この作品は、主に1-R21-ES019498およびR44-ES021116からの部分的な支援を受けて5-UO1-ES016045によりサポートしていました。 DMWは環境毒性学T32-ES007020中NIEHSトレーニンググラントによってサポートされていました。機器は、環境健康科学P30-ES002109センターから提供された。

チップの作製<ol style="margin-left: 40px;"><li>パッケージからチップゲルを取り外し、1ウェル矩形板、ゲル膜面を下に配置します。 </li><li> 2回繰り返す、15分間、PBS 1×25mlのゲルを洗ってください。 </li><li>それに応じてゲルのガラス板とラベル向きにゲルを設定します。 </li><li>静かにゲル上に反転した底なしの96ウェルプレートを押してください。底なしのウェルプレートのすべてのウェルがゲルの領域内にあることを確認してください。 </li><li>ガラスでクランプを固定するためのプレートの両側に1.5 &#39;&#39;バインダークリップを使用してください。 </li><li>過剰のPBSオフ吸引し、各ウェルにバッファー。 </li></ol> 2細胞に添加する<ol style="margin-left: 40px;"><li>細胞懸濁液を準備します。 <ol><li>懸濁細胞株については、10 5〜10 6細胞/ mlの最終濃度を得るために、培地中の細胞懸濁液を希釈する。 </li><li>接着細胞株については、通常の取り外し/トリプシン処理プロトコルおよびdに従ってください10 5〜10 6細胞/ mlの最終濃度になるように培地中の剥離した細胞をilute。細胞が凝集した場合、単一細胞懸濁液を得るために、細胞フィルタで細胞懸濁液を渡す。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加える。 </li><li>ゲルフィルムでカバープレートは、媒体の蒸発を防止する。 </li><li>細胞を37℃のインキュベーター中で少なくとも30分間ロードします。 </li><li>各ウェルから培養器と吸引メディアからチップを取り外します。 </li><li>バインダークリップと底なしの96ウェルプレートを取り外し;角度でガラス板を有するチップを持ち、静かにアガロース上で余分な細胞を除去するために1×PBSですすいでください。 </li><li> 4X対物レンズ明視野顕微鏡を用いて細胞の負荷を確認してください。不十分な荷重が観察されている場合は、ステップ2.1から繰り返します。 </li><li>でも、面（実験台）に搭載されたチップを置きます。 37℃に予め加温し、1％低融点（LMP）アガロースオーバーレイチップ。およそ使用2̵1、LMPアガロース3mlを各チップのために必要とされる。 </li><li>オーバーレイが3分間RTで最初に固化した後、完全なゲル化のために5分間、4℃の冷蔵庫に移動できるようにします。 </li></ol> 3投与と修理注：ステップ4に進み、ベースラインDNA損傷レベルを研究する。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>慎重に新しい底なし96ウェルプレートのウェルで（前のクランから作成）チップのウェルの位置を合わせます。バインダークリップでトップとセキュアクランプで再プレス底なし96ウェルプレート。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに所望の用量の化学物質の100μlを加える;氷の上または所望の時間のために4℃の冷蔵庫内に投与/処置を行う。 </li><li>各ウェルから、吸引化学物質を投与し、1×PBSを用いて、残留化学物質を洗い流すの後。直接的な被害がここで研究されている場合は、ステップ4に進みます。 </li><li>修復動態を研究するために、チップ内の細胞がで修復することができ37℃での媒体。特定の時点で溶解する（ステップ4に進む）。 NOTE：修復は、添付の底なし96ウェルプレートにオンチップで行うことができ、またはチップは底96ウェルプレートを除去した後に個片に切断することができる。 </li></ol> 4。