この作品は、研究開発、RR＆Dサービス、退役軍人の米国エネルギー省、NIH COBRE 1P20RR024484、NIH K24 AR02128と防衛W81XWH-10-1から0643の部門のオフィスによってサポートされていました。

1。二軸ロードバイオリアクターの設計<ol><li>バイオリアクターは、偉大な負荷用量の精度（振幅と周波数）と多種多様のアプリケーションを使用して、設計された組織への一軸又は二軸の機械的ひずみを適用するための精密誘導レーザーアプリケーション用のトール·ラボ（ニュートン、マサチューセッツ州）製の二つの段階を採用単一の24ウェルプレート（ 図1）組織培養条件。 </li><li>二軸荷重は2 TravelMax段階（LNR50SE）によって達成される。これらのステージは、XZ構成で直角に取り付けられている。水平ステージは、X軸に沿って振動させることにより、動的せん断動きを提供します。縦のステージはZ軸に沿って振動することによって、動的圧縮荷重を提供しています。これらの段階は、50ミリメートル移動範囲を有し、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ（BSC102）によって制御されるステッピングモータアクチュエータ（DRV014）によって独立に駆動され、より小さいステップサイズを可能にする50nmである。 </li><li>装置は、剛性25センチメートルに装着され×30メートル×12.5機械の部品組立のためのプラットフォームとして組織培養プレートを装着するために使用されるミリメートルのアルミベースプレート。調整可能なストップは、キネマティックアルミニウム基板上に所定の位置に組織培養プレートをロックするために使用される。これらの運動が停止し、そうでなければ手では達成できない正確な位置合わせを可能にするために、微調整ネジを持っている。ベースプレートのモジュール設計は、異なるサイズおよび形状（ペトリ皿対マルチウェルプレート）のプレートを収容するためにこれらの運動学的ストップの柔軟な配置を可能にする。 </li><li>カスタム加工ポリスルホンロードプラテンは、精密機械加工直角ブラケットを介して二軸移動プラットフォームに接続されている。ポリスルホン材料は、その生体適合性により、加工のしやすさ、および滅菌を容易にするために選ばれた。 </li><li>ステージの動きはトール·ラボ[詳細ポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、私たちです。独立かつ同時に周波数及び剪断及び圧縮の両方の振幅の負荷パラメータの調整を可能にするソフトウェアとの組み合わせオピニオン。 </li><li>位置フィードバックは、各移動架台に取り付けられ、ソフトウェアと統合されている非線形光学エンコーダによって提供される。エンコーダシステムは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの解像度を持っています。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスと絶対位置を直接読み出しに必要な位置フィードバックを提供します。 </li><li>プラテンと試料間の接触を検出するために必要な力フィードバックを提供し、ローディング応答、ローディングプラテンと可動プラットフォーム（ 図2）との間に配置される精度ミニチュアロードセル（ハネウェルモデル31）に評価するためである。ロードセルは、高い精度を有する0.15％〜0.25％フルスケール。ロードセルする表示部（SC500）は、小数点以下5桁までの荷重測定を提供することができる。さらに、コンピュータ上でデータ収集を可能にするためにRS-232ポートを有している。 </li></ol> 2。細胞播種アガロースコンストラクト<ol><li> 4％アガロースを準備：50ミリリットルのフラスコに、沸騰してから70に留めておく°使用するまでCのオーブンで20ミリリットルDMEM（無添加）に0.8グラムアガロースを追加。 </li><li>所望の細胞播種密度の二重量のための細胞懸濁液の量を調整します。この懸濁液は、所望の播種密度で2％アガロースゲルを作成するために4％w / vのアガロースの等量混合する。 </li><li>インキュベーター内で細胞懸濁液と1つの10ミリリットルピペットの両方を配置します。 </li><li>ゲルキャスティングシステムを設定します。 One 1.5ミリメートルと1 0.75ミリメートルスペーサープレートが2.25ミリメートルの厚さのゲルを作成するために一緒に配置する必要があります。他のサイズのスペーサプレートは、異なる厚さのゲルを作成するために使用することができる。ゲルキャストシステムは、これらのプレートtogetを保持するのに十分な大きさではない彼女には、ので、それらは確実に漏れを防ぐためにテープで固定しなければならない。 </li><li>次のステップは、アガロースが固化する前に迅速にゲルモールドに予め用意アガロースとピペットを用いて細胞懸濁液を混合することである。オーブンから液体アガロースを取り外し、中の滅菌温度計を配置。