このプロトコルは、腫瘍関連の突然変異の検出を可能にし、現在侵襲的な外科的処置を補完する。もう一つの強みは、このプロトコルを使用して腫瘍突然変異負荷を残業時間で監視する能力である。この技術は、組織へのアクセスが制限された脳幹のような困難な場所の腫瘍に特に役立つ実際の外科組織生検を必要とせずに腫瘍ジェノタイピングを可能にする。
繰り返し生検がない場合、縦方向の分子データはMRIを補完することはできません。デジタルPCRモニタリングは、診断に対する分子ベースのサプリメントを容易にし、より多くの情報に基づいた治療意思決定プロセスを可能にします。同様の方法は、従来のFluo-4およびクエンチャー結合プローブを用いて、定量PCRよりも高い感度を有する、特定の系における遺伝子の発現を検出するために使用することができる。
液滴デジタルPCR手順を開始する前に、ベンチスペースと装置を10%漂白剤と70%エタノールで洗浄し、液滴安定化油を除くすべての試薬を穏やかに渦巻き、短く遠心分離します。圧縮窒素ガスボンベが液滴発生装置に取り付けられていること、およびシリンダータンクが1平方インチあたり90ポンドに設定されていることを確認します。そして、38マイクロリットルのデジタルPCR反応混合物を8つのウェルPCRチューブストリップの各ウェルの底部に直接入れ、きれいなピペットチップを持つ泡を取り除きます。
チューブストリップの適切なウェルに3重に増幅されたDNAサンプルの12マイクロリットルを追加します。全容を10回軽くピペット化し、反応混合物をDNAサンプルと混合し、各ウェルからフルボリュームを液滴発生器用チップの対応するA~Hチャンネルにピペットします。新しいPCRチューブストリップを液滴生成機器に挿入し、インストルメントコンピュータ上のソフトウェアにインストルスト生成器チップIDをスキャンします。
次に、[実行を開始] をクリックしてサンプルのドロップレットを開始します。液滴分解が完了したら、PCRチューブストリップを取り除き、チューブストリップキャップを適用します。チューブストリップをサーマルサイクラーに移し、チューブを井戸あたり80マイクロリットルの水を含む別のチューブストリップとバランスを取ります。
次に、適切なサーマルサイクル条件下でサーマルサイクラーを実行します。ストリップキャップを高速キャップに交換してください。サーマルサイクリングが完了したら、チューブストリップを定量化機器に移し、計測器ソフトウェアで「実行を設定」をクリックし、チューブストリップを定量装置に挿入します。
新しい定量計測器チップの上に金属シールドを置き、チップIDを機器にスキャンしてチップを機械に挿入します。楽器のふたを閉じます。コンピューターソフトウェアで、デジタル PCR 実行の名前と 8 つのチャンネルのそれぞれに名前を入力し、高速モードを選択して[開始]をクリックして定量を開始します。
生スペクトルデータを分析するには、アナリストソフトウェアを起動し、fcsファイルを開きます。[解析ビュー] で、そのまま選択します。サンプル ビューで、8 つのサンプルの横にあるボックスをクリックします。
ソフトウェアは、それぞれxとy軸に沿って変異型と野生型対立体の信号をプロットします。計算されたマトリックス関数を使用して、メーカーのインストラクターに従って、無傷の液滴のスペクトル補正を適用し、軸オプションの軸の下で軸の設定を調整します。X 軸を最小値の 0、最大値 30,000、y 軸を最小値から 5,000、最大値 10,000 に設定します。
液滴クラスタが特定されたら、軸を調整してグラフの空き領域を減らします。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAに対応するサンプルを選択して、陰性変異体および野生型のゲートを設定し、クラスターが明確かつ容易に同定されるようにする。次に、右クリックして[選択したサンプルにすべての設定を適用]を選択し、正のコントロールのゲート設定をすべてのサンプルに適用します。
グラフィック表示の下で複数のサンプルをクリックして、選択したすべてのサンプルのプロットを表示し、画像を tif ファイルとして書き出します。次に、[ワークスペース] で [分析のエクスポート] を選択し、分析したデータ ファイルを csv ファイルとして保存します。ここで、びまん性正中性神経膠腫を有する2つの小児からの、前増幅された血漿および脳脊髄液細胞遊離DNAにおける突然変異の検出に成功した代表的な結果が示されている。
本実験では、それぞれx軸とy軸に沿って変異型クラスターと野生型クラスター間の明確な分離を観察することができる。堅牢な野生型クラスターは、テンプレートDNAが存在するため、細胞の無細胞DNA抽出が成功したことを示す。これらの患者に対して、変異体クラスターは、生検された腫瘍組織のゲノム解析によって確認された腫瘍突然変異状態に従って、それぞれ血漿および脳脊髄液サンプルに対して1.6および39.32%の変異アレル頻度を示す。
一方、負の対照は、PCR反応混合物の汚染が存在していないことを示す変異体ゼロおよびゼロ野生型液滴を示す。陽性対照腫瘍組織ゲノムDNAは、選択された特定の腫瘍試料について予想されるアレクトリス頻度で検出される突然変異を示す。血漿中の突然変異検出の欠如は、患者が偽陰性が起こるように目的の突然変異のための野生型であることを意味する可能性があります。
例えば、この患者では、目的の変異は検出されなかったが、腫瘍組織のゲノム解析により変異状態が確認された。PCR は、誤検知データの取得を避けるために作業領域と機器の頻繁な除染を要求する非常に敏感な技術です。