溶解<ol style="margin-left: 40px;"><li>アルカリコメットアッセイを実行するには： <ol><li>溶解ストック溶液（2.5 MのNaCl、100mMののNa 2 EDTA、10mMトリス、pHが10）をアルカリ性にするために、1％トリトンX-100を添加することによってアルカリ溶解ワーキングバッファーを作る。各チップのために働くの溶解緩衝液約25ミリリットルを用意します。 </li><li> 4℃でのプレチルワーキングアルカリ溶解バッファー。 </li><li>クール作業アルカリ溶解緩衝液中でチップを浸し、溶解は4℃の冷蔵庫内でO / Nを実行することを可能にする。 </li></ol></li><li>ニュートラルコメットアッセイを実行するには： <ol><li>中性溶解ストック溶液（2.5 MのNaCl、100mMののNa 2 EDTA、10、1％トリトンX-100および10％DMSOを添加することにより中性の溶解緩衝液を作る作業mMトリス、1％N -Lauroylsarcosine、pHは9.5）。チップごとに、溶解緩衝液の作業を約25ミリリットルを用意します。 </li><li> 43℃で中性の溶解バッファーワーキング事前暖かい。 </li><li>暖かい作業中性溶解緩衝液中でチップを浸し、溶解は43℃のインキュベーター中でO / Nを実行することを可能にする。 </li></ol></li></ol> 5。電気泳動<ol style="margin-left: 40px;"><li>アルカリコメットアッセイを実行するには： <ol><li>溶解バッファーを外し、すぐに1×PBSでチップをすすぐ。 </li><li>ゲルフィルム側は、両面テープを用いて、下にして電気泳動チャンバー内のセキュアチップ。 </li><li> 4℃の低温室にチャンバーを持参してください。 </li><li>ただゲルをカバーレベルに冷たいアルカリ電気泳動バッファー（0.3MのNaOH、1のNa 2 EDTA）でチャンバーを埋める。 </li><li> 40分間アルカリ巻き戻しを可能にします。 </li><li>低温室で30分間、1 V / cmの300 mAで電気泳動を実行します。茶中の電気泳動バッファーの量を調整します希望流れる電流を達成するためにmber。 </li></ol></li><li>ニュートラルコメットアッセイを実行するには： <ol><li> 4℃で2×15分間、溶解緩衝液を取り出し、中性の電気泳動緩衝液でチップを洗浄（2のNa 2 EDTA、90 mMトリス、90 mMのホウ酸、pH8.5）に。 </li><li>ゲルフィルム側は、両面テープを用いて、下にして電気泳動チャンバー内のセキュアチップ。 </li><li> 4℃の低温室にチャンバーを持参してください。 </li><li>ただゲルをカバーレベルに冷たい中立電気泳動バッファー（2のNa 2 EDTA、90 mMトリス、90 mMのホウ酸、pH8.5）でチャンバーを埋める。 </li><li>ゲルは60分間低温室で静置する。 </li><li> 0.6 V / cmであり、低温室での60分間の6ミリアンペアで電気泳動を実行します。希望ランニング電流を達成するために、チャンバー内に電気泳動緩衝液の量を調整します。 </li></ol></li></ol> 6。蛍光イメージング<ol style="margin-left: 40px;"><li> COLから電気室からチップを取り外しDルーム。 </li><li> 4℃の冷蔵庫内で2×15分間、中和緩衝液（0.4 Mトリス、pH7.5）中でゲルを中和する。 </li><li>工場推奨手順の下で（ すなわち 、SYBRゴールド、臭化エチジウム）、選択した蛍光DNA染色でチップを染色。蛍光顕微鏡を用いた画像。 </li></ol> 7。データ解析そのようなコメット5.5などの標準コメットアッセイソフトウェアによって彗星の画像を分析します。

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The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

