この記事では、主にDESI-MSIを使用して植物サンプルを調製し、イメージングする費用対効果の高い方法について説明し、窒素が吹き込むと簡単に破壊される乾燥組織に関連する欠点を克服できます。根はクライオスタットミクロトーム上で凍結切片されたが、葉は刷り込みによって調製されたが、これは高価な機械を必要とするか、または信号強度を失う。私たちの方法はこれらの制限を克服することができます。
この方法は、非生物的および生物的ストレス下にある植物における毒物の分布および移動などの植物の空間メタボロミクスに使用することができる。はじめに、2歳のサルビアmiltiorrhiza植物からきれいにされた根と葉を取り、約3〜5ミリメートルの断面の厚さで直接スライスします。次に、両面テープを使用してサンプルを接着顕微鏡スライドガラス上に貼り付けます。
サンプルの上に別の顕微鏡スライドガラスを置き、サンドイッチのようにシーリングフィルムで包みます。次に、サンドイッチサンプルを摂氏マイナス80度で少なくとも4時間凍結し、トラップされた温度を摂氏マイナス75〜マイナス82度、真空計を摂氏2.5〜3.7パスカルで2時間空気真空にします。分析のために、冷蔵倉庫からサンプルを取り出した後、サンプルをマトリックスアプリケーションにかける前に、サンプル表面の結露を避けるためにデシケーターで室温に持っていきます。
エレクトロスプレーイオン化(ESI)モードで機器検出器のセットアップと質量校正を実装します。水中のアセトニトリル中のロイシンとセファリンを1対1の比率で使用して検出器のセットアップを実行し、ギ酸ナトリウムと水イソプロパノールを1対1の比率で質量校正を実行します。ESIソースを取り出し、DESIユニットを質量分析計に取り付けます。
窒素ガス供給をDESIユニットに接続し、ガス圧力を約0.5メガパスカルに調整します。5ミリリットルのシリンジにロイシンとセファリンとギ酸を水メタノールに1対9の比率で充填し、シリンジを高性能シリンジポンプに取り付けて、サンプル中の化学物質をイオン化するための溶媒を供給します。次に、溶媒供給キャピラリーをシリンジとDESI噴霧器に取り付けます。
溶媒供給キャピラリーは、内径75マイクロメートル、外径375マイクロメートルの寸法の標準キャピラリーです。シリンジポンプを始動し、注入速度を毎分2マイクロリットルに設定して、溶媒の一定の流れとスプレーを得る。窒素ガスバルブをオフにし、約15秒後にオンにします。
溶剤の小さな滴がステージに吹き出し、溶剤の流れが一定の状態にある場合はスプレーが見られます。次に、噴霧角度、XYZ軸、突起、高さの観点から噴霧器の位置を調整します。赤と黒のマーカーを基準として使用して質量分析信号を最適化し、感度モードで約10〜5倍の信号強度を取得します。
噴霧器の突起は信号強度に影響を与える最も重要な要因であるため、5ミリレンチを使用して窒素ガスガードを交換して突起を調整します。スプレー方向は、マス画像の品質に影響します。したがって、スプレーがまっすぐになるまでスプレーを回転させます。
これらすべての手順を完了すると、セットアップは実験の準備が整い、初期設定後、通常、約 3 週間の使いやすさで安定しています。DESI-MSイメージングでは、サンプルの前処理は必要ありません。ただし、可能であれば、スライド上の余分なメディアを取り除きます。
スライド上のサンプルの画像を撮ります。不純物を避けるためにサンプルの表面に触れることなく、AとBの2つのプレート位置があるDESIステージのプレート位置にスライドを置き、標準スライドまたはフルスライドを使用して位置に収まります。フルスライドは最大4つのスライドを収容できるため、実験用の領域がはるかに大きくなります。
高精細大量画像処理ソフトウェアを開きます。[取得]タブで新しいプレートを設定し、正しいプレート位置(AまたはB)とプレートタイプを選択します。[イメージの選択] ページで、スライドの四隅を選択すると、イメージが正しい向きに自動調整されます。
MSパラメータを設定するには、親イオンのみが検出される一般的に使用されるDESI-MSモードとして実験タイプを選択します。次に、機器は実験で1つの極性しか使用できないため、極性を正または負のいずれかとして選択します。次に、感度モードを適用して、少量の化学物質に関する詳細情報を取得します。
次に、[パターン]タブでスキャン領域を定義する長方形を描画し、ピクセルのXサイズとYサイズを等しくしてピクセルサイズを設定します。スキャン速度をピクセルサイズの5倍以下に設定します。プロジェクトを保存し、MS取得ソフトウェアのワークシートをエクスポートします。
次に、ワークシートをMS取得ソフトウェアにインポートし、新しいサンプルリストとして保存します。[実行の開始]を押してMS画像スキャンを開始し、さらにワークシートをインポートすることで複数の画像を実験キューに追加できます。サンプルのデータファイルを大量画像処理ソフトウェアにロードし、DESI画像処理のパラメータを設定します。
ロイシンとセファリンが内部ロック質量に使用され、ロック質量が実験の極性を特定する唯一のポイントであるため、正しいロック質量を設定することが重要です。正モードの場合は556.2772、負モードの場合は554.2620に設定します。ターゲット化学物質のリストを作成するには、処理されたデータファイルをロードして、サンプルのDESI画像を視覚化します。
[正規化]ボタンをクリックして、トータルイオンクロマトグラフィーでデータを正規化し、特定の化学物質の基準に対する相対強度を取得すると、異なるサンプルを相互に比較できます。関心領域 (ROI) を描画し、サンプル画像に複数のコピーをコピーします。次に、すべてのROIを選択し、多変量解析をエクスポートして、すべてのROIからMS情報を抽出します。
根および葉全体の切片の質量分析イメージングは、選択された化合物の空間分布を示す。各ピクセルの色は、質量電荷比の相対強度を表しているため、サンプル全体の自然分布と代謝物イオンの存在量に関連付けることができます。標的化合物であるタンシノンIIAとロスマリン酸の分布は、根のさまざまな領域で見ることができます。
葉切片でタンシノールAが検出された化合物 再現性を目指すプロトコールとして、噴霧器の位置を多次元に調整して信号強度を最適化することが最も重要なことである。
