DTは、ル·フォン·ド·ルシェルシュ·デュ·ケベックネイチャーらテクノロジーズ（FQRNT）とMITACS昇格戦略的フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 CMCは、ル·フォン·ド·ルシェルシュアンサンテ·デュ·ケベック（FRSQ）とアーネストオタワ心臓研究所の大学からマーガレットフォード心臓病恵まれ研究フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 EOBは、オンタリオ州の心臓と脳卒中財団から健康の研究（CIHR）およびT6335のためのカナダの協会からの補助金のMOP80204を操作することでサポートされていました。 CIHRとメドトロニックは、集合の査読研究議長（URC＃57093）でEOBを提供しています。 AEPは、自然科学と工学研究評議会（NSERC）ディスカバリーグラント、NSERC Discovery Acceleratorのサプリメントによって資金を供給し、感謝してカナダのリサーチチェア（CRC）プログラムとオンタリオ州からの早期リサーチャー賞のサポートを認めている。

単一細胞の1。機械的変形<ol><li>組み込み蛍光ビーズとPDMS基板の作製 基板の製造の前に、水溶液中の蛍光マイクロスフェアは、その疎水性の性質に起因PDMSにおけるビーズ混合を促進するためにイソプロパノール中に再懸濁する。 <ol><li>ピペット10分間16200×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機への蛍光マイクロスフェアの500μL。 </li><li>上澄み液を捨て、ボルテックスの5分で、その後のイソプロパノール500μlを添加する。堆積物に任意の大きな粒子の凝集を可能にするために暗闇の中で一夜放置バイアルを置きます。 </li><li>翌朝、慎重にきれいな微量バイアルに上清を除去。このビーズ溶液を5つ以上の基板を製造するために使用することができる。注：ビーズ溶液は、次の3日間、沈降していきます。ペレットを再懸濁ないように注意してください。 </li><li>提供硬化剤0.5グラムを注ぐ1.5mlのマイクロバイアル中のPDMSキットは、科学的なバランスを使用した。連続した工程により、各添加間の1分間ボルテックス、（6 15μlの添加で）ビーズの90μlの合計を追加します。置いておきます。 </li><li> PDMS 10gを秤量し、蛍光ビーズを補充した硬化剤0.5gを、少なくとも12分間混合する。 </li><li>製造者の指示に従って標準的なフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8 2050断面形状の金型を製作する。使用した金型は、320μmで13.4 cm 2で（ 図3）の領域の高さを有している。金型は428μLまたはPDMSの440ミリグラムを含むことができます。 </li><li> 80℃で2時間、トランスファーピペットおよび硬化を用いたクロス形状の金型内にビーズをPDMS 400mgの流動硬化後、金型（ 図5A）から基板をはがし。基板は、その機械的特性の有意な変化を示すことなく2週間室温でペトリ皿に維持することができる。 </李&gt; <li>直径約4mmの最終的な大きさのペトリ皿に80℃（ 図5B）で2時間逆さにそれらを治す：PDMSの滴（1:20の比率で、PDMS硬化剤）を注ぐ。これらの機能は、アンカー週間ペトリ皿に保つことができる。注：硬化プロセス中に平坦化から落下しないように逆さまにお皿を維持します。 </li><li>エアープラズマトリート（30 Wで30秒）基板および8アンカー機能。基板（ 図5C）上に存在する正方形のくぼみから4ミリメートルの距離で基板の両端に機能的に結合する。 </li></ol></li><li>クランプ上に膜を取り付け<ol><li>クランプの溝付き円筒部の周囲の基板のそれぞれの端部を包み、上から2止めネジ（ 図2B及び図5D-E）で固定します。 </li><li>クランプホルダーに4クランプをねじ込み、使い捨てのTを使用して、PDMS（比率1:20）注ぐ基板とクランプの溝付き円筒部との界面での順伝達ピペット。 1.5mmの六角レンチを使用して、溝付き円筒部の周囲に、未硬化のPDMSを広げた。 </li><li>完全に毛細管現象によって充填され、2時間後（ 図5F）、80℃でアセンブリを治すまで溝に、PDMS（1:20）注ぐ。 </li></ol></li><li>膜上で細胞を播種<ol><li>エアープラズマトリート（30 Wで30秒）コラーゲンコーティングを可能にするために基板を殺菌し、機能化、アセンブリ全体。 </li><li>細胞を、1時間室温でラット尾部コラーゲンの16μg/ mlのを補充した0.02 M酢酸1mlで播種される基板の面積を官能。所望の最終コラーゲン濃度は、5μgの/ cm 2である。 </li><li>リン酸緩衝液で基板3回すすぎ、それは、室温で乾燥を少なくとも10分間のためにしてみましょう。 </li><li> 10％ウシ胎児干せるを添加した培養培地を40μl加えmおよび1cm 2の （セル密度：20細胞/ mm 2）の面積を覆うように基板の中心部に2,000細胞を含有する1％ペニシリン-ストレプトマイシン。細胞密度は、実験の要件に応じて変更することができる。 </li><li>基板は、その上に細胞を含む培養液滴の上にして、標準的な細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を置きます。注：アセンブリは、細胞がしっかりとそれを添付することを可能にするために、少なくとも3時間、上に向けて基板を保持する必要があります。蒸発を防ぐために、暖かい培養培地の30μlを、基板上の液滴で3時間毎に45分間に添加する。 </li><li> 3時間後、基板を浸して、細胞が増殖することを可能にするために一晩インキュベートし、新鮮な培養培地で満たされたペトリ皿に、アセンブリ全体を反転させる。 </li><li>次の日、HEPES緩衝塩溶液（HBSSを準備し、ヘペス、NaClを120 mMの塩化カリウムの5.3mmで、 硫酸マグネシウムの0.8 mMのCaCl 2を 1.8 mmであり、デの11.1 mMと20 mMのxtrose）。 pHを7.4に調整する。 NOTE：HBSS溶液を毎日調製し、実験の間37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用される。 </li><li>倒立位相差または蛍光顕微鏡マウントBAXSプラットフォームおよびモータのクランプ基板アセンブリ上のセットアップをマウントします。 HEPES緩衝液（ 図2D）でシャーレヒーター内部のペトリ皿を埋める。 </li></ol></li></ol>小口径血管の2。剛性測定<ol><li>準備<ol><li>クレブス生理的溶液：118.1のNaCl、11.1 mMのD-グルコース、25 mMの炭酸水素ナトリウム、4.7のKCl、1.2のMgSO 4、1.2mMのKH 2 PO 4、および2.5mMのCaCl 2の溶液を調製する。 pHを7.4に調整し、30分間カーボゲン医療ガス（95％O 2/5％CO 2）で溶液に酸素。注：クレブスsolutiには、実験中毎日調製し、37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって生きている組織を維持するために使用される。 </li><li>外科はさみ、曲がったピンセット、マイクロはさみ、外科解剖顕微鏡、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管、および10ミリリットル血清学的ピペット：解剖と大動脈血管の機械的な評価のための計測機器を収集します。外科的および実験手順は、任意の無菌状態を必要としません。あらかじめロードセルとともにBAXSプラットフォームのクランプを取り付けます。 </li></ol></li><li>組織分離と解剖 実験動物に関連するすべての実験手順は国の利用者の実験動物の管理と使用に関する健康ガイドに準拠機関、「利用者の動物実験委員会によって承認されなければならない。 <ol><li> 99パーセントのCO 2の吸入（7 PSI）で、マウスの安楽死を実行するプレキシグラス室（ 図6A）内。 </li><li>開いたマウスの腹部とマウスを出血する胸部大動脈を切った。 </li><li>横隔膜、胸郭および肺葉（ 図6B）を取り外します。注：組織を損傷する危険性を最小限に大動脈に装着心を保ち、直接容器に触れないように、心臓を使って操作します。 </li><li>そっと容器と背骨の間切断することにより、心臓、大動脈根および胸部大動脈を削除します。注：完全な組織（ 図6C）の内部構造を維持するために、切除の際に容器内のいずれかの伸長を誘導しないでください。 </li><li>すぐに浸すとクレブス液中の心臓と大動脈を保つ。 </li><li>カットして慎重に血の塊を取り除くためにクレブス液中に大動脈を洗う。マイクロハサミ、ピンセット、外科解剖顕微鏡（ 図6D-E）を使用して結合組織を除去します。注：すべての血管長を保持し、AORを使用容器の向きを決定するために、TICルート。 </li></ol></li><li>血管寸法判別の取付け 容器の剛性を決定するために、アンロードされ、容器の寸法は必要とされ、較正された顕微鏡を用いて決定することができる。 <ol><li>長さ約2mmの大動脈輪を切断して、正確に（ 図6F-G）を設定するキャリブレーション顕微鏡を用いて、長さを測定します。クレブス液中にわきこのセグメントを置く。 </li><li> 2ミリメートルのセグメント（ 図6F）の各々の間の可能な限り小さく、他の大動脈のリングをカット。ルーメンを上にして顕微鏡スライドガラス上にこの小さなセグメントを入れて、校正された顕微鏡の設定（ 図6H）を使用して、壁の厚さを測定します。 </li><li>クレブス溶液でBAXSプラットフォーム上でペトリ皿を記入します（ 図4（c）に挿入図）引っ張ってピンの2ミリメートルの大動脈リングセグメントを挿入します。 </li></ol></li></ol> GE = &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。PDMS基板の製造および硬化の後、A）を搭載 、基板を慎重に、SU-8 2050金型から剥離し、シャーレに脇に置くされています。） は、PDMSで作られた機能を係留し、基板を固定するのに役立つクランプ4に搭載された基板の基板は、次いで、クランプホルダに取り付けられているクランプ4、（挿入図を参照）に取り付けられている。D）を取り付けるための準備機能を有する固定クランプ。C）基質。E）詳しい画像。F基板の下の溝に、PDMSを注ぐの）手順。矢印は、ゆっくりと、毛細管現象により溝を埋めるPDMSを示しています。 454fig6highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図6。準備および胸部大動脈の単離A）の縦方向の腹部切開を通して手術器具や安楽死マウス。B）を製造、胸郭および肺のLOBが削除されます。C）大動脈を慎重に操作するために心を用いて除去される組織。D）に心臓と大動脈をクレブス生理的溶液に入れられる。大動脈は、すべての結合組織を除去して洗浄される。E）心臓および大動脈を示す詳細な絵。F厚さ測定に使用される小さなセグメントに沿って剛性評価のために使用される）大動脈セグメント。GH）正確な長さ（G）及び厚さ（H）各血管セグメントは、逆顕微鏡および分析プログラムを用いて評価される。