環境での、また、ヒト細胞内のユビキタス遺伝毒性物質は避けられないストレスや細胞のDNAに損傷を及ぼす。実際には、定常状態での18のヒト細胞中に存在するDNA損傷の1,000sがあることが推定されている。ヒトで損傷感受性と修復動態を理解することは、基礎研究への洞察をもたらすだけでなく、医薬品開発に利益をもたらすだけでなく、。皮肉なことに、癌を促進するためのDNA損傷の能力にもかかわらず、DNA損傷剤は、DNA損傷についての知識を作り、癌を治療し、個別化医療に関連する修復するために、非常に高いレベルで使用される。 CometChipは、長期存在していたDNA損傷アッセイに革命をもたらす微細加工慣行を利用した新規研究デバイスである。伝統的なコメットアッセイの同じ原則を踏まえ、チップが有意に高いスループットと優れた再現性を提供します。ここでは、このチップを使用するための方法を記載する。その有用性と堅牢性を明らかにするために、前後に結果を示すチップは、複数の異なるDNA損傷剤によって誘発された損傷を評価するために使用されており、それがDNA修復を評価するために使用されている場合、いくつかの実験をメートル。総合すると、ここに示された結果は、チップを使用するための役立つ情報を提供し、DNA損傷と修復の研究に幅広い適用性を実証する。 このプロトコルの中で最も重要な工程の一つは、効果的なセル負荷を達成することである。多くの細胞系は、懸濁および接着細胞の両方を含む、このシステムで試験されている。積載効率は、細胞型、細胞の大きさ、添加濃度と時間などの多くの変数に依存する。そのようなリンパ芽球様細胞などの浮遊細胞株は、で動作するのが最も簡単です。細胞懸濁液の濃度は、通常15〜30分間で完了し、96ウェルローディング10 4から10 6個の細胞まで変化しうる。高い細胞密度は、ローディングを容易にし、マイクロウェル中に沈降する細胞に要する時間を短縮。 接着細胞のためのパラメータをロードすると、浮遊細胞とは異なる場合があります。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のような細胞株は、（トリプシン処理後）浮遊細胞と同様の積載効率を有し、したがって類似の荷重条件を使用することが見出された。簡単に懸濁液中の細胞凝集体を形成する腫瘍細胞などの他の細胞型は、追加の処理を必要とする。単細胞フィルターを通して細胞懸濁液を通過させ、懸濁媒体にトリプシンを添加してロード中に細胞クラスターの形成を抑制することができる。最後に、ロード時間の点で、マイクロウェルに付着した細胞株を捕捉するために必要な時間は1時間と20分で変えることができる。その結果、ユーザはさらなる調査に進む前に、最適な負荷条件を決定するために、パイロット実験を行うことが推奨される。ロード効力は、明視野顕微鏡下で可視化またはより正確にDAPIまたは他のDNAをカプセル化細胞を染色することによって明らかにすることができる蛍光顕微鏡下での評価に先立って汚れ。 この方法は、チップの1つの主要な利点は汎用性である。最初に、過剰な細胞は洗い流すため、研究者は、特定の作業用細胞濃度に限定されず、マイクロアレイは、均一彗星密度を保証する。第二に、マイクロウェルは、異なるサイズの細胞型に対応するために可変サイズで作ることができる。複数のセルが単一のマイクロウェル内に捕捉される状況下では、マルチセル彗星は、自己較正され、単一細胞彗星6,7と比較して一貫した結果をもたらす。マイクロアレイ中の細胞をパターン化する別の利点は、すべての彗星による非集束彗星にノイズを低減し、自動イメージングおよび分析を容易にする、固定された位置と同じ焦点面に、次にであることである。 CometChipが提供するスループットと感度の大幅な改善は、大規模な研究のためのアッセイの適用を可能にする。総合すると、チップが提供研究者、毒物学者、臨床医と疫学者のためのDNA損傷を評価するためのsaの貴重なツール。 コメットアッセイは、DNA損傷の広い範囲を検出するのに優れた感度のために知られているが、このアッセイは、低特異性に苦しむ。このプロトコルを使用すると、大幅にアッセイの再現性とスループットが向上しますが、特異性において進歩を示さない。それにもかかわらず、他の方法を用いるアッセイは、より高い特異性を達成するの​​に有効であることが報告されている多重化する。一例は、精製された病変特異的酵素を含めることである。これらの酵素は、検出可能な鎖の切断や塩基部位1,19-21にそうでなければ検出できない基本病変を変換することができます。広く使用されている例では、酸化的DNA修飾19,22を明らかに修復エンドヌクレアーゼホルムアミドピリミジン-DNAグリコシラーゼ（FPG）である。