我々は技術支援のために博士アグネスヴィアーレとMSKCCゲノミクスコア研究室に感謝します。このプロトコルは、ジェフリーBeeneがん研究センターとファーマーファミリー財団の支援を受けて開発されました。

1。 DNA及び試薬の調製注意：このプロトコルは、24サンプル（ 例えば 12腫瘍/正常ペア）の同時処理および分析が記載されているが、より小さく、より大きなバッチに適合させることができる。 DNAサンプルは、FFPEまたは新鮮凍結組織、細胞学的標本、または血液に由来してもよい。一般的には、同じ患者からの腫瘍と正常組織の両方を継承多型から体細胞変異を区別するために一緒にプロファイルされます。プロトコルは、直後のDNA抽出を開始します。 <ol><li>分量50〜250 ngの1Xトリス-EDTAで希釈した試料当たり抽出されたDNA、（pH8.0）を別々のをCovarisの丸底チューブに、最終容量50μlのバッファー（250を推奨NG）。 </li><li> 10デューティ比、175、PIP、およびバースト当たり200回の速度で360秒以下のせん断設定でをCovaris E220機器上のDNAをせん断。 </li><li>室温にAMPure XPビーズ（ 表2）を解凍する。すべてのBUを解凍前の適切なステップに氷上ffersおよび酵素が挙げられる。 </li></ol> 2。ライブラリの準備 - 末端修復モジュール<ol><li>サンプルあたり以下のボリュームが使用して滅菌したマイクロチューブ内のエンド修理マスターミックスを調製する：10X NEBNext末端修復反応緩衝液（ 表2）の10μLを、5μLNEBNext終わりに酵素ミックス（ 表2）を修復、35μLの滅菌ヌクレアーゼフリーのH 2 O </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに各剪断したDNAを50μl分取。各反応する準備を末端修復マスターミックス50μlを加える。 20℃で30分間、サーモサイクラー中でインキュベートする。 </li></ol> 3。ポスト末端修復クリーンアップ<ol><li>各サンプルにAMPure XPビーズ（ 表2）の2倍のボリューム（200μl）を加え、穏やかにマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用して上下に10倍のボリューム全体をピペット。室温で15分間インキュベートする。 </li><li>磁気スタンドの上に置いてください（ 表2 </サンプルが透明になるまで室温で15分間）&gt;強い。 </li><li>優しく取り除き、ビーズを乱さないように注意しながら透明な上澄みを捨てる。一部の液体は、ウェル中に残ることがあります。 </li><li>スタンドにチューブを、静かに各サンプルに、新たに調製した80％エタノールを200μlを加え、30秒間室温で静置します。慎重に、ピペットでエタノールを除去。 </li><li> 2エタノール洗浄の合計は、ステップ5を繰り返します。すべてのエタノールが除去されていることを確認してください。磁気スタンドから取り外して、室温で5分間乾燥させます。 </li><li> 44.5μLの滅菌H 2 Oで乾燥したビーズを再懸濁し優しく、ピペット全体の音量を上下に10倍完全に混合。ビーズはもはやウェルの側面に取り付けられていることを確認していません。 </li><li> 2分間RTで再懸濁したビーズをインキュベートする。サンプルが透明になるまで5分間の磁気スタンドに置きます。 </li><li>静かに新しいウェルに試料を含有する透明な上清の42μLを転送します。 手順は、安全にこのSTで停止させることができるEPとサンプルは最大7日間、-20℃で保存した。再起動するには、先に進む前に、氷上で凍結サンプルを解凍する。 </li></ol> 4。ライブラリの準備 - DA-テーリングモジュール<ol><li> 10倍NEBNext DA-テーリング反応バッファー（ 表2）の5μL、3μL（3&#39;-5 &#39;エキソ- ）ノウフラグメント（ 表2：サンプルあたり以下のボリュームを使用して滅菌したマイクロ遠心チューブ内のDA-テーリングマスターミックスを調製）。 </li><li>各ウェル末端修復DNAの42μLを含むように準備DA-テーリングマスターミックスの8を添加する。 37℃で30分間、サーモサイクラー中でインキュベートする。 </li><li>クリーンアップDAはテーリングポストを実行します。を繰り返して、33.75μLの最終容量に2Xビーズの量（100μL）が、無菌H 2 O中に再懸濁を使用して3.1から3.8を繰り返します。 