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで紹介するBAXSプラットフォームは、組織全体に対する単一の細胞の調査から、メカノの研究に多くの実験を容易にします。また、プラットフォームは、多数の機械的刺激実験や多軸引張試験を可能にし、非常に柔軟で設定可能です。プラットフォームはまた、生理学的条件下で細胞および組織の維持を可能にし、延伸実験の間、同時顕微鏡検査を可能にする。取り付けクランプの適切な...

機械的な微小環境は、組織の発生及び恒常性にし、また疾患1-6に大きな影響を与えるような、増殖、遊走、および分化のような多くの細胞機能において重要な役割を果たしている。長年にわたって、多数の実験的なツールは、機械的に細胞または組織を刺激し、基本的なメカノの我々の理解を高め、疾患6-17の発症および進行を研究することを目的として生体組織の機械的特性を測定するために使用されてきた。しかし、一つは、多くの場合、特定の研究の目標を達成するために、いくつかの異なる実験のデバイスに依存しなければならない。この記事では、機械的特性や機械的な力を全組織長さスケールに細胞内で生物学に果たす役割を調べる研究を可能にし、単一の、多機能、二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームはquantificatioのためにできるだけでなく単離された組織の機械的特性のn個ではなく、単純に適用する能力を容易にし、複雑で、動的歪み場すなわちインビボで起こる延伸への応答を理解するために、生きた細胞である。 BAXSプラットフォームは、細胞や組織に機械的試験と摂動中に生細胞顕微鏡を実行する能力を維持している。 BAXSプラットフォームは、細胞レベルでの基板変形の影響を調査し、生物学的組織（ 図1A）上に引張試験を行うために使用することができる特注の装置である。アルミニウムヒーターは、標準的な10cmのペトリ皿を収容し、温度制御器およびカプトンヒーター（ 図1B）を用いて、37℃で、任意の生理学的溶液を維持するように作製した。このBAXSプラットフォームは、倒立位相差顕微鏡および/ ​​または蛍光顕微鏡上に集積し、同時イメージング（ 図1C）を可能にすることができる。要するに、BAXSプラットフォームは、可動部品が直交する二軸（ 図1D）に沿って配向されたスライド軸受ミニチュア直動ボールに搭載された4本の直線状のボイスコイルモータで構成されている。線形位置決めステージ（ 図1E）に使用されるクランプシステムの垂直移動を可能にするために4つのモータのそれぞれに取り付けられている。各モータの位置は、500nmの分解能（ 図1F）を有する光学式エンコーダによって監視される。すべての4つのモータは、独立して動作コマンド（ 図1G）を実行するための光学エンコーダフィードバックを用いたモーションコントローラで制御される。 LabVIEWのインターフェースは、細胞または組織試料の、完全にカスタマイズ可能な静的および動的変形を生成するために、変位量、速度、及び各モータの加速度を完全に制御できる。 細胞における変形を誘導するために使用される技術は、単にallowinにより達成されるG細胞は、しっかりと柔軟で透明基材に付着した後、BAXSプラットフォームの4つのモータを使用して、この基板を延伸。 BAXSプラットフォームは、ボイスコイルモータ基板を取り付けるクランプのいずれかのカスタム設計されたセットの装着を可能にする。この目的のために、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなる可撓性透明基板は、（ 図2A-C及び図3）を結合させることができるクランプのセットを設計した。クランプは生理学的溶液に暴露されるように、すべての部品は、滅菌を可能にするために、ステンレス鋼から機械加工した。これらのクランプは慎重に（ 図2D）が延伸中に基板へのストレスを最小限に抑えつつ、画像品質を向上させるために顕微鏡対物レンズにできるだけ近接して基材をもたらすように設計されている。 同じBAXSプラットフォームは、ADAPとクランプの適切なセットを用いて、小さな組織試料の剛性を定量化するために使用することができるテッドは軍を監視するための組織サンプルとロードセルのためサポートしています。いくつかのアプローチがBAXSプラットフォームモータに組織をマウントするために撮影することができます。この場合には、ステンレス鋼昆虫minutiensピンは、引張試験（ 図4A-B）を実行するために、血管組織の開口部を通してフックできる。代替的に、自然の開口部のない厚さの組織について、組織の縁部は、いずれかのボイスコイルモータに取り付けられた、または生物学的接着剤の小さなガラススライドに接着し、クランプでモータに取り付けられたクランプを所定の位置に保持することができる。引張りを行うために、小型ロードセルが必要とされるテストし、容易にBAXSプラットフォームモータに組み込ま延伸サイクル（ 図4C）の間に組織に作用する力を測定するために使用することができる。 BAXSプラットフォームは4つのモータから構成されているように、第二のロードセルの導入は、いずれか2つの直交方向に沿って引張試験を行うことができる。この能力は、1がquantifすることができますYと同じ実験中の2つの垂直な方向に沿った単一組織の機械的剛性。 重要なことに、すべての構成で、目的の細胞または組織サンプルは、常にユーザがアクセス可能な恒温槽内に維持される。この能力は、試料の時間応答を調べるために、延伸試料中の薬理学的物質の導入を可能にする。倒立顕微鏡の光軸が遮られないままであるさらに、顕微鏡のすべての形態は、まだユーザーが使用できる。 BAXSプラットフォームのすべての4つのモータが独立しているように、最終的に、関心対象の試料に高度に構成可能な歪み場を適用することが可能である。 インビボ細胞および組織が ​​暴露された複合体とは対照的に、それはこのプラットフォームでは、より適切に模倣することができる延伸異方性伝統的な一軸延伸プラットフォーム7,13,15,18,19へ。また、物理的特性歪み場の実験中にオンザフライで変更することができる。これらの能力は、ユーザが時間的に非常に複雑な、異方性の広い数、および空間的に変化する歪み場に対する細胞および組織レベルの応答を調べることを可能にする。この記事では、利点と制限BAXSプラットフォームのだけでなく、その設計、動作原理、および単一セルおよび全組織実験のための実験の詳細を説明しています。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。BAXSプラットフォームの概要。 37℃Cで細胞および組織を維持するために使用ペトリ皿加熱ヒータのA）は、4つのボイスコイルモータを示すBAXSプラットフォームの上面図である。B）詳細ピクチャ）プラットフォームは、ライブを実行するために倒立顕微鏡に装着することができるストレッチ実験中の細胞イメージング。D）ボイスコイルモータの詳細な絵;プラットホームの可動部分。E）クランプシステムの垂直方向の変位を可能にする線形位置決めステージの詳細な絵。