この作品は、FMFにARRA NSF MRI音源開発助成金＃0923179によってサポートされています。我々は、組織切片の支援についてアクアAsberry、工学のためのパーカーH.プチ研究所バイオサイエンス組織学コア用ラボコーディネーターに感謝。

1。セクショニング組織<ol><li>店舗区画する準備ができるまで-80℃の冷凍庫で急速冷凍、全体の組織。 </li><li> （30分）切片の前にクライオミクロトームの温度に到達するために組織サンプルを可能にする。 -30℃〜ブレードと試料温度を設定</li><li>一度組織が ​​、ピンセットで標本を扱う、温度に達しどんな脳の一部が（ すなわち脳の前面が最も重要である場合には、脳の後部にマウント十分な表面実装用に関心があるに応じて脳の前面または背面をカットしていますチャック上）。 <ol><li>中央にチャック、ピンセットを使用して、それが凝固するまで、10月に行われたサンプルを保持するために〜0.5ミリリットル最適切削温度化合物（OCT、ティッシュ-Tek社、さくら）を適用します。一度10月には、サンプルホルダーにマウントチャック完全に凍結されています。 </li><li>試料をマウントするために使用される、OCTの最小量であることが好ましい（OCTブロックに試料をマウントとは対照的に、一般的に他のヒストグラムで行われるような試料の汚染を最小限に抑えるために論理的な手順）。 10月による試料の汚染は、イオン抑制によるDESIおよびイメージングプロセスに有害である。 </li></ol></li><li>厚さ12-18ミクロンからMS撮像範囲のために必要な典型的な組織切片。推奨範囲内の所望の厚さで節組織。軽くセクションオーバー室温顕微鏡スライドガラスに触れることによって、それぞれの切片組織を融解マウント。サンプルがマウントされると、それは化学物質分布および組成を変更しますので、組織切片に触れないように注意してください。 </li></ol>注：我々は1つの最適化のためのセクション、およびイメージングのために他のを使用して、スライドごとに2つのセクションを取り付けをお勧めします。のセクションでは、スライドボックスで°Cの冷凍庫まで-80で即時イメージング、店舗スライドの分析のための準備ができていない。場合<ol start="5"><li>保存されたセクションを解析する場合は、冷凍庫からスライドを削除し、すぐに真空デシケーターに転送し、許す​​〜15-20解凍しMIN。長くデシケーター中で標本にしておくと、サンプルを乾燥し、DESI効率が低下します。それが融解した後DESIイオン源の最適化は、組織サンプルに行われるが、時間の関係で、試料が解凍される期間は、装置の初期化のための理想的な時間として機能する。 <ol><li>溶剤DESIとして1％酢酸とアセトニトリルを使用し、5μL/分の流量でシリンジポンプをオンにします。より低い流量はDESIスプレーと有効画素サイズの衝撃スポット側を減少させるが、より高い流量が十分な感度のために必要であり得る。したがって、流量は、（典型的には1〜5μL/分）、各アプリケーションと所望の感度および解像度のために最適化されるべきである。注射器が与えられた流量で完全最適化とイメージングのための十分な溶剤が含まれていることを確認。 </li><li>溶剤がソース先端から出滴る表示されたら、圧力と窒素噴霧ガスをオン160 PSIの電子。 </li><li> 3,600を印加するイオン源に接続された高電圧電源をオンV. </li></ol></li><li>モーション·ステージ上にスライドをマウントし、イオン源とMS最適化を開始</li></ol> 2。 DESIの最適化<ol><li> DESIシステムは、ソース·プローブ（ 図2参照）、シリンジポンプ及び又は代替溶媒デリバリーシステム、圧縮窒素、翻訳試料ステージとマウントから成る。質量分析計が適切な質量範囲と関心の分析物のために調整された後DESIソースの最適化を進める。 <ol><li>ソースコンポーネントがまだオンになっていない場合は、方向のセクション1.5.1-3を参照してください。 </li><li>これらのセクションで説明する変数は、生体組織のイメージングのために推奨されています。しかしながら、これらの変数は、組織または試料の種類ごとに最適化されるべきである。代替溶媒、流量、噴霧ガス圧力と電圧がイマジ報告されている生体組織のNG。16-18 </li></ol></li><li>当初DESIソースはスライドガラスに触れていないし、組織切片のいずれかの部分に向けられていないことを確認します。これは、プローブは、初期化プロセス中に損傷されず、組織試料と接触することによって一連の任意の部分を汚染しないことを保証する。 <ol><li>良い開始位置は、試料表面に対して55°の角度でプローブで、先端試料表面から3ミリメートルとMSキャピラリー入口から5ミリメートルである。 DESIプローブの内側の毛細血管は、外側の毛細血管を超えて〜1ミリメートルを拡張する必要があります。これらのパラメータのすべてが最適化される。 </li></ol></li><li>キャピラリMSインタフェースは、イオンの最適な転送のために試料表面に対して〜15°の集光角を有するべきである。試料表面上にMSキャピラリー置いたように、ステージの高さを調整し、キャピラリーはできるだけ近く、表面から&lt;1ミリメートルであるべき触れることなく。 </li><li>彼らは直接に沿ったものであるように、MSキャピラリー入口に対してX次元でDESIプローブの位置を合わせます。 </li><li>余分な組織切片を用いた最適な感度DESIソースのy、zの位置を調整します。 DESIプローブは、一つのサンプル領域に向けられるように、それが最終的に脱着イオン化し、その領域内の分析物のすべてを、これが発生すると信号が徐々に減少することに注意してください。