手順は安全にこの工程および最大7日間-20℃で保存したサンプルで停止してもよい。再起動するには、先に進む前に、氷上で凍結サンプルを解凍する。&lt;/李&gt; </ol> 5。ライブラリの準備 - アダプタライゲーションモジュール<ol><li> 5X NEBNextクイックライゲーション反応バッファー（ニューイングランドバイオラボ、 表2）、5μLクイックのT4 DNAリガーゼ（ 表2）の10μL：サンプルあたり以下のボリュームを使用して滅菌したマイクロ遠心チューブ内ライゲーションマスターミックスを調製する。 </li><li>よくDA-尾DNAを含む各ライゲーションマスターミックス15μLを加える。 </li><li>各ウェルに適切な25μMのNEXTflexバーコードアダプタ（ 表2）の1.25を添加する。各サンプルは、別々のバーコードアダプターを受信する必要があります。 20℃で15分間、サーモサイクラー中でインキュベートする。 </li><li>クリーンアップ後のアダプターライゲーションを行います。繰り返してビーズの1X容量（50μL）を使用して、3.1から3.8を繰り返したが、最終容量50μlに滅菌H 2 O中に再懸濁します。 </li><li>繰り返して第2 1X量（50μL）のクリーンアップのために3.1から3.8を繰り返しますが、滅菌水に再懸濁2 O23μLの最終容量。 手順は安全にこの工程および最大7日間-20℃で保存したサンプルで停止してもよい。再起動するには、先に進む前に、氷上で凍結サンプルを解凍する。 </li></ol> 6。ライブラリーの増幅<ol><li> 25μL2X KAPAハイファイHS RM（ 表2）、1μL100μMのプライマー1とプライマー2（ 表3）の各試料ごとに、次のボリュームを使用して滅菌したマイクロチューブ内KAPAハイファイマスターミックスを調製する。 </li><li>よくライゲーション生成物を含む各マスターミックス27μLを加える。 50μlにピペットを設定し、ゆっくりと上下に10倍のボリューム全体をピペット。 </li><li>以下のPCRサイクルのサーモサイクラーに置き：初期98°Cで45秒の変性、15秒間の10サイクル98°C、30〜60°C、72°Cで30秒、秒、少なくとも1分の最終伸長で72℃で</li><li>増幅後のクリーンアップを実行します。を繰り返して使用して3.1から3.8ステップ1X AMPure XPのビーズの量（50μL）、および30μlの最終容量の滅菌水に懸濁します。 </li><li>製造業者の指示に従って量子ビットブロードレンジアッセイ（ライフ·テクノロジーズ、 表2）を用いて、各ライブラリーの濃度を定量する。 </li></ol> 7。ロシュNimbleGen社SeqCAP EZ図書館ブリダイゼーション、洗浄、および増幅<ol><li>氷上で解凍普遍的指標ブロッカーオリゴヌクレオチド（ 表3）、SeqCap EZ図書館、NimbleGen社の捕捉成分（COTのDNA、2×ハイブリダイゼーション緩衝液、およびハイブリダイゼーション成分A、 表2）。すべてのオリゴヌクレオチドブロッカーを1mMのワーキングストックに記憶される。私たちのSeqCap EZ Libraryは他のカスタムおよびカタログのデザインを使用することができるものの、279の癌関連遺伝子の全てのタンパク質をコードするエクソンを包囲捕捉プローブのカスタムデザインプールです。 </li><li>特定のバーコード、広告に対応するインデックスオリゴヌクレオチドブロッカーの1 mMのプールを用意するライブラリ調製に使用aptorシーケンス。 1各ブロッカーのμL、および渦を兼ね備えています。 </li><li>新しい滅菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、1mg/mlのCOTのDNA、1 mMのユニバーサルブロッカーとインデックスオリゴヌクレオチドブロッカーの1 mMのプールの2液の2液を5μlを加える。 </li><li>単一の反応にプール24バーコードのライブラリ。捕獲混合物に（上記で調製）をプール、バーコード配列ライブラリの1-3μgの合計を追加します。 24サンプルについては、サンプルあたり100 ngのをお勧めします。腫瘍および対応する正常サンプルをプールするとき、私たちは、それらが適用範囲のより深くまでに配列決定されるように（ 例えば 、腫瘍あたり100 NGと正常につき50 NG）を複数の腫瘍のライブラリを追加することを推奨。 </li><li>チューブのキャップを閉め、18〜20 g以下針でキャップの上に、15〜20の穴を作る。スピードバック増幅したサンプルライブラリ/ベビーベッドのDNA /オリゴ高い熱（60℃）上のDNAの真空濃縮器中。 </li><li>完全に乾燥させた後、2倍hybridiの7.5μlの水分補給zationバッファおよびハイブリダイゼーション成分Aの3μLチューブはここで以下が含まれている必要があり5μgのCOTのDNA、変数μgの増幅したサンプルライブラリ、ユニバーサルとインデックスオリゴの1000年ピコモル、7.5μL2Xハイブリダイゼーション緩衝液、中3μLハイブリダイゼーション成分A 10.5μLの総容量。 </li><li>実験室でのテープの小片でキャップの穴をカバーしています。ボルテックス10秒間最大速度で10秒間遠心分離するためのサンプル。 </li><li> RTで10秒間、最大速度で遠心分離したDNAを、変性させ、10分間95℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li>新しい0.2ミリリットルのPCRストリップチューブに、SeqCap EZ図書館捕獲プローブ及び滅菌ヌクレアーゼフリーのH 2 Oを2.25μLの2.25μlのアリコートを準備し、ステップ7.7の内容を追加します。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペット。 </li><li> 48〜96時間、47℃でサーマルサイクラー中でインキュベートする。セットおよび57℃にサーマルサイクラーの蓋温度を維持</li><li> FOL洗浄、捕捉されたDNAを回収するためのNimbleGen社SeqCap EXライブラリSRユーザーズガイドV3.0（ 表2）の第6章に低い段階。 </li><li>以下の変更を捕捉されたDNAを増幅するためのロシュNimbleGen社のプロトコルの第7章の手順に従います。 <ul type="disc"><li>代わりのPhusion高忠実度PCRマスターミックスの2倍KAPAハイファイポリメラーゼ（ 表2）を使用します</li><li> 表3に記載された100μMのプライマー1とプライマー2を使用してください。 </li><li> 30秒間98℃での初期変性、10秒間98℃の11サイクル、30秒間60℃、30秒間72℃、および5分間72℃での最終伸長：以下のPCR条件を実行する。 4℃で保持する</li></ul></li><li>製造業者の指示に従って量子ビット高感度アッセイ（ 表2）を用いて増幅捕捉DNAの濃度を定量する。 </li><li> AgilentバイオDNAを使用してキャプチャの品質を分析するアナライザHS DNAチップ（ 表2）を製造業者の説明書に従って行った。 <ul type="disc"><li> PCRの収量は、少なくとも100 ngの（範囲100〜1,000 NG）である必要があります。 </li><li>平均断片長が150〜400塩基対の間でなければなりません。 </li></ul></li></ol> 8。イルミナのHi-配列のシーケン<ol><li> 2時まで増幅した捕捉されたDNAを希釈し、イルミナHiSeq 2000フローセルのシングルレーン上のサンプルをロードします。ペアエンド配列75塩基対は、製造者の指示に従って読み出す。我々の経験では、1レーンは24サンプルのプールのための279の遺伝子間でサンプルあたり500-700X固有のシーケンスカバレッジを生成するのに十分である。 </li><li>イルミナソフトウェア（リアルタイム解析）コールと品質スコアのベースとなるクラスタ強度に高解像度の画像に変換されます。バーコードの同一性に基づいてデータを逆多重化し、各サンプルのための個々のFASTQファイルを生成するCASAVAを使用する。 </li></ol> 9。データアナルysis <ol><li>配列の3 &#39;末端からトリムアダプター配列はCutadaptを（使用するFASTQファイルを読み込み<a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ）。最小重なり長（-O）を1％の誤差率（-e）は3である。ペアの保持のための最低限の塩基長は25ですトリミング後読み込みます。 </li><li>揃えるシーケンスはバローズ輪アライナツール（BWA）12を使用して参照ヒトゲノムhg19に読み込みます。 （それらの標準的なベストプラクティスに従ってマーキング重複、地元の複数の配列再編し、ゲノム解析ツールキット（GATK）を使用して、基本品質スコアの再キャリブレーションを含む後処理の手順を実行します<a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic？ NAME =ベストプラクティス</a> ）13。同一患者から複数の試料（ 例えばマッチ腫瘍と正常）をプロファイリングすると、ローカル多重配列再編は性能であるべき共同メッド。これらの後処理ステップの出力は、別個のBAMのすべての配列を含む各サンプルのファイル、品質、および配置情報であり、読み取り、配列は14変異体の可視化のために統合的ゲノムビューア（IGV）に直接ロードすることができる。 </li><li>ピカードツールを使用して配列のパフォーマンスメトリックを計算する（ <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ）。有益なメトリックが配向率、断片サイズ分布、GC含量に関連するカバレッジ·バイアス、オンターゲット捕捉特異性を含む、PCRは、レート、ライブラリーの複雑さを複製し、ターゲットカバレッジを意味する。代表値を図1に表示されている。 GATKからDepthOfCoverageを使用して計算共通の多型部位における対立遺伝子頻度は無関係のDNAからの汚染を監視するために、一致したサンプルは、同じ患者からのものであることを保証するために使用される。 次の計算の分析は、一致したの存在に依存する体細胞の遺伝子変異を検出するための腫瘍と正常サンプル。比類の腫瘍はまた、別個の正常対照試料を用いて分析することができるが、ほとんどの体細胞変異は、容易に継承配列変異体と区別できない。 </li><li>このようなmuTect 15、SomaticSniper 16、またはウッズの中を歩く17などの体細胞突然変異の発信者を使用して、各腫瘍の通常のペアのために体細胞の一塩基変異体（SNVs）を呼び出します。私たちは、限り対立遺伝子頻度は、少なくとも5倍の腫瘍の方が大きいように通常、試料中の低（非ゼロの）対立遺伝子数を有する変異体を考慮して、修正されたフィルタリング基準でmuTectを使用しています。再帰的に正常なDNAのパネルで呼び出さ変異体は配列決定または整列の可能性が高い系統アーチファクトとして除去される。フィルターを通過する各SNVを注意深くIGVを使用して見直される。 </li><li>このようなSomaticIndelDetector 13、Dindel 18などのアルゴリズムを使用して、各腫瘍の通常のペアのための体細胞インデルを呼び出すか、SOAPindel 19 </sup&gt;。我々は、以下の基準でSomaticIndelDetectorを使用して、少なくとも10％の対立遺伝子頻度を少なくとも3個、少なくとも10の支持読み取りで対立遺伝子頻度を読み出し支持する、または少なくとも2％。私たちは、限り対立遺伝子頻度は、少なくとも5倍の腫瘍の方が大きいように通常、試料中の低（非ゼロの）対立遺伝子数の多いインデルが可能になります。正常なDNAのパネルに呼ばインデルは、上記のように、削除されます。フィルターを通過する各インデルを注意深くIGVを使用して見直される。 </li><li>ターゲットのエクソンの配列カバーからコピー数の状態を推定。各々のサンプルについては、すべてのターゲットのエクソンの平均シーケンスカバレッジ、GCの割合以上の回帰の黄土の正規化を行う。黄土フィットを差し引くと、サンプル全体の中央値の範囲を追加することによって、非正規化カバレッジ値を調整します。腫瘍正常なペアのためのすべてのターゲットのエクソン間で正規化された配列カバーで比率を計算します。対応する正常試料および/またはノイズを低減するために、他の性別が一致する二倍体が存在しない場合には生殖系列コピー数変異体を欠く通常のコントロールが使用されてもよい。カバレッジ率の増減に基づいて、体コピー数損益を決定する。 </li><li>少なくとも1ゲノムのブレークポイントはゲノムのターゲット間隔内またはその付近に収まるがん遺伝子を含む体細胞再編成を呼び出します。提案されたアルゴリズムはGASV 20、ブレイクダンサー21、クレスト22、およびdRanger 23が含まれています。染色体内逆位、欠失、および縦列重複が不一致ペアを読み込む支持の相対的な位置及び姿勢に基づいて区別することができる。すべての候補の再構成を手動でIGVを使用して見直されるべきである。我々は、推定転位ブレークポイント間でPCRおよびサンガー配列決定により実験的検証をお勧めします。 </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