アガロースは°C細胞と混合する前に42-43に冷却しなければなりません。 37℃に細胞懸濁液を温めるアガロースが43に当たったら℃、迅速に所望の量をピペットで、その後すぐにミックスするには、上下に数回の細胞懸濁液をピペット。その後、直ちにゲル型に混合物全体をピペット。 </li><li>ゲルは10〜15分間固化した後、慎重に水平位置に傾けることができます。 </li><li>トップガラス板と生検パンチとパンチディスクを削除します。ディスクは小さな滅菌スパチュラでピックアップすることができます。我々の経験では、9ミリリットルゲルが百以上の5 mmの直径のディスクを作るのに十分な大きさでした。 </li></ol> 3。文化ディスク</p&gt; <ol><li> 24ウェル非組織培養処理プレートの各ウェルに置きつのディスクを。 </li><li>各ウェルに無血清軟骨分化培地2mlを加える。 </li><li> （37℃、5％CO 2）インキュベーターにプレートを置く。 </li><li>メディアの変更については、1ミリリットル当たりよく2〜3日ごとに交換してください。 </li></ol> 4。機械的負荷のためのサンプルの固定化<ol><li> 4％アガロース（無細胞懸濁液を添加していない）を準備し、ゲルは、サンプル自身（ロード時の干渉を防ぐために）よりも薄くする必要があります。推奨厚さは1.5〜1.9ミリメートル（339 mm厚のサンプルのため）です。 </li><li>かつて24ウェルプレート用ポンチ直径16mmディスクは、ゲル化した。必要に応じて各ディスクには、サンプルのためのパンチ1 5ミリメートル穴をインチ配置される、メディアの変化の間に配置されるピペットのディスクの端に別の5ミリメートルの穴を開ける。 </li><li> 図3に示すように、一度アガロースウェルを、24ウェルプレート内の場所なされている。 </li><li>アガロースW一度エルボは、24ウェルプレートにあり、各ウェルにサンプルを圧入。サンプルはアガロース井戸の上部から突出する必要があります。 </li></ol> 5。機械的荷重<ol><li>プラテンします（ 図2）滅菌する。 </li><li>セルをロードするためにアルミ板を固定します。セキュアプラテン/ステージにロードセル/アルミニウムプレートアセンブリをロードする。 </li><li>ステッピングモータコントローラ（背面のスイッチ）をオンにします。 </li><li> PCとオープン&quot;APTユーザー&quot;プログラム（ 図4）をオンにします。 <ol><li>左の画面は、水平ステッピングモータを制御する。右の画面は縦のステッピングモータを制御する。各画面では、 &quot;グラフィックコントロール&quot;タブでは、手動位置を可能にし、 &quot;移動シーケンサ&quot;タブでは、自動化が可能になります。すべてのユニットはミリです。 </li></ol></li><li>両方の画面の &quot;グラフィックコントロール&quot;タブに移動し、 &quot;ホーム/ゼロ&quot;ボタンを押してください。両方のステッピングモータは50mmの範囲を有する。 &quot;ホーム/ゼロ&quot;を押すと、ゼロ位置（トップと一番右の位置）にステッピングモーターの両方を送信します。 </li><li>た準備各ウェルから一部のメディアを除去することにより、ロードするための24ウェルプレートでの電子のサンプル。メディアのこれ以上より1 mlをロード中にオーバーフローを防ぐために、各ウェルに残しておく必要があります。十分なメディアがサンプルをカバー保つために十分に残されていることを確認してください。 <ol><li>インキュベーターは、機器の故障を防ぐために、低湿度条件に保持されることに留意されたい。 </li></ol></li><li>場所24ウェルプレートバイオリアクターで、慎重にプラテンに並ぶ。 <ol><li>プレートは、4つの調整可能な運動ロケータを使用してバイオリアクターに固定されている。それが簡単にプラテンを整列できるようにするため、左側の2つのロケータが事前に配置されている。プレートが安全であるように、右側の2つのロケータを締めます。バイオリアクターベースの前面とアップフラッシュプレートを並べるようにしてください。 </li><li> &quot;グラフィックコントロール&quot;タブでは、特定のステッピングモーターの位置を手動で位置ボックスをクリックして入力することができます。ゆっくりプラテンを下げ、プレートと並ぶように水平方向に移動するには、この機能を使用します。 </li> &lt;/ OL&gt; </li><li>プラテン、サンプルに接触に近くなると、非常に遅く単位でプラテンをダウンさせるために開始（0.1mm）をあなたが所定の開始位置に到達するまで（パート6を参照）。 </li><li>開始位置に到達すると、タブ &quot;シーケンサを移動&quot;を押すことにより、所望の移動シーケンスをロードするために行く &quot;ロード&quot;をその後、開始するには、 &quot;ファイル名を指定して実行&quot;を押します。 （ 図5）パート7を参照してください。