できるだけ早く、この手順を実行することが重要です。 <ol><li>したがって、最適化プロセスを通して、試料は、新鮮な試料を分析して、信号の変更は、ソースの最適化ではなく、試料の枯渇によるものとされていることを確認するために、スプレーヘッドの下に移動する必要がある。しかし、組織の異なる領域の様々な化学組成ことを考慮すると、全体の組織切片を横切るイオン強度の直接比較は、完全に正確ではない。脳の視床は、と合理的に大型の領域を提供より一貫した化学組成が、それでも完全に均一ではない。また、離れてサンプルからのスライドガラス上に（[M] +のm / z 443）染料ローダミン6Gが含まれている赤いシャーピー、、のマーキングDESIによる強いMS応答を提供し、また最適化のために使用することができますが、別のサンプルフォームと検体を考えると、これらの条件はまだ生体組織のための理想的なセットアップに相関しない場合があります。 </li><li>ソースチップとキャピラリー入口との間の推奨Yセパレーション：〜4ミリメートル、チップと試料表面の間に推奨Zセパレーション：〜1.5ミリメートル。けれども、これらのパラメータは、各実験のセットアップのために多少異なる場合があります。 </li><li>プローブの形状および角度を考慮すると、y及びz次元位置が溶媒及び検体を含む液滴の実効伝送に対して相互に関連していることを考慮する。一つの変数の変化は同じスプレー着弾位置を維持するために、他の後続の変更が必要になり、その伝送角度。 </li></ol></li><li>距離の最大感度のソース、及び影響を最小限に抑えスポットサイズの外側の毛細血管から内側の毛細血管押し出しを調整します。注意：この調整をしながら、高電圧がOFFになっていることを確認してください。 </li><li>最大の信号が観測されるとき、ソース·ジオメトリは、最適とみなされる。 <ol><li>セクション2.5から2.6に最適化された変数は、相関関係があり、したがって、1の調整は、本質的に必要なソース·サンプルインレット形状を維持するために、他の再調整、またはセクション1.5.1-で議論条件の調整が必要になります3。 </li></ol></li><li>また、質量分析計へのキャピラリ転送を囲む加熱素子は、イオン化過程中に生成検体帯電液滴の脱溶媒和を容易にすることによって感度を向上させることができる。ここでは、ロープのヒーターを使用するキャピラリーを100℃に設定された転送の周り巻か</li></ol> 3。 Tissu電子イメージング<ol><li>イメージングプロセスの間、試料ステージは、毛管DESIプローブとMS入口の下に試料を移動させ、他のすべてのコンポーネントが静止したままである。ステージの動作パラメータは、DESI衝撃プルームのサイズおよび最適な感度に基づいて選択されるべきである。 <ol><li>より大きな衝撃プルームがより試料を脱着されていることを考えると、より高いイオン強度になり、しかしながらイメージングのために、それは、より大きな画素サイズより悪いので、画像解像度をもたらす。 </li></ol></li><li>この実験で使用並進ステージは家庭構築され、所定の大きさの画像の速度および行間をラスタ走査の制御を可能にするのLabViewプログラムによって制御される。この実験で使用したステージ動作制御VIはomnispect.bme.gatech.eduで入手可能である。あるいは、市販DESI源とステージは、Prosolia社（インディアナ州、USA IN）から自動化された2Dオムニスプレー源として使用することができる。 <ol><li>脳組織のために典型的な画像サイズは10×15ミリメートルであり、使用ステージ動きパラメータが与えられると、画像は約3時間かかります。 <ol><li>プログラムLabVIEWのVIまたは所望の撮影条件と同等の制御ソフトウェア、ステージスキャン80μmの速度/秒、200μmの行の間の行間隔を使用。オムニスプレー源を使用する場合、動きパラメータが100〜200ミクロン/秒の走査速度及び200μmの行間に設定されるべきである。これらの動きパラメータを各寸法と必要な感度で所望の画素数に応じて変更することができることに留意されたい。 <ol><li>小さ ​​い行間隔は、スキャン速度は効果が少ないを有する、画質を改善することが示されている。25しかし、これは必ずしも示し、改善された画像の解像度ないことに注意することは重要であると衝撃スポットに強く依存するサイズ。遅い走査速度が小さい行間隔が大幅分析の時間が長くなり、したがってoptimiでなければならない組織またはサンプルの種類ごとにアルファベットのゼット。 </li></ol></li><li>行間隔がy次元のピクセルサイズを決定するのに対し、1スキャン/秒、1ピクセル/スキャンとして作成された画像に設定MSスペクトルの買収により、ステージ速度は、X次元の画素サイズを定義します。画像の真のピクセルサイズが広がるスプレーによるこれより大きいですが、遅い動きが脱着と検体の検出のためのより多くの時間を可能にします。 </li></ol></li><li> LabVIEWのVI内の画像の間に記録されるべき位置と時間のファイルのディレクトリパスとファイル名を付けます。 </li></ol></li><li>マススペクトルデータ取得のための準備では、撮像に要する合計時間を計算する。我々のグループによって使用されるLabVIEWプログラムは自動的にこの値を提供するが、代替ステージ制御が使用される場合、この計算はMSデータの取得設定する必要がある。 <ol><li>オムニスプレー自動化されたソース及びステージを使用する場合は、画像の各ラインはように取得される分離したが実行されます。