細胞を移し単一細胞懸濁液。 </li><li> FACSAriaフローサイトメーターを用いて分化したES細胞を選別し、CVPの精製された集団を得る。 </li></ol> *私たちは、高度に精製された着色された細胞を単離するためのマルチステップゲーティング戦略を開発した。簡単に言えば、我々前方散乱振幅（FSC-A）と側方散乱振幅（SSC-A）（ 図1A）上の最初の門。これは、私たちは細胞の破片から全細胞を分離することができます。その後、我々は、FSCと前方散乱光幅（FSC-W）（ 図1B）にゲート。これは、私たちはダブレットおよび他の細胞集合体から細胞シングレットを特定することができます。次に我々のSSC-及び側方散乱幅（SSC-W）（ 図1C）でゲート。これは、細胞シングレットの純度を向上させます。その後、我々は、DAPIでゲート非生存細胞（ 図1D）から生細胞を（DAPI陰性）を単離する染色。それから私達Phycoeryhthrin振幅（PE）とPE-シアニン色素7振幅（PE-Cy7-）上のゲート（R +真赤陽性を得るために </&gt;をSUP）と（R赤陰性真- ）細胞と自家蛍光赤陰性細胞（ 図1E）を除外する。 R +とR -細胞はフルオレセインイソチオシアネートの振幅（FITC）で別々に次にゲートされると、PE-緑真陽性（G +）と（ - G）グリーン陰性真ソートするために、これらの集団内の細胞（ 図1F + 1G）。次のようにセルの4集団でこの結果：R + G +、R + G -であり 、R - G +とR - G - （ 図1H）。 <ol start="11"><li> 10分間蒸留H 2 O中1％プルロニックF-127とマイクロパターン基板を不動態化する。その後、滅菌PBSで彼らは3倍洗う。 </li></ol> *プルロニックF-127は、そのブロックの細胞接着界面活性剤である。これは、マイクロパターン化エリアへの細胞接着の閉じ込めをサポートしています。 <ol start="12"><li>パターン化された領域の周囲のPDMSガスケットを取り付けしっかりと押し込みます。フィブロネクチンマイクロパターン基板上に続いて、シードは、CVP。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

このプロトコルでは、我々は彼らが整列し、心筋細胞のようなロッド形状を取ることができますどのような心原性前駆細胞の精製された集団を区別し、フィブロネクチンマイクロパターン基板上シードそれらをするための方法を提示した。正常な細胞組織は、心筋組織のために、特に、正常な組織機能8,10のために重要です。心筋細胞は、異方性セル·アレイを形成する際に、11,13 ...

薬物療法における最近の進歩にもかかわらず、高度な心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因のままです。臨床症状は、機能心筋組織の損失および罹患した個体の代謝要求を満たすために、心不全のその後不能から生じる。心臓が限られた再生能力を持っているので、自家心臓移植は、直接失わ機能的な心臓組織を補充を目的とした、現在臨床的に認められ治療法です。ドナー心臓および長期免疫抑制療法の必要性の限られた数を含む、心臓移植の重大な欠点は、この治療法の普及の使用を排除する。その結果、薬物療法では、心疾患患者の治療の主力となっている。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroで正常と病的心筋の生理を繰り返す細胞アッセイの識別である。 <html>幹細胞生物学と組織工学技術の最近の収束は、心臓再生のための新しい有望な道を発生させます。再生可能な患者固有のソースから機能的な心筋組織を生成すると、フィールド内の主要な進歩であろう。これは、医薬品開発と発見のための疾患特異的な細胞アッセイの開発が可能になると心臓の再生医療のための基礎を築くだろう。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と、もっと重要なのは、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、心室前駆細胞および成熟した心室筋細胞の潜在的に再生可能な患者固有のソースを表します。幹細胞生物学と組織工学戦略の組み合わせでは、創薬のためか、進行した心不全の治療のための心臓再生のアプローチにおける細胞アッセイの開発に使用することができるin vitroで機能的な心臓組織を生成することで、この問題に対処しています。 _content &quot;&gt;心臓再生における中心的な課題は、最適な細胞タイプの同定されています。様々なソースから異なる多能性心臓前駆体が発見されているものの、細胞の広い配列が、しかし、今日まで、細胞の識別を1に研究されているこのような筋原細胞の運命へのコミットメントなどの重要な要件を満たしているソースは、機能的な心筋組織へのin vivoまたは in vitroおよび組成の展開する能力を維持することは、中心的な問題であることが証明された2。我々は以前に二重トランスジェニックマウス系を記載しているそれは非常にin vitroで分化したES細胞から、コミットされた心室性前駆細胞の集団（CVP）を精製単離を可能にします私たちはMEF2C遺伝子のISL1依存エンハンサーの制御下のDsRed赤色蛍光タンパク質を発現する新規な二重トランスジェニックマウスを作製し、の制御下で増強された緑色蛍光タンパク質心臓特異的エンハンサーNkx2.5。この2色の蛍光レポーターシステム、MEF2CとNkx2.5遺伝子の発現に応じて蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離することができる開発ES細胞からの第一及び第二の心臓フィールド前駆細胞に基づく。 CVPは、心臓組織の再生を目的とした偉大な約束を提供しています何の心筋マーカーとの構造的および機能的な資質3の発現パターンに基づいて、心筋細胞に似ている。 組織工学の分野における多くの進歩があったが、ネイティブの細胞構造を模倣することは重要な課題として残されている。この課題に対処するための従来の方法は 、in vitro での細胞と播種生物学的または合成足場が含まれています。急速な分解、限られた物理的および機械的安定性と低細胞密度1,4,5含む足場、の多くの欠点のために、我々は足場のない組織を設計しようとしました。 Altキーハフ心臓の細胞が細胞外マトリックスタンパク質の分泌によってそれらの局所微小環境を変更することができ、それらは細胞外手がかりがない状態で棒状の心筋細胞に自分自身を整理するための、より限られた能力を持っている。このように、機能的な心筋組織を構成する細胞は、適切な空間および生物学的な手がかりを提供するテンプレートが必要です。マイクロコンタクトプリントは、正確に位置合わせ機能心筋組織の生成のために重要であるすべては細胞の形状、組織、機能6-8を 、制御するための簡単かつ安価な手法を提供することにより、この課題に対応します。それは正確なパターンで、PDMS基板上に細胞外マトリックスタンパク質の沈着を有効にしてこのように空間的に細胞接着に影響を与えることが2μm9に至るまで、機能·サイズの微小構造のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの使用を含む。 ここで、我々は、幹CELで組織生体工学技術を組み合わせることを提案するlは生物学異方性、機能心筋組織を生成する。したがって、我々はここで、次のための私達の最近出版されたアプローチを示す：（1）境界の心筋組織のためのテンプレートを生成するためのマイクロコンタクトプリンティングによるPDMS基板上にマイクロパターンタンパク質表面の生成（2）高から心臓前駆細胞の精製分離ES細胞は 、in vitro で分化、および（3）の両方の技術の組み合わせは、整列機能的な心筋組織を生成する。