博士ベルガーは財団医学、癌診断会社からコンサルティング料や研究資金を受けています。

ライオンズのインパクト分析は、高いアライメント率、高いオンターゲット率、高い目標をカバーし、変異を検出するための高感度を生産インデル、および数の変化をコピーします。我々は低DNA入力の新鮮凍結およびアーカイブFFPEサンプルの両方から配列DNAにライオンズのインパクト分析の能力を実証した。重要な癌関連遺伝子の標的エクソンのシークエンシングを行うことにより、人はそ...

主要な癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における「運転者」とは、腫瘍遺伝的事象の同定は、多くの癌1の診断および治療 ​​において重要な役割を果たしている。超並列&quot;次世代&quot;シーケンシングを利用した大規模な研究努力が、近年2にこのような多くの癌関連遺伝子の同定を可能にしてきた。しかし、これらのシーケンシングプラットフォームは、通常、腫瘍サンプル（FFPE）このように、埋め込みホルマリン固定パラフィンとして保存組織からのDNAの変異を特徴づけると分析する主要な制限を装った、新鮮な凍結組織から単離したDNAを大量に必要とする。効率的かつ確実にFFPE腫瘍サンプルから「実用的な「ゲノム情報を特徴づける、改善の努力は、以前にバンク標本のレトロスペクティブ分析を可能にし、さらに癌管理の個別化されたアプローチを奨励する。 伝統的に、分子Diagnostic研究室は、このようなDNA変異プロファイリングのためのサンガー配列決定およびリアルタイムPCRのような時間がかかり、低スループット手法に頼ってきた。より最近では、多重化PCRまたは質量分析遺伝子型決定を用いた高スループット法は、キー癌遺伝子3-5に再発性の体細胞変異を調査するために開発されてきた。これらのアプローチは、しかしながら、腫瘍抑制遺伝子における不活性化変異を検出するため、それらを不適切にする、唯一の予め指定された「ホットスポット」の突然変異をアッセイすることを制限される。超並列シーケンシングは、一般的で珍しいの両方の突然変異のために全体のエクソンを尋問する能力などのコピー数の差損益などのゲノム変化の追加クラスを明らかにする能力、および異機種のサンプル6においてより検出感度を含め、これらの戦略に比べていくつかの利点を提供しています7 。それは相対的でありながら、全ゲノム配列決定は、突然変異の発見のための最も包括的なアプローチであるLY高価であり、データ分析および記憶のための大きな計算要求を招く。 ゲノムのごく一部が臨床興味のある臨床用途については、シークエンシング技術の2つの特定の技術革新は、変形可能となっている。まず、ハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャを通じて、1は、標的変異プロファイリング8のキー癌関連遺伝子に対応するDNAを単離することができる。第二に、分子バーコード（ つまり、DNA配列の長さは6〜8ヌクレオチド）の連結を通じて、1は、配列決定の実行あたりのサンプル数百のプールができ、完全に大規模並列シーケンシング機器10の増え続ける能力を活用しています。組み合わせることで、これらの技術革新は、より小さな計算要件11と、低コストで、より高いスループットでプロファイルするために腫瘍を可能にする。さらに、特定のアプリケーションに最も重要な遺伝子のみにシーケンスカバレッジを再分配することで、1はachieでき低アレル頻度イベントのより高い検出感度を大きくシング深さを見る。 ここでは、 表1（全タンパク質コードエクソンをキャプチャし、279キー、癌関連遺伝子のイントロンを選択するためのカスタムオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにより、バーコード配列ライブラリプールのエクソンキャプチャを利用したライオンズのインパクト分析（アクショナブル癌標的の統合変異プロファイリング）を記述する）。この戦略は、変異が、インデル、コピー数変化の識別を可能にし、これらの279の遺伝子が関与する構造的な再編成を選択します。我々の方法は、新鮮凍結およびFFPE組織だけでなく、細針吸引やその他の細胞診標本の両方から単離されたDNAと互換性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

重要な発癌性変異を検出し、調査するための努力は、癌患者のための適切な治療を容易にするために貴重であることが分かっている。高スループットの設立は、超並列」の次世代「シングは、多くのこのような変異の発見を支援しています。この技術の臨床およびトランスレーショナル有用性を高めるために、プラットフォームは、高スループット、費用対効果の高い、劣化したり損傷したDNAの少量をもたらすことがあり、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルとの互換性が必要です。ここでは、超並列配列決定による新鮮凍結およびFFPE腫瘍中の癌関連変異の検出対象エクソンのハイブリダイゼーションに基づく捕獲に続いてバーコードと多重化されたDNAライブラリーの調製を記載している。このメソッドは、シーケンスの変異の同定を可能にする数の変化をコピーし、すべての標的遺伝子が関与する構造的な再編成を選択します。標的エクソン配列決定は、Tを提供しています彼は、このように低周波変異を検出するための高感度を与える、高スループット、低コスト、深い配列カバーの特典。

24バーコード配列ライブラリー（12腫瘍の通常のペア）のいずれかのプールが279がん遺伝子のすべてタンパク質コードエクソンに対応するプローブを使用してキャプチャし、2×75 BPはHiSeq 2000フローセルのシングルレーンに読み込むように配列決定した。腫瘍と正常ライブラリは2:1の比率でプールした。凍結腫瘍DNA試料のプールのサンプルパフォーマンスメトリックは、配向率、断片サイズ分?...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提供しています。

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K ビュー.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 我々は、超並列「次世代」配列決定による臨床腫瘍標本における主要癌関連変異の検出のためのバーコードDNAライブラリーおよびその後のハイブリダイゼーションに基づくエクソンキャプチャの製造を記載し​​ている。標的エクソン配列決定は、低周波の変異を検出するための高感度を得、高スループット、低コスト、かつ深い配列カバーの利点を提?...

ビデオ: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + Tリンパ球キャプチャHIVのための使い捨てマイクロ流体チップを用いた

生物学

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.