酵素消化ステップは、細胞溶解後に適用されるので、システムは同じようにaを処理することができるプロトコルへの変更なしでのsa伝統的なアガローススライド。詳細なプロトコルは、ここで説明されていないが、このアプローチは、過去の多くの伝統的なコメットアッセイユーザによって適合されており、プロトコルは容易に見つけることができる。以前の出版物では、蛍光灯の光誘起損傷22を識別するために、このメソッドを使用していました。 この方法の主な利点は、以前には事実上不可能だったの研究への扉を開き、それが提供するスループットである。同じプラットフォーム上で96サンプルを処理する能力は、手間と時間を削減するだけでなく、実験的なノイズを低減し、大幅に再現性を高めるだけでなく。インターサンプルの変動は、このチップ6,7で観察された変動よりも2倍高くなることがあり、伝統的なスライド·ツー·スライド変動よりも著しく低い。ノイズの低減はまた、サンプル間のより微妙な違いの検出を可能にする、改良された感度をもたらす。デバイスがSTAを採用しているためndard 96ウェルフォーマットでは、一般的な研究機器やHTS技術と互換性があります。平均研究者が数日間にわたって〜30のガラススライドを処理できると仮定して、100サンプルの評価を必要とする研究を考えてみましょう。各サンプルは、トリプリケートで実施される必要があることを考えると、それはまた、必然的に変動をサンプリングするサンプルから被るような研究を完了するために約1ヶ月かかる。対照的に、このチップを搭載した処理条件100、トリプリケートでそれぞれが、わずかプレートを必要とし、三日間で行うことができる。このスループットの大幅な改善は、以前には達成不可能であった研究のへの扉を開きます。 ここで紹介するプロトコルは、標準のコメットアッセイを実施するための基本的な手順やCometChipプラットフォームを使用するために必要な変更された手順の両方について説明します。本来のDNA損傷のレベルとその後の修復応答の両方を測定する能力を、アッセイは非常に適切である生物学的および臨床的なさまざまなアプリケーション。ゲノム上の特定の化学暴露の影響に関する情報は、病気の予防と治療を容易にします。さらに、DNA損傷感受性および個人23,24間の修復能力の変動を決定する上での重要な関心もある。この技術は、大規模な研究に必要なスループットを提供する。個体間のばらつきについての知識は、影響を受けやすい人々を識別するための個別化治療法や予防策戦略を設計するために重要である。ここで紹介する技術は、近い将来には、標準的な方法になる可能性が高いスループット、客観的かつ定量的なDNA損傷解析プラットフォームを提供し、一緒になって。

単細胞ゲル電気泳動（コメットアッセイ別名）（SCGE）アッセイは、ベース病変、脱塩基部位、一本鎖切断、二本鎖切断、架橋アルカリ敏感含むDNA損傷の広いスペクトルの定量化のために広く使用されている技術であるサイト。アッセイの基礎となる原理は、損傷を受けたDNAが損傷を受けていないDNAよりも起因する断片化と超らせん構造の損失をより容易に移行することです。移動の程度は、DNA損傷の量に比例し、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。画像キャプチャおよび個別彗星状のDNAの強度プロファイル分析は、セル1-4内のDNA損傷のレベルを明らかにするために尾部にかかるテール長、テールモーメント、および％DNAなどのパラメータ測定値を提供します。 a）は、アルカリコメットアッセイおよびb）中立コメットアッセイ：現在、コメットアッセイの2一般的に使用されるバージョンがあります。アルカリコメットアッセイは、最も広くですこのように、電気泳動の前にDNAを巻き戻すために高pH緩衝液を使用し、使用済みのバージョンは、鎖切断とアルカリ感受性部位のすべてのタイプを検出します。それは、二重らせんを維持するだけで二本鎖切断2,5を検出するための中性緩衝液を使用しているため、中性コメットアッセイは、一方では、より少ない実施される。 DSBを誘発する化学的および物理的なエージェントの場合、のSSBが協調して作成され、非常に高いレベルで形成されている（ 例えば 、γIR誘発性のSSBはDSBはより一般的な大きさのオーダーである）。