投与プロトコルを記述する。 </li><li>ロードが完了したら、手動でプラテンを上げる。任意のサンプルがプラテンに立ち往生している場合は、慎重に滅菌スパチュラを用いてよく、適切にそれらを戻す。 </li><li>バイオリアクターからの24ウェルプレートを取り外し、メディアを交換してください。 </li><li>慎重にロードセルからプラテンを削除してから、楽器をオフにします。 </li></ol> 6。キャリブレーションの読み込みプラテン適切な株はサンプルに適用されるようにするには、各プラテンは慎重に実験を開始する前に校正する必要があります。 <ol><l私は&gt; 5.8に手順5.1を実行してください。 </li><li>手動で25ミリメートルの位置に水平ステッピングモータを置く。 </li><li>それはちょうどかろうじてバイオリアクターの底に接触して慎重に下プラテン来るまで。ロードセルは、この時点で増加した負荷を示す。縦のステッピングモータ（すべての圧縮ひずみ測定は、この値から計算されるように、できるだけ正確に）の正確な位置に注意してください。 </li><li>位置を記録。この値は、試料の寸法と所望の菌株をもとにして投与プロトコルを書き込むために使用される。 </li></ol> 7。投薬プロトコルを書く<ol><li>バイオリアクターは、同時にまたは個別に、圧縮及びせん断ひずみの両方を適用することができる。風袋圧縮ひずみ、動的ひずみ振幅、周波数をロードする：3つの主要なパラメータが決定しなければなりません。 </li><li>風袋株は試料からプラテンのリフトオフを防止するために適用される。 </li><li>サンプルの動的ひずみ振幅と周波数荷重周波数が選択されています。 </li></ol>本研究では、次のように圧縮とせん断ひずみを定義します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" />例えば二軸投与·プロトコル 試料の厚さ：2.25ミリメートル 風袋ひずみ（圧縮）：試料の厚さの10％（0.225ミリメートル） 動的なひずみ振幅（圧縮）：10％（+ / - 試料の厚さの5％） 周波数（コンプレッション）：1 Hzの 動的なひずみ振幅（せん断）：試料の厚さの25％（0.5625ミリメートル）：せん断応力は 水平に移動するプラテンにより試料に適用。 周波数（せん断）：0.5 Hzの 典型的な投与プロトコルは、一日あたりのローディング3時間である。 この例では、動的および剪断荷重を同時にではなく順次に印加される。私たちは、このパターン良いMIMを信じる人間の膝でICS複雑なローディング環境。 <ol start="4"><li>投与プロトコルが選択されると、圧縮移動シーケンスプログラムが書き込まれなければならない。 </li><li>移動シーケンスは、ステッピングモータは、指定の加速度と最大速度でに移動することを位置のリスト、のように聞こえるかを正確です。 </li><li>プロトコルとプラテンの校正値（パート6から）投薬に基づいて、所望の垂直位置を計算します。 </li><li>プラテン1のサンプル計算は、以下に提供されています： </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 校正値との差 </td><td> 垂直位置 </td></tr><tr><td>プラテン校正値（バイオリアクターのタッチボトム） </td><td> 0ミリメートル</td><td> 29.7700ミリメートル</td></tr><tr><td>プラテンは、サンプルと接触（339ミリメートルサンプル）になります</td><td> 4.4140ミリメートル</td><td> 25.3560ミリメートル</td></tr><tr><td>セント雨（5％厚さ） </td><td> 4.3015ミリメートル</td><td> 25.4705ミリメートル</td></tr><tr><td>株（10％厚さ） </td><td> 4.1890ミリメートル</td><td> 25.5810ミリメートル</td></tr><tr><td>歪み（15％厚さ） </td><td> 4.0765ミリメートル</td><td> 25.6955ミリメートル</td></tr></tbody></table><ol start="8"><li>一度位置が正しい周波数を得るために、加速と最大速度値を持つ実験を計算されます。サイクル数は、（1 Hzで3時間、例えば 10,800サイクル）に応じて、選択されるべきである。 </li><li>例動的圧縮移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、10％のダイナミックひずみ振幅、1Hz）で（ 図5） </li><li>動的剪断移動シーケンスプログラム：サイクルの数は、所望の周波数および持続時間（0.5 Hzで3時間、例えば 5,400サイクル）に従って選択されるべきである。 </li><li>例動的剪断移動シーケンスプログラム（10％風袋圧縮、0.5625ミリメートル（厚さの25％）は、動的せん断ひずみ振幅、0.5Hz）を（ 図5）。 </li></ol>