F）モーションコントローラにモータの実時間位置を提供する光学式エンコーダの詳細な絵。G）詳細画像4つの音声コイルモータ、4つの光エンコーダ入力および電力出力を示すモーションコントローラ。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。実験を伸ばすセル用のクランプシステム。基板は、そのアンカーfeaturとクランプの円筒部に巻き付けられる。C）を延伸するためのボイスコイルモータにPDMS基板を取り付けるために使用されるクランプの詳細を示すAB）の画像ES上部の溝に座って。次いで、基板を上部溝に特徴をアンカー/基質をプッシュ止めねじを用いて固定されている。クランプが所定の位置に基板を保持するとともにBAXSプラットフォームのD）イラストレーション。挿入図は、それだけでカバースリップと顕微鏡の対物レンズの上に座っているに付着した細胞を有する基板の詳細図を示す。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 図3膜及びそのクランプシステムの部品表。細胞延伸実験を行うために二軸プラットフォームに集積主要部の寸法を示す図面。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。例クランプシステムの小口径血管の剛性評価のためのクランプシステムの十分。AB）の詳細な写真は直径1mm、マウスの大動脈の変形を誘導するために使用。ステンレス製のピンを慎重に船が両方のピンにスライドすることができるように、オープン三角形に成形した。固定されたモータと左クランプとの間に取り付け、容器とロードセルを保持するクランプを備えたBAXSプラットフォームのC）のイラスト。挿入図は、ピンの上に取り付けられた容器の詳細な平面図を示している。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FluoSpheres fluorescent microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Keep away from light.</td></tr><tr><td>Linear voice coil</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td></tr><tr><td>Ball bearing slide</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td></tr><tr><td>Linear positioning stage</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>Center Drive 1.25&quot; Square Linear Translation Stages</td></tr><tr><td>Optical encoder</td><td>GSI microE systems</td><td>Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td><td>reflective incremental encoder.</td></tr><tr><td>Motion controller</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td><td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td></tr><tr><td>Load cell</td><td>Honeywell</td><td>31 low</td><td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td></tr><tr><td>Insect minutiens pins (0.20 mm)</td><td>Pin Service Austerlitz Insect pins</td><td></td><td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td></tr><tr><td>Air-plasma treatment system</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow Oxygen Plasma System</td></tr><tr><td>Rat-tail collagen</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V</td></tr><tr><td>1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>Temperature controller; supply 24 V.</td></tr><tr><td>DMEM culture medium</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>Keep frozen.</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.02</td><td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES-buffered salt solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs physiological solution</td></tr><tr><td>Carbogen 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs physiological solution oxygenation</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Microtubules depolymerization agent</td></tr><tr><td>Cytochalasin-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Actin filaments depolymerization agent</td></tr><tr><td>Anti-&amp;alpha;-SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td></tr><tr><td>Picrosirius red stain</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>Used to stain and quantify collagen content</td></tr></tbody></table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