<table border="1"><tbody><tr><td> マテリアルの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> L-アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4544 </td><td>蒸留H 2 O中0.1M溶液を準備</td></tr><tr><td>デシケーター、真空10インチ</td><td>ノヴァテック·インターナショナル、Inc。 </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール、塩酸塩（DAPI） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria IIフローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清ES細胞グレード</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 100から106 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清分化グレード</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 100から500 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からフィブロネクチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F4759 </td><td>蒸留H 2 O中で1 mg / mlに可溶化</td></tr><tr><td> Fisherfinestプレミアムカバーガラス22x22mm </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から548-B </td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮膚由来のゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1890 </td><td> ddH 2 Oを0.1％の溶液を調製</td></tr><tr><td>車間スピンコーター</td><td>ヘッドウェイ·リサーチ社</td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td>イスコフ改変ダルベッコ培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>セルフLIFの分泌細胞株から調製された</td><td></td><td> 500分のストック溶液を調製</td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td>ギブコ</td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td>マウス胚線維芽細胞</td><td>日12月15日マウス胚から採取した</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF-127 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2443 </td><td>蒸留H 2 O中の1％の溶液を調製</td></tr><tr><td>丸底チューブ35μmのセルストレーナー付き</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPIプラズマPrep IIプラズマクリーナー</td><td> SPI用品</td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td> 184 SIL ELASTキット0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td>ギブコ</td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td>真空計</td><td> SPI用品</td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

高度な心不全は、生存および/または完全に機能する心筋細胞の損失から生じる、主要な臨床上の満たされていない課題である。最適な薬物療法にもかかわらず、心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因を表しています。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroでの正常および病的な人間の心筋の生理学を再現細胞アッセイの識別である。同様に、回生心臓生物学における主要な課題は、臨床的に関連する量で患者固有心筋前駆細胞の同定および単離を中心に展開。これらの細胞は、ネイティブ心臓組織構造に似ている機能的な組織に組み込まれなければならない。マイクロコンタクトプリントは、このように空間的に細胞接着を制御するために幾何学的な手がかりを提供して、心臓の構造組織に似ている正確なマイクロパターンタンパク質形状の作成 ​​が可能になります。ここに我々は非常にin vitroで 、細胞外マトリックスタンパク質とマイクロパターン化細胞成長表面の生成、および異方性の心筋組織への幹細胞由来の心筋細胞の集合体で分化する多能性幹細胞から心筋細胞を精製単離するための我々のアプローチについて説明します。

in vitroで分化したES細胞でのFACS精製は、前駆細胞の4つの異なる集団（ 図1）を明らかにした。マイクロパターンフィブロネクチンの存在は、連続的なフィブロネクチンライン（ 図2）の完全な転送を表示免疫蛍光顕微鏡検査法により確認された。 G +集団-フィブロネクチン微細パターン上に、FACS分離された前駆体のメッキがR + G <...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K ビュー.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. 整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成し?...

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

生物工学

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

機能性および偏極性胆道上皮嚢胞の生成と定量的特徴付け

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...