ほとんどのDNA損傷のエクスポージャーについては、DSBのはそれほど頻繁にDNA損傷の他のクラスよりも、従って検出することが困難です。私たちは、以前の刊行物に両方のバージョンの検出窓を示した。6,7 コメットアッセイは日常的にDNA損傷と修復および遺伝毒性試験の1,2,8-15の基礎研究のために使用されてきたが、このアッセイは、原因サンプル対に乏しい再現性が報告されているサンプル、個人対個人およびLAB間の変動性。さらに、アッセイは、画像取得及びデータ解析が面倒である部分であるため、低スループットである。一緒に、これらの制限は、大規模な研究でその比較的低い受諾に貢献しています。エンジニアリング技術と原則の統合により、CometChipは、従来のコメットアッセイ6,7に関連しているスループットと矛盾の問題を解決をもたらします。簡単に説明すると、チップを作成するために、金型は、単一細胞と同程度に小さい直径を有するマイクロポストを作成するためにフォトリソグラフィを用いて微細加工されている。次いで、金型ゲルが固化した後にマイクロウェルのアレイが得られる、溶融アガロース上にスタンプするために使用される。チップは、異なる細胞型と互換性を可変サイズのウェルを有する研究者に提供するために開発されている。チップをロードするには、培地中の細胞は、重力によってウェル内に定着させている。過剰細胞が洗い流される。捕捉された細胞は、その後私たちにカプセル化され低融点アガロースの薄い層をると、底なしの96ウェルプレートを、その底面にマイクロウェル数百の96 macrowells、それぞれを作成するためにゲル表面にクランプされる。 このプロトコルは、ゲル剤、セル負荷、投与および修復、細胞溶解、電気泳動、および蛍光イメージングを含む、このチップを用いた実験のための一般的な手順について説明します。私たちは、それぞれのアッセイのアルカリ性および中性のバージョンを使用して、既知のDNA損傷剤に曝露リンパ芽球細胞を用いた用量反応実験の2つの例を示す。二つの修復実験も修復応答後露光システムを用いて評価することができる方法を説明するために示されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

この最初の例では、H 2 O 2を用いた酸化的損傷への曝露後にヒトリンパ芽球細胞におけるDNA損傷の初期濃度を定量化するためのアプローチを記載する。 H 2 O 2誘発ベース病変および一本鎖切断を評価するために、アルカリ性コメット条件が使用されている。ロードが完了し、細胞がアガロースオーバーレイでカプセル化された後、底の96ウェルプレートは、チップ上の96の区画を作成するために表面に押し付けられる。 96ウェルのそれぞれは、異なるタイプまたは化学物質の濃度を投与することができる。ここでH 2 O 2、4つの異なる用量を用い、1×PBSを陰性対照として使用した。配列彗星の代表的な画像は、非処理図1A、（上）、50μM（中央）および100μM（下）H 2 O 2 -exposedサンプルはコメットテイルの異なるレベルを示したに示されている。コメット画像の分析はperforすることができ一般に、各コメットテールの総蛍光強度および移動距離に基づいて損傷レベルを定量化する市販のソフトウェアを使用してのmed。測定は一般に条件当たり50〜100彗星上で実行され、中央値（％テールDNAまたはテールの長さのいずれか）が計算される。 図1Bは、Hの4つの異なる濃度にさらさTK6リンパ芽球様細胞彗星から分析パーセンテージ尾DNA応答曲線を示す2 O 2。独立した実験間の一貫性は、細胞中の化学処理のさまざまなレベルのDNA損傷応答を評価する際にこのアプローチの有効性を示す。 （macrowellsの中など ）と同じ実験の繰り返しの中で、サンプル間のばらつきの詳細については、サンプル間および実験間のばらつきは、それぞれ、 図2Aおよび図2Bにプロットした。 96ワットの各実験内で、各ウェルエルチップは、異なるサンプルと同等であるので、ウェル間の変動は、デバイスのサンプル間のばらつきを明らかにする。ここで、96ウェルマイクロチップの12ウェル中にロードされたTK6細胞を、H 2 O 2の同じ用量で処置し、直ちに処理した後に溶解した。他の全ての実験工程を並行して行い、各マクロウェルから少なくとも50彗星の中央値は、 図2Aにプロットした。