細胞や組織、またはそれに機械的な力の適用は、生体組織の機械的特性を定量化することができるためのツールは、基本的なメカノの理解に劇的に貢献してきた。これらの技術は、広く様々な疾患の発症および進行を頻繁に機械的な手がかりの影響を受けているかを示すために使用されている。この記事では、機械的に、単一の細胞を刺激するか、組織の機械的剛性を定量化するか多機能二軸延伸（BAXS）プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームは独立して制御することができる4つのボイスコイルモータで構成されている。単一細胞ひとつ、複雑な動的、および空間的に変化する歪み場に細胞を露出することを可能にモータに取り付けることができるフレキシブル基板上に培養することができる。逆に、力ロードセルを組み込むことによって、人はまた、それらが変形サイクルにさらさ​​れているように、一次組織の機械的特性を定量化することができる。両方の場合において、クランプの適切なセットを設計しなければならないし、しっかりとフレキシブル基板または目的の組織を保持するためにBAXSプラットフォームモータに取り付けられた。 BAXSプラットフォームは、延伸実験の間、試料の構造的または生化学的反応を調べるために同時の透過光および/または蛍光イメージングを実行するために倒立顕微鏡に装着することができる。この記事ではBAXSプラットフォームの設計と使用法の実験の詳細を提供し、単一の細胞や組織全体の研究の結果を提示します。 BAXSプラットフォームは、歪みを基板へと単離したマウス大動脈の剛性を測定するために応じて、単一のマウス筋芽細胞における核の変形を測定するために使用した。 BAXSプラットフォームは、細胞内、細胞および全組織レベルでの新たなmechanobiologicalな洞察を提供するために、様々な光学顕微鏡法と組み合わせることができる汎用性の高いツールです。

細胞体を伸ばす BAXSプラットフォームは、25％の基板変形に露出シングルマウス筋芽細胞（C2C12）における核の機械的応答を調べるために使用した。筋芽細胞は、筋肉組織に見出され、常に生体内で機械的伸張および圧縮に曝される。細胞核の形状及び機械的特性は、遺伝子発現および転写活性20,21の制御に、また、発達障害や、ハッチンソン-...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K ビュー.  University of Ottawa. 我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

生物工学

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

繰返し一軸性歪みを用いた幹細胞の機械的刺激

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

生物学

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...