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	<li>Drachman, D. B., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+movement+in+embryonic+joint+development.">The role of movement in embryonic joint development.</a> Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte/agarose+culture.">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> J. Cell Sci. 108, 1497-1508 (1995).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Cultivation+Conditions+Modulate+the+Composition+and+Mechanical+Properties+of+Tissue-Engineered+Cartilage.">Bioreactor Cultivation Conditions Modulate the Composition and Mechanical Properties of Tissue-Engineered Cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 17, 130-138 (1999).</li><li>Gooch, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Mixing+Intensity+on+Tissue-Engineered+Cartilage.">Effects of Mixing Intensity on Tissue-Engineered Cartilage.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72, 402-407 (2001).</li><li>Carver, S. E., Heath, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+enhances+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+osteochondrogenic+medium.">Hydrostatic pressure enhances chondrogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in osteochondrogenic medium.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 813-820 (2008).</li><li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Tissue+Engineering:+The+Role+of+Biomechanics.">Functional Tissue Engineering: The Role of Biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li><li>Guilak, F., Butler, D. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Tissue+Engineering.+The+role+of+biomechanics+in+articular+cartilage+repair.">Functional Tissue Engineering. The role of biomechanics in articular cartilage repair.</a> Clin. Orthop. 391S, S295-S305 (2001).</li><li>Mauck, R. L., Byers, B. A., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cartilaginous+ECM+gene+transcription+by+chondrocytes+and+MSCs+in+3D+culture+in+response+to+dynamic+loading.">Regulation of cartilaginous ECM gene transcription by chondrocytes and MSCs in 3D culture in response to dynamic loading.</a> Biomech. Model Mechanobiol. 6, 113-125 (2007).</li><li>Rubin, C., Xu, G., Judex, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anabolic+activity+of+bone+tissue,+suppressed+by+disuse,+is+normalized+by+brief+exposure+to+extremely+low-magnitude+mechanical+stimuli.">The anabolic activity of bone tissue, suppressed by disuse, is normalized by brief exposure to extremely low-magnitude mechanical stimuli.</a> FASEB J. 15, 2225-2229 (2001).</li><li>Wimmer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribology+approach+to+the+engineering+and+study+of+articular+cartilage.">Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage.</a> Tissue Eng. 10, 1436-1445 (2004).</li><li>Miyata, S., Tateishi, T., Ushida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cartilaginous+matrix+accumulation+on+viscoelastic+response+of+chondrocyte/agarose+constructs+under+dynamic+compressive+and+shear+loading.">Influence of cartilaginous matrix accumulation on viscoelastic response of chondrocyte/agarose constructs under dynamic compressive and shear loading.</a> J. Biomech. Eng. 130, 051016 (2008).</li><li>Heiner, A. D., Martin, J. 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Part A. 16, 1781-1790 (2010).</li><li>Bilgen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+Biaxial+Loading+Device+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design of a Biaxial Loading Device for Cartilage Tissue Engineering.</a> , 1815 (2011).</li><li>Mauck, R. L., Wang, C. C., Oswald, E. S., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+seeding+density+and+nutrient+supply+for+articular+cartilage+tissue+engineering+with+deformational+loading.">The role of cell seeding density and nutrient supply for articular cartilage tissue engineering with deformational loading.</a> Osteoarthritis Cartilage. 11, 879-890 (2003).</li><li>Mauck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tissue+engineering+of+articular+cartilage+through+dynamic+loading+of+chondrocyte-seeded+agarose+gels.">Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels.</a> J. Biomech. Eng. 122, 252-260 (2000).</li><li>Demarteau, O., Jakob, M., Schafer, D., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+for+physical+stimulation+of+engineered+cartilage.">Development and validation of a bioreactor for physical stimulation of engineered cartilage.</a> Biorheology. 40, 331-336 (2003).</li><li>Grad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+motion+upregulates+superficial+zone+protein+and+hyaluronan+production+in+chondrocyte-seeded+three-dimensional+scaffolds.">Surface motion upregulates superficial zone protein and hyaluronan production in chondrocyte-seeded three-dimensional scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 249-256 (2005).</li><li>Schatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+shear+and+dynamic+compression+leads+to+mechanically+induced+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells.">A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 22, 214-225 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益がないことを宣言します。

