この作品は（ドクター·モロー）はラ·財団イヴCotrelドゥフランス学士院、パリ、フランスからの補助金によって支えられて、健康の研究のカナダの協会は（ドクター·モローにPP2-99466を付与）し、四次元脊椎LLCから米国ニューヨーク州（ドクター·モローの研究助成金）。

全体の手順は、無菌の生物学的フードの下で行われ、細胞と接触するすべてのソリューションや設備は無菌でなければならない。 1。エッセンシャルの溶液の調製<ol><li> 表1に記載の溶液を調製する。 </li><li>使用時まで4℃、室温およびすべての他の溶液で平衡塩類溶液（BSS）を保つ。 </li><li>使用する前に、数分間水浴中で37℃まで暖かく寒いメディア。 </li></ol> 2。 PBMCの調製および保存<ol><li>各5mlのアリコートを用いてPBMCのつのアリコートを調製するためにEDTAで処理した採血管で全血を10mlを集める。 </li><li> 50mlチューブにEDTA処理した採取チューブからの転送の全血を5ml。 </li><li> BSS、等量のを追加し、上下に穏やかにピペッティングすることにより、サンプルを混ぜる。 </li><li> 2 15ミリリットルファルコンチューブ内のFicollの3ミリリットルを配置します。 </li><li>慎重に4.5ミリリットルをレイヤーそれぞれのチューブ内のFicollの上に血の混合物を希釈した。 </li><li>チューブが血とフィコールの明確な分離を支持するために、最大5分間休憩しましょう​​。 </li><li>ブレーキなしで室温で30分間400×gでチューブを遠心分離する。 </li><li>レイヤーを乱さないように、慎重に遠心分離器からチューブを取り外します。 PBMCを、BSS /フィコール界面で表示されます。 </li><li>ピペットを用いて、両方の管の界面でのPBMCの曇り層を収穫して、新しい50mlチューブに移します。 </li><li>完全培地20ミリリットルを追加します。 </li><li>室温で7分間288×gでチューブを遠心分離する。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>補足メディア500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>メディアを凍結し、等量のを追加します。 </li><li>クライオバイアルに細胞懸濁液を転送します。 </li><li>イソプロパノールでcryofreezing容器にクライオバイアルを置きます。 </li><li> -80℃で一晩冷凍コンテナを保管してください。 </li><li> TR長期保存のために液体窒素に凍結したPBMCのアリコートansfer。 </li></ol> 3。機能分析 1。 1日目<ol><li>分または解凍するまで37℃の水浴中の液体窒素から一定分量を配置します。 </li><li>滅菌ピペットを用いて50mlチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>完全培地15ミリリットルを加え、室温で5分間200×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>穏やかPHA培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>同じメディアで20ミリリットルにボリュームを完了します。 </li><li>空気が入ることができるように緩くチューブにキャップ。 </li><li>静止リンパ球が急速に増殖しているリンパ芽球に変形できるようにするために、CO 2インキュベーター内で37℃で一晩チューブを残す。 </li></ol> 2。 2日目<ol><li>インキュベーターからチューブを取り、完全にスクリューキャップ、5分間200×gで細胞をスピンダウン室温で加えた。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>穏やかに完全培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>同じメディアで20ミリリットルにボリュームを完了します。 </li><li>空気が入ることができるように緩くチューブにキャップ。 </li><li>細胞数を拡大して、CO 2インキュベーター内で37℃で一晩チューブを残す。 </li></ol> 3。 3日目<ol><li>インキュベーターからチューブを取得、完全にスクリューキャップし、室温で5分間200×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>室温で5分間、200×gでの遠心分離によってRPMI-1640 10mlで細胞を2回洗浄する。 </li><li>優しくRPMI-1640600μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>自動細胞計数および生存率分析器を用いて、細胞濃度及び生存率を測定する。 </li><li> 1.5×10 5 cells/20μLの細胞濃度に調整したRPMI-1640の適切な量を追加します。 </lI&gt; <li>エッペンドルフチュー​​ブ1.5mLに組換えOPN（rOPN）または媒体（PBS）で細胞を処理。 <ol><li> 2無菌1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに細胞懸濁液100μlを移す。 </li><li> 0.5μgの/ mlの最終濃度になるように一本のチューブにrOPNを追加する。 </li><li>第二の管における等量のPBSを追加します。 </li><li>優しくピペッティング回100μLの滅菌ピペットのセットを使用して各条件を混在させる。 </li></ol></li><li>少量のサンプルを96ウェルマイクロプレートを準備します。 <ol><li>各ウェルにRPMI-1640の5μlを加える。 </li><li>気泡を除去するために3分間200×gでプレートを遠心分離する。 </li></ol></li><li>未処理の細胞だけでなく、rOPNまたはPBSで処理した細胞を播種。 <ol><li>マイクロプレート、チューブから細胞を転送する前に、穏やかに細胞の均一な懸濁を確実にするために一回上下にピペッティングし。 </li><li>未処理の細胞のための四重にウェルあたりの細胞懸濁液40μl加え、二重にrOPNまたはPBSのための細胞を処理した。リ設計については、図1を FER。このデザインは、12人の患者が同じマイクロプレート上でテストすることができます。 </li><li>細胞が培養器に入れる前に休ませ、井戸の底に均等に落ち着くことができるように5分間無菌フード下のセルプレートのままにしておきます。 </li></ol></li><li> OPNの効果を最適化するために、CO 2インキュベーター内で37℃で18時間静置します。 </li></ol> 4。 4日目<ol><li>化合物を用いて、プレートを実行します。 <ol><li>インキュベーターからプレートを取り出し、周囲の室温で30分間そのままにしておきます。 </li><li> RPMI-1640の990μlのストック溶液10μl（10 mm）を追加することで、RPMI-1640でのソマトスタチンおよびイソプロテレノールの100μMに1ミリリットルを用意します。 </li><li> 図2に示すように、適切なウェル中に20μlを分配することによって、化合物プレートを埋める。 </li><li>前に蒸発による化合物濃度の変化を避けるためにプレカット貫通可能シールを化合物プレートをカバーまたはCDSベースのシステムでのインキュベーション中。 </li><li>ロードセルプレート、ピペットチップ、およびCDベースのシステムへの化合物プレート。 </li><li> CDSベースの測定器ソフトウェアでプレートに名前を付けます。 </li><li>適切なプロトコルを選択します。 PBMCと分類のために編集されたプロトコルは、「アゴニスト非接着細胞小サンプルプレートをRTで15分」と呼ばれています。 [プロトコル]ボックスに移動して、プロトコルのリストにこのプロトコルを選択する</li><li> 「スタート」をクリックして、プロトコルを開始。 </li><li>統合された流体システムは、同時に全量50μlに10μMの最終濃度を達成するためにウェルあたり5μLを注入することによって、全てのウェルに化合物が追加されます。 </li><li> CDSベースのシステムが自動的に化合物添加後15分間のデータを収集します。 </li></ol></li><li>データ解析<ol><li>非のための抽出された値を計算する際に使用する周波数の高低の範囲を選択接着細胞。 </li><li>時間をかけてベースラインのインピーダンス測定値の線形変化を補正するドリフト補正を選択します。 </li><li>による電子雑音および化合物の添加に運動応答測定のばらつきを低減するために、データフィルタリングを選択する。 </li><li>完全な分析時間を最大 - 最小方法を選択します。 </li><li>プレートフォーマットオプションの下でExcelにデータをエクスポートします。 </li><li>以下の式を使用してGsの刺激（RMGS）に対する応答の大きさの平均値からGiの刺激（RMGI）に対する応答の大きさの平均値を減算することによりデルタG（ΔG）を計算する。 ΔG= RMGI - RMGS </li><li> （PBSの存在下で刺激Giに応答の大きさの平均がOPN（RmGiOPN）の存在下でGiの刺激に対する応答の大きさの平均値で割ることによってGiを媒介性応答に対するOPNの効果倍の鉄（Fe）の割合を計算するRmGiPBS）次の式を使用して： FE = 100×（RmGiOPN / RmGiPBS） </li><li> Tを参照してください。患者を分類することができ2。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. 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この作品は、サントジュスティーヌ大学病院で保持し、他の多くは、いくつかの国で保留されているいくつかの特許につながった。四次元脊椎LLCはサントジュスティーヌ大学病院の専用実施権である。