標準偏差は3.99パーセントであると中央値の平均は、尾で77.53パーセントのDNAである。これらのデータからは、サンプル間の変動係数は、いくつかの5.2％が、このアッセイ6,16の改善された堅牢性を実証し、従来のアッセイよりも低倍される。計算アッセイの再現について学ぶために、私たちは、75μMのH 2 O 2を用いてチップ内のTK6細胞を露出し、DNA損傷の即時レベルを分析する。この実験は、各実験の6回、データがFでプロットした繰り返した。igure 2B。同一の実験条件下では、私たちは、図に灰色のバーとして示し、41.76パーセントから57.87パーセントに及ぶ結果が得られた。 6反復の平均は、2.04パーセントの平均値の標準誤差で、49.57パーセントである。リピート間の低い変動がこの小説のデバイス上で実行コメットアッセイが高度に再現可能であることを意味します。 修復速度を評価するために、細胞を処理した後、新鮮な培地中でそれらのDNAを修復させる。さまざまな時点でmacrowellsを溶解することは時間をかけてDNA損傷の変化を明らかにする。例が図3に示されている。この実験では、TK6細胞を最初に、チップに封入した50μMのH 2 O 2で処理し、60分後露光まで修復させた。細胞は、それぞれ0、20、45及び60分で溶解した。異なる時点での代表的なコメット画像は、 図3Aに示されており、経時的なDNA損傷のレベルの変化を図にプロットされている図3（b）。このデータは、ほぼ全ての損傷の45分後にH 2 O 2処理内で修復されることが明らかになった。多くの変数が使用される細胞株および化学剤の種類を含む、修復の速度に影響を与えることができる。したがって、研究者は彼らの調査で追加のニーズに対応するために（ すなわち 、修理時間を延長する）プロトコルに変更を加えることができます。 TK6細胞は、異なる遺伝毒性物質でチャレンジされるここでは、このチップを使用して修復実験の別の例を提供する、N -メチル- N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine（MNNG）は、7 -メチルグアニンを含むベース病変を誘発することが知られているアルキル化剤である及び3 - メチルアデニン。これらの病変は自然発生的な脱プリンまたはDNAグリコシラーゼによる酵素の除去のいずれかの部位を脱塩基に変換されます。得られた脱塩基部位は、アルカリ条件下で切断し、チップ上で検出することができる。最初の曝露は、長いから明らかな損傷の有意な増加を引き起こし細胞が修復中に無傷のDNAを復元するように尾部は、時間の経過とともに、これらの尾が低減される。アルキル化および酸化的損傷が両方の主に塩基除去修復経路によって修復されますが、生成された病変の量や修復に関与するタンパク質が異なります。これらの変化は部位、ならびに得られた脱塩基部位の修復の異なる速度を脱塩基への変換の異なる速度をもたらすことができる。 図4では、TK6細胞の修復速度は0.1、1に曝露し、そしてMNNGの3 / mlのが示されている。 MNNG誘発性の損傷が長く持続することが表示され、H 2 O 2誘発損傷に比べて遅い速度でクリアされるため、この実験では、2時間の露光後に実験時間を延長した。 中性条件を用いてDSBの分析は、アルカリ性条件を使用して一本鎖病変の分析のためのプロトコルに非常に類似している。初期損傷レベルを示すために、TK6細胞をGIRの変数のレベルに暴露し、<html>そして得られた細胞を溶解し、中性pH（ 図5A）で電気泳動した。これは、コメットテイルの形態は、アルカリ性アッセイ条件とは異なることに注目すべきである。このアッセイを使用して観察可能な断片化DNAを達成するために、使用されるIR用量は、アルカリ性条件を使用して損傷を見るために必要とされる用量よりも（0-100 Gyの）有意に高い。また、テールの長さが中性コメットアッセイ7を使用する場合にDNA損傷の程度を反映し、最も敏感なパラメータであることを見出した。分析した用量応答曲線は、 図5Bに示されている。細胞におけるDNA二本鎖切断の修復も評価することができ、Weingeist らによって示されている。ら 。7。総合すると、ニュートラルCometChipは、DNA DSBのハイスループット解析のための貴重なツールを提供しています。 1highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図1。