時間当たりのラインと所定の撮像寸法のために必要なライン数は、質量分析計ソフトウェアに入力するオムニスプレー制御ソフトウェアを用いて計算される。 </li></ol></li><li>質量分析計のスキャン速度が1スペクトル/秒であることを確認し、計算された合計時間に一致するように計器取得時間を設定します。 <ol><li>スペクトルスキャン速度1スペクトル/秒に設定します。 </li><li> PROFILEモードでデータを取得およびm / zの範囲は、関心のある化学種に適していることを確認する。そのDESIもESIのように、多価の検体を作り出すことを忘れないでください。 </li><li> LabViewのによって与え合計画像時間を一致させるために、取得時間を設定します。 </li></ol></li><li>画像化される領域の左上にスプレーインパクトスポットを配置します。 </li><li>同時にMSデータとステージモーショ​​ンの取得を開始します。 </li><li>データ収集の終了時に、スタンバイモードに質量分析計を返す。 </li><li> DESI源の高電圧をオフにします。 </li><li> Oを回しFFの窒素ガス。 </li><li>シリンジポンプの電源をオフにします。 </li></ol> 4。画像処理<ol><li>マススペクトルデータは、ステージ時間とLabVIEWを使用して、テキストフ​​ァイルとして保存された位置データとの組み合わせで対応するスペクトルを有する画素の座標を相関2Dイメージに &quot;折り畳ま&quot;しなければなりません。 omn​​ispect.bme.gatech.edu：ここで紹介する画像はで自由に利用可能であるMatlabのベースのソフトウェアを使用して処理した。データはオムニスプレー源を用いて取得している場合は、ホタルデータ変換ソフトウェアは、バイオマップ（www.maldi-msi.org）の画像可視化のためのデータ·キューブを作成するために使用される。 </li><li> Jeol AccuTOFの質量分析計で得られたデータは、記録されたクロマトグラムは、さらなる分析のために。CDF形式でエクスポートする必要があります。 <ol><li> MassCenter内データマネージャーを使用して、最初のcentroidedデータ（[ツール]→[変換集録データの重心に）取得したデータを変換します。その後、キーボードの組み合わせはCtrl + Shift + E FOLを使用することによって。CDF形式でデータをエクスポート[ツール]→[エクスポート順となっている。 </li></ol></li><li> OmniSpectウェブサイトに生。CDFの質量スペクトルデータと2つのテキストフ​​ァイル、位置と時刻を、アップロードします。ホタル処理された撮像データは、バイオマップで可視化することができる。 <ol><li>関心の単一イオンの非負行列因子またはプロットすることにより統計分析などのデータをさらに処理は、ウェブサイト上で直接実行することができます。 </li><li>また、生のデータキューブは、MATLABでの解析のためにエクスポートすることができます。 </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+by+Mass+Spectrometry:+A+New+Frontier.">3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier.</a> Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Pulfer, M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+mass+spectrometry+of+phospholipids.">Electrospray mass spectrometry of phospholipids.</a> Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).</li><li>Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalogen+deficiency+in+early+Alzheimer's+disease+subjects+and+in+animal+models:+molecular+characterization+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).</li><li>Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+levels+are+altered+in+down+syndrome+brain.">Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain.</a> Brain Res. 867, 9-18 (2000).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Myocardial+Cardiolipin+Content+and+Composition+Occur+at+the+Very+Earliest+Stages+of+Diabetes:+A+Shotgun+Lipidomics+Study.">Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study.</a> Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