私たちは、移植のために製造された組織工学構造物に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。デバイスは、天然組織の前に又は他の治療後の機械的特性を記述するために設計されたバイオ複合材料のin vitro培養用のバイオリアクターとして、または検査装置として用いることができる。デバイス被験者は24ウェルプレートへの単一の大きな...

私たちは、移植のために製造されたバイオ複合材料工学組織に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディングバイオリアクターを設計しました。この装置は、主に関節軟骨のために設計された代替のためのバイオリアクターとして設計され、それはまた、人体の他の耐荷重組織を使用することができる。このバイオリアクター設計の私たちのモチベーションは、動きの欠如に起因する麻痺ニワトリ胚における関節軟骨の異常形成の精液の観察を行ったDrachmanとソコロフ1、に由来する。同様に、物理的な運動は、通常の筋肉と骨の開発に不可欠である。この考え方に沿って、多くの研究グループは、in vitro培養中に物理的刺激の方法の異なるモードを調べた細胞バイオ複合生体材料および組織外植片2-7の生化学的および機械的特性を調節する。機能的な組織工学の概念組織の機能的特性を向上させ、機械的刺激のインビトロでの使用に伴い、 インビボ応力と歪み8,9 に耐えることが予想される組織を有効にする機械的特性、即ち 。多くの研究では、関節の関節のために設計軟骨構造を刺激するせん断および圧縮の観点から使用機械的荷重を報告している。 Mauck ら 10は、単独で機械的負荷がさらに不可欠とみなされる成長因子の非存在下で、間葉系幹細胞の軟骨形成を誘導することができることを示唆している。そのような組織培養中の圧縮またはせん断などの断続的な機械的荷重の印加が軟骨及び骨形成を調節することが示されているが、しかしながら荷重の最適な線量は、細胞および組織特性11と異なっている。 関節軟骨の最も重要な機能は、内圧縮および剪断力に耐える能力であるジョイントは、したがって、それは高い圧縮および剪断弾性率を有していなければならない。工学軟骨における機能機械的強度および生理学超微細構造の欠如は、in vivoでのネオ軟骨で内訳と関節の軟骨交換戦略の失敗をもたらした。圧縮及びせん断は、一般的に変調し、関節軟骨のバイオ複合材料の機械的強度を向上させることが実証されているが、合成アプローチは6,12-15稀である。 Wartellaとウェイン16は半月板軟骨の交換を生成するために引張圧縮を適用されたバイオリアクターを設計しました。ウォルドマンら 15は、多孔性カルシウムポリリン酸基質で培養軟骨細胞への圧縮とせん断を適用するデバイスを設計しました。総統ら 17ゲルおよび軸メカの適用における成人イヌ軟骨細胞のin vitroでの栽培とネイティブ軟骨のマッチング機械的特性を実証しanicalローディング（圧縮変形のロードと摺接ロード）。 二軸機械的荷重バイオリアクターは、もともと組織工学軟骨で形態素適応を誘導するために全体的な目標に我々の研究室でダニエルチュウによって設計されました、現在入手可能な18よりも高い圧縮とせん断弾性係数の結果構築します。私たちは、この研究が大幅にメカノは、臨床的に関連する組織をエンジニアに変調することができる方法の我々の広範な理解を高めると信じています。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, High glucose, pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 39346-81-1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS+ Premix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen Strep Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>041-95780</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2218</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonessential Amino Acid Solution 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7145</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5607</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human Transforming Growth Factor &beta;1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 31 Load Cell (1000 g)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AL311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Single Channel Display</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>SC500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50SE/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Two Channel Stepper Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSC102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DRV014</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adjustable Kinematic Locator (4)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KL02</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Right Angle Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vertical Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50P2/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Solid Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB3030/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates </td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1653312 and #1653310 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch, 5 mm</td>
			<td>Miltex, Inc.</td>
			<td>33-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16 mm hollow punch</td>
			<td>Neiko Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86735k19</td>
			<td>Custom-machined</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