アルカリ性コメットアッセイを用いてTK6細胞のH 2 O 2の用量応答。未処理TK6リンパ芽球からの（A）アレイ化マイクロウェル彗星（上）およびTK6細胞を50μM（中央）および100μM（下）H 2 O 2に曝露さ4°Cで20分間。スケールバーは100μmである。 （B）H H 2 O 2のさまざまなレベルにさらさTK6細胞の2 O 2の用量応答。各データ点は、少なくとも50の個別彗星の中央値のパーセンテージ尾部DNAを、各実験で得られた3つの独立した実験の平均である。エラーバーは、3つの独立した実験から平均値の標準誤差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。サンプル間とインター実験変動。（A）サンプル間の変動。 TK6ヒトリンパ芽球細胞を96ウェルチップの12ウェルにロードした。各ウェルを、50μMのH 2 O 2100μlに暴露した 4°Cで20分間。セルはすぐに溶解し、％テールDNAを分析した。各ウェルのデータがここに示されています。各ボックスには、中央値、各ウェルから少なくとも50の個別彗星を表します。 12ウェルの平均で77.53パーセントであり、標準偏差は3.99％であり、変動係数は5.2％であると計算される。 （B）実験間のばらつき。 TK6ヒトリンパ芽球細胞を4℃で20分間、75μMのH 2 O 2100μlに露出し、96ウェルマイクロチップに装填した。セルはすぐに溶解し、％テールDNAを分析した。同じ実験を6回繰り返し、各繰り返しのデータは灰色のバーとして示されている。各ボックスには、各繰り返しから少なくとも100個の彗星の中央値％の尾DNAを表しています。 6反復の平均は、ここに戻ってバーとして示され、49.57パーセントである。 6反復の標準偏差は4.99％であり、平均の標準誤差は、図中のエラーバーとして表さ2.04％であると計算される。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。TK6リンパ芽球中のH 2 O 2誘発損傷の修復。代表彗星と修復の研究（A）の模式図。 TK6細胞を損傷剤で処理し、溶解前に、37℃で培地中で修復させる。 （B）4＆＃で20分間、50μMのH 2 O 2での処理後のTK6細胞の修復動態176、C。各データ点は、少なくとも50の個別彗星の中央値のパーセンテージ尾部DNAを、各実験で得られた3つの独立した実験の平均である。エラーバーは、繰り返し実験からの平均の標準誤差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。TK6リンパ芽球におけるMNNG誘発損傷の修復。TK6細胞を0.1,1、及び4℃で30分間、3 / mlのMNNGで処理し、120分後まで37℃で培地中で修復させる暴露。少なくとも50個体彗星の中央値のパーセンテージテールDNAは、3つの独立した実験のそれぞれについて得られた。エラーバーは標準誤差を表す3つの独立した実験からの平均である。 <img alt="図5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> 40 Gyの（中央）および80 Gyの（下）ガンマ線照射に暴露され、未処理TK6リンパ芽球（上）とTK6細胞から図5。ニュートラルコメットアッセイを用いてTK6細胞のIR用量反応。（A）アレイ化マイクロウェル彗星。スケールバーは100μmである。 （B）ガンマ線照射のさまざまなレベルにさらさTK6細胞のIR用量応答。各データポイントは、チップ上の6 macrowellsからプールに少なくとも300彗星の中央値テール長（μm）を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。 

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

生物工学

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

液滴ベースのRNAシーケンシングによるハイスループット酵母株フェノタイピング

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...