DESIソースジオメトリの最適化が成功したMSIの実験のために重要である。システムの整合に寄与する複数の変数を直接感度と画像解像度に影響を与える。最適化の際に、実験者が信号を得る難しさを持っている場合、我々はベンチマークとしてスライド上に描かれた赤いシャーピースポットを使用することをお勧めし、染料、ローダミン6G、のm / z 443は、正イオンモードで強力な信号を生成し...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50575" target="_parent">Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry</a>. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:
Rachel V. Bennett
instead of:
Rachel V. Bennet

Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

質量分析法による非標的イメージングは​​発見と仮説生成のアプリケーションのための化学情報の取得を容易にします。一方、関心の既知の化学物質の標的とイメージングは​​、特定のメソッドの開発を通じて増加感度と選択を容易にすることができる。質量分析イメージング（MSI）が最も一般的にMALDI、1次イオン質量分析（SIMS）、2及び脱離エレクトロスプレーイオン化（DESI）、3レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化（LAESI）4を含む周囲のイオン化技術を用いて、組織上で実行される5及び液体マイクロ接合面サンプリングプローブ（LMJ-SSP）。MALDIとSIMS 6、サンプルは、それらが高真空下で分析されるので、物理的に試料から除去する必要があり、平坦かつ薄くなければならない。 MALDIは、試料調製に追加の煩雑な工程を追加すること、放射線吸収性マトリックスと試料のコーティングを必要とする。 SIMS最高の方位分解能を持っていますが、高エネルギー粒子による砲撃は、広範な分子の断片化を引き起こす。したがって、周囲の方法によるMSIは最小限のサンプル調製とソフト解析が望ましいニッチを埋める。しかし、現在までに、すべてのメソッドはまだ平らな試料表面の要件によって制限されています。 DESIは、分析物を脱着してイオン化する試料表面に向け空気圧補助充電溶剤スプレーを使用しています。7 DESIによって脱着とその後イオン化のための作業モデルは&quot;ピックアップモデル滴&quot;として知られています。8-10帯電した主滴がDESIプローブによって生成され、それ湿潤剤および分析物が表面から抽出された物質を含む二次液滴の運動量移動し、離陸中に固液マイクロ抽出機構8後続の液滴の衝突の結果により溶解させるに薄膜を形成し、表面に衝突最終的には。9,10、ガス相イオンは、しかし、DESIで正確なイオン形成プロセスが実験的に証明されるには至っていないイオン蒸発、電荷残基モデルまたは他のモデル、11以下のESI状の工程を経て製造されると考えられている。12 DESI感度がの溶解度に強く依存している脱着は、ローカライズされたマイクロ抽出に依存しているようなスプレー溶剤中の分析、図13 ソフトウェア制御の試料ステージで使用する場合、サンプルはDESIイオン化プローブの下にステッピングレーンを一方向に走査され、タイムドメインを介して、のm / z情報は、化学種の空間分布（ 図1）と相関している。 2006年にヴァンケルとケルテスによって報告原則DESI-MSI実験、14技術の最初の証拠は、脂質の分析で報告されたアプリケーションと、かなり3,16薬物代謝物を15に成熟しているので、17,18 diseaSEのバイオマーカー、19脳組織、3,18,20肺組織、18腎臓組織、18精巣組織、18副腎、17薄層クロマトグラフィープレート、21および藻類面。DESI-MSIによって得られた画像の22ルーチン解像度が最終的に有効な表面スプレーすることにより抽出された領域が、40μm以下が報告されているという低い解像度によって決定さ100-200ミクロン、。分析23-25 ​​このような解像度や使いやすさは、迅速かつ簡単な分析のためにDESI-MSIが適切になります0.5〜5センチメートル2の範囲内の表面積を有する生体組織サンプルの、より良好な生物学的プロセス26を理解するのに貴重な空間情報の取得を可能にする。ここでは、典型的DESI-MSIアプリケーションの一例として、我々は、ラット脳組織における脂質の撮像を伴う成功した実験を実施する手続きの詳細を確認する。プロトコルの2つの最も重要なステップは次のとおりです後述するように組織調製27及びDESIイオン源の最適化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura-Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td><a href="http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48" target="_blank">http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0156-6</td>
			<td>OmniSolv, LC-MS Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092-500 ml</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CryoStar* NX70</td>
			<td>Any available microtome can be used for tissue sectioning <a href=" http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar" target="_blank"> http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Omni Spray;DESI Spray Head</td>
			<td>Prosolia Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment <a href=" http://www.prosolia.com/sources.php" target="_blank"> http://www.prosolia.com/sources.php</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>High Voltage Power Supply</td>
			<td>Stanford Research Systems, Inc.</td>
			<td>PS350/5000V-25W</td>
			<td><a href="http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm" target="_blank">http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rope heater, RTD, controller</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters" target="_blank">http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Version 7.1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Translational stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Optiscan II</td>
			<td><a href="http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html" target="_blank">http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AccuTOF Mass Spectrometer</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JMS-T100LC</td>
			<td>Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging of biological tissues by desorption electrospray ionization mass spectrometry