design of a biaxial mechanical loading bioreactor for tissue engineering

私たちは、移植のために製造された組織工学バイオ複合材料に一軸又は二軸の機械的な歪みを加えることが可能なローディング装置を設計しました。装置は主にネイティブ機械的歪みを模倣するバイオリアクターとして機能するが、それはまた、力フィードバックまたは構築物の機械的試験を提供するためのロードセルを装備している。デバイス被験者はローディング線量の高い精度（振幅と周波数）で軸機械的負荷に対する軟骨構造を設計し、標準的な組織培養インキュベーター内に収まるように十分コンパクトです。それは、直接組織培養プレートにサンプルをロードし、多板サイズは、システムと互換性がある。装置は、精密誘導レーザ·アプリケーションのために製造コンポーネントを使用して設計されている。二軸荷重は、2つの直交する段によって達成される。ステージ50ミリメートル移動範囲を有し、ステッピングモータアクチュエータによって独立に駆動されることによって制御50nm未満のステップサイズを可能にする、マイクロステップ機能を備えた閉ループステッピングモータドライバ。ポリスルホンローディングプラテンは、二軸可動プラットフォームに連結されている。ステージの動きはトール·ラボの高度なポジショニング技術（APT）は、ソフトウェアによって制御されます。ステッピングモータドライバは、周波数及び剪断及び独立かつ同時に圧縮の両方の振幅の負荷パラメータを調整するためのソフトウェアで使用される。位置フィードバックは、旅行の完全な50ミリメートル以上3μm未満の位置精度に翻訳し、0.1μmの双方向再現性と20nmの分解能を持っている非線形光学エンコーダによって提供されます。これらのエンコーダは、真のナノ位置決め機能を確保するために、ドライブ·エレクトロニクスに必要な位置フィードバックを提供します。検出するためのフォースフィードバックのロード応答に連絡し、評価を提供するためには、精密小型ロードセルローディングプラテンとmovinの間に配置されているグラムプラットフォーム。ロードセルは、0.15％〜0.25％フルスケールの高い精度を有している。

装置を20万個の細胞/ mlの軟骨とアガロースゲルシードを使用してテストし、一軸（圧縮）または軸（圧縮及びせん断）機械的荷重の存在下で培養した。一次ブタ軟骨細胞は2-4ヶ月のブタの関節軟骨から分離した。直径5mm及び厚さ1.5mmのサンプルを定義した軟骨細胞培養培地（高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン...

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

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Unit 1

Analysis and Design of Beams for Bending

SCIENTISTS IN ACTION

14.3K ビュー.  The Warren Alpert Brown Medical School of Brown University and the Rhode Island Hospital. 私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。

ビデオ: Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

ベンチトップリアクターの操作

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a conventional optical system with an integrating sphere. Measuring systems for the acquisition of the diffuse reflectance and total transmittance spectra are constructed with a broadband white light source, a light guide, an achromatic lens, an integrating sphere, a sample holder, an optical fiber probe, and a multi-channel spectrometer. An acrylic mold consisting of two rectangular acrylic pieces and a U-shaped acrylic piece is constructed to create an epidermal phantom and a dermal phantom with whole blood. The application of a sodium dithionite (Na2S2O4) solution to the dermal phantom enables the researcher to deoxygenate hemoglobin in red blood cells distributed in the dermal phantom. The inverse Monte Carlo simulation with the diffuse reflectance and total transmittance spectra measured by a spectrometer with an integrating sphere is performed to determine the absorption coefficient spectrum &#181;a(&#955;) and the reduced scattering coefficient spectrum &#181;s&#39;(&#955;) of each layer phantom. A two-layered phantom mimicking the diffuse reflectance of human skin tissue is also demonstrated by piling up the epidermal phantom on the dermal phantom.

Here, we demonstrate how agarose-based tissue-mimicking optical phantoms are made and how their optical properties are determined using a conventional optical system with an integrating sphere.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

要約

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拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で研究

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

ベンチトップリアクターの操作

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築

中に組み込み血管新生による組織工学

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

組換えコラーゲンペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

拡散反射率分光用光学ファントムを模倣したアガロースベース組織

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

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のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で研究

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

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ベンチトップリアクターの操作

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築

中に組み込み血管新生による組織工学

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

拡散反射率分光用光学ファントムを模倣したアガロース ベース組織

組換えコラーゲンペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

拡散反射率分光用光学ファントムを模倣したアガロースベース組織