心血管疾患は、世界中で死亡の第一の原因です。従来のインビトロモデルは、単層文化に依存しています。しかし、心臓、具体的には心筋または心筋は、その3D異方性および細胞組成において複雑である。
したがって、細胞構成成分と心筋の構造の両方をよりよく模倣するために、in vitroモデル内の組織組成の複雑さを改善することが重要です。本研究では、新規微小流体装置内での3D成熟幹細胞由来ヒト心臓組織の開発プロトコルを示す。この装置は、周囲のヒドロゲル内包心臓細胞の高い整列を誘導する自然楕円形のマイクロポストを備えた3Dメイン組織チャネルを組み込んでいます。
メインチャネルは、組織全体に栄養拡散を可能にする注入ポートを備えたメディアチャネルによって横たわっています。マイクロ流体デバイスの取り扱いに必要なケアのために、このプロトコルの視覚的表現は、組織のアライメントを強化するためのマイクロポストが埋め込まれたマイクロ流体デバイス内に3D心臓組織を適切に確立するのに役立ちます。ヒト心筋線維芽細胞を解離するには、まずインキュベーターからフラスコを取り出す。
バイオセーフティキャビネットの中に入れて、フラスコから使用済みのメディアを吸引し始めます。その後、3つのPBS 1XのMLを取り、フラスコを洗います。キャップを閉じ、底部がPBSで適切にコーティングされるようにフラスコを旋回します。
PBSを吸引する。37度のトリプシンの3つのMLを取り、フラスコに追加します。その後、フラスコを傾け、底部が完全にコーティングされるように旋回します。
その後、インキュベーターを4〜6分間入れます。3つのMLsを取り、フラスコにそれを追加することによって、FGM3でトリプシンを中和します。溶液を上下にピペットして、フラスコの背面に残っている細胞を取り除きます。
15 MLファルコンチューブにセル懸濁液を回収します。細胞懸濁液を10マイクロリットル取り、ヘモサイトメーターで分配し、顕微鏡で細胞を数えます。250Gで細胞懸濁液を4分間遠心分離する。
遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを乱さないよう注意する。新鮮なFGM3で細胞ペレットを再懸濁し、ML懸濁液あたり所望の7500万個の細胞を作ります。細胞を再サスペンドし、ゆるくフィットしたキャップでチューブを下に置きます。
心筋細胞を解離するには、インキュベーターからプレートを取り出し、培地を吸引する。PBSの6つのMLを取り、各井戸にPBSのMLが1つあるように井戸を洗います。PBSを吸引し、プレートに取り付けた細胞を邪魔しないように注意する。
6つのウェルプレートの各井戸に1つのMLがあるように、温めたtrypLE Expressの6つのMLを追加します。細胞をtrypLEで10分間インキュベートします。10分後、RPMIとB27プラスインスリンの6つのMLでtrypLEを中和し、各井戸にRMPIのMLを1つ追加します。
溶液を収集し、すべての細胞が持ち上げられることを確認するために井戸の背面に対してそれを爆破するためにMLピペットを1つ使用してください。15 MLファルコンチューブにセル懸濁液を回収します。300Gでチューブを3分間遠心分離します。
遠心分離後、メディアとtrypLEを吸引する。このステップは、敏感な心筋細胞を洗浄するために重要です。このステップは、すべてのトリプルが3D心臓組織形成で消え去っていることを保証する。
RPMIプラスB27プラスインスリンの5つのMLで細胞ペレットを再懸濁します。均質な細胞懸濁液を確保するために、溶液を上下にピペット化するために1つのMLピペットを使用してください。ヘモサイトメーターで計数するための細胞懸濁液の10マイクロリットルを取る。
300Gで細胞を3分間遠心分離する。2度目の遠心分離後にメディアを吸引する。ML懸濁液あたり7500万個の細胞を達成するために、適切な量のRPMIプラスB27プラスインスリンを加え、再中断する。
カプセル化用のコラーゲン溶液を調製するために、フード内のアイスボックス上のすべての試薬を持っています。その後、ストックコラーゲンの75マイクロリットルを取ります。コラーゲンは非常に粘性があるので、ピペットでゆっくりと取り込み、氷の上のマイクロ遠心チューブに分配します。
RPMIの13.85マイクロリットルを取り、ファルコンチューブのコラーゲンに追加します。その後、フェノールレッドの10マイクロリットルを取り、氷の上の混合物に追加し、再中断します。最後に、1つの通常のNaOHの1.15マイクロリットルを取り、中和するために懸濁液に加えます。
その後、200マイクロリットルピペットチップを取り、懸濁液を再中断します。次のステップは、コラーゲンメトロゲル内の細胞のカプセル化である。その後、8マイクロリットルのCMのアリコートを取り、氷の上の新鮮なファルコンチューブに追加します。
その後、CSの2マイクロリットルを取り、その細胞混合物に追加します。細胞懸濁液を再懸濁し、細胞懸濁液の5.6マイクロリットルをつかみ、新鮮なファルコンチューブに入れます。その後、準備したコラーゲンをつかみ、コラーゲンを4マイクロリットル取り、2.4マイクロリットルのメトロゲルを取ります。
混合物を上下にピペットし、細胞ヒドロゲル懸濁液の均質な分布を確保した。ゲル注入が準備されたら、装置に挿入することができます。新しいヒントを取り、再中断します。
デバイスのペトリ皿を取り、注入口に先端を挿入し、ゆっくりと着実に注入する。デバイス チャネルがセル ハイドロゲル懸濁液でいっぱいになることがわかります。他のポートが満杯になったら、注入を停止し、チップを取り外します。
注入後、ピンセットでデバイスを反転し、9分間インキュベーターに水を入れて大きなペトリ皿の中に置きます。9分後、インキュベーターからデバイスを取り出し、直立させ、さらに9分間インキュベーターに戻してヒドロゲル重合を完了します。今度はメディアを追加する時間です。
そのため、RMPI と B27 を使用して、チップをメディア ポートに挿入し、ゆっくりと押し始めます。その後、反対側のメディアポートで行います。メディアが注入されていないので、ポートの上にメディアの液滴を置き、ピペットを取り、反対側からメディアを引き抜くために負圧を使用することができます。
だから、メディアがチャンネルを通って引っ張り始めるのがわかります。メディアがすべてのメディアチャンネルに追加されると、デバイスは37度でインキュベーターに戻されます。マイクロ流体装置は、左上隅に示されています。
この画像には、1日目、7日目、14日目の文化が示されています。培養の14日後、細胞はマイクロポストの周りに形成される高度に整列した構造に凝縮するべきである。14日目の痕跡は、自発的な収縮のC、ならびにアクチン染色および心臓マーカー染色組織の免疫蛍光画像にここに示されている。
見るべきことは、培養で14日後に形成される高度に整列したアクチン繊維と、平行線状の成熟したサルコメアおよび局在的なギャップ接合部である。この手順の間、細胞ヒドロゲル注入中にすべての材料を氷上で低温に保ち、早期の重合を防ぐことが重要です。マイクロ流体デバイスは、製造、注射、および拡張組織培養中の両方で、注意して処理する必要があります。
細胞注入は、培地添加前に早期の重合またはヒドロゲルの乾燥を防ぐために迅速に行われながら、チャネル全体が満たされていることを確認するための安定したプロセスでなければなりません。