質量分析イメージング（MSI）は、ミクロンスケールの十何百で生体組織を調査するための最高の特異性と空間分解能で非ターゲット分子の情報を提供します。周囲条件下で実行したときに、試料前処理は、取得した情報の高品質を維持しながら、その結果、プロトコルを簡略化不要となる。脱離エレクトロスプレーイオン化（DESI）があっても、生体内で 、オープンエアでの表面の直接サンプリングが可能にスプレーベースアンビエントMSI技術です。ソフトウェア制御の試料ステージで使用する場合、サンプルはDESIイオン化プローブの下にラスターされ、タイムドメインを介して、のm / z情報は、化学種の空間分布と相関している。 DESI-MSI出力の忠実度は、試料表面と質量分析計の入口に対するソースの向きおよび位置に依存する。ここで、私たちは、私がDESIため組織切片を準備する方法について検討しmagingと直接画質に影響を与える追加の実験条件。具体的には、DESI-MSIによるラット脳組織切片の画像化のためのプロトコルを説明する。

図3は、未処理ラットの脳切片から得られた代表的なスペクトルを示す。ポジティブモードでは、質量スペクトルは、その高いイオン化効率（正に荷電した第四級アンモニウム基に起因する）に起因ホスファチジルコリンによって支配される。組織切片の総イオン画像も全体の脳切片を横切る豊富な信号を示し、 図3に示されている。検出したキー脂質は文学の比較?...

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Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法（DESI-MS）は、生体組織を含むサンプルは、最小限の試料調製で画像化される際、周囲の方法である。イオン化プローブの下のサンプルをラスタでは、このスプレーベース技術は組織切片内の関心の分子的特徴を識別するのに十分な空間分解能を提供します。

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

imaging-biological-tissues-desorption-electrospray-ionization-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.4K ビュー.  Georgia Institute of Technology. 脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法（DESI-MS）は、生体組織を含むサンプルは、最小限の試料調製で画像化される際、周囲の方法である。イオン化プローブの下のサンプルをラスタでは、このスプレーベース技術は組織切片内の関心の分子的特徴を識別するのに十分な空間分解能を提供します。

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）を用いて細菌揮発性物質の特性評価

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

生物工学

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

飛行時間型質量分析法と2Dガスクロマトグラフィーを用いて藻類の水熱液化からの水性画分の質的特性評価

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).