我々は、末梢血単核細胞にも適用可能である特発性脊柱側弯症（PBMC）を、新たに単離された、または液体窒素中で最長1年間凍結保存されたための細胞ベースの予後試験の詳細な手順を記載している。多数の個人をテストする際に、新たに単離したPBMCを使用することは面倒ですので、手順が臨床の場でより実用的な代替手段を提供する凍結したPBMCと発表されました。凍結したPBMCを最初にアッセイ間変動することが時々リードする、使用されたときが、解凍時の細胞凝集に問題が発生しました。アッセイの再現性を最大化するために、我々は、凍結融解サイクルを回避し、一度だけ凍結したサンプルを使用することをお勧めします。手順は、短時間で欠陥のある王タンパク質機能の正確な検出を可能にし、非常に簡単です。この手順を使用して、無症候性脊柱側の子供が簡単に、より自分の健康のために危険なしに臨床転帰を予測するために分類することができます。ホー健常者12に対して王刺激に対する最大反応の程度に応じて分類を行う、対照被験者のためのいくつかの要件を満たさなければならwever、。実際、適切な比較コホートを持つために、対照被験者は、薬のどのような種類でも、このような過去の家族/個々の病歴などの個人情報を提供しない、一致した年齢と性別でなければなりません。これらの要件は、対照被験者の動員のための重要な障害を構成することができる。したがって、同一個体における王とGsタンパク質刺激に対する応答との間の不均衡の程度を調べることにより分類を行うことにより、制御対象を使用する必要性を排除することが理想的である。 この予後テストを実行するには、CDSベースのシステムを使用すると、同時に同じアッセイで王とのGs媒介細胞応答を提供するという点で重要である。多くの患者は無AMで分類することができますが本報告書の結果によって示されるように、このアッセイのために固定されたダイナミックレンジを用いて、あいまいさは、少数の患者は、範囲の境界線での値を示すことになる。これらの個人を識別するために、我々は、OPNは、3つの官能基間のGiを媒介細胞応答に異なる効果を誘導することを実証することによって、Giの刺激に対する応答にOPNの効果の評価を導入している。実際に、我々は、OPN、FG1内のGiの刺激増大に応答して、の存在下では、FG2内のより高い程度まで、FG2及びFG3に減少することを見出した。 OPNの高いコストにもかかわらず、このケモカインの使用は、あいまいな場合を区別するため、我々の分類アッセイの精度を向上させることが不可欠である。しかし、このアッセイは、ウェル当たり1.5×10 5個の細胞の最小は、我々の実験条件下でCDSベースのシステムで細胞応答を観察するために必要とされるという欠点を有する。特定の患者サンプルは、十分な数を持っていません試験されるべき細胞。この場合には、医療や研究室スタッフ、家族やイライラするために気になることができる追加の採血のために患者をリコールする必要がある。前向き研究は、この問題に対処するために我々の研究室で予定されています。 それにもかかわらず、現在のプロトコルは、テストが細胞の応答をモニターするために検証済みラベルフリーシステム13,14を使用して自動化している間の細胞を調製するために、簡単で実証された方法に依存している。他の疾患の予後のための利用可能な遺伝的プラットフォームと比較した場合、テストプラットフォームは、比較的安価である。また、採血管を含む全ての使い捨て材料利用のコストは、特別な電極マイクロプレート、円錐、エッペンドルフ管は、非常に高価ではなく、約1000人の患者の試験を完了するために、以下で3000ドルと見積もられている。この推定値は、サンプルの調製のための人件費​​が含まれていませんが及び試験を行う、このテストはかなり手頃な次世代シークエンシングプラットフォームよりも残る。注目すべきは、遺伝的なプラットフォームへのコスト比較だけではありませんが、より具体的には、AISの分野に関連し、核医学診断に関連するコストである。今日では、米国内の1万人の子どもたちとカナダでは約100,000の子どもよりも、特発性側弯症と診断されており、X線照射による脊柱側の子どもの診断およびモニタリングの総費用は、北米で毎年25億ドル以上である。したがって、我々の細胞ベースのアッセイ手順は、健康上のリスクがなく、低コストで特発性脊柱側弯症児の日常的なスクリーニングおよびモニタリングに適していると予想される。

特発性脊柱側弯症は、一般的に、椎回転1を伴って10度以上横曲率と定義され、原因不明の脊柱変形である。条件は、小児集団の4％に影響を与え、最も一般的には9〜13歳の年齢2,3,4の間に診断される。診断は主に排除され、唯一のそのような椎骨の奇形、神経筋または症候性障害などの脊柱変形の他の原因を除外した後に行われている。伝統的に、trunkal非対称性はアダムス前進曲げ試験により明らかにし、身体検査中に5 scoliometerで測定する。診断は、次いで放射線曲線の観察およびコブ方法6を用いて角度測定により確認することができる。 診断されたら、脊柱側の子を管理する上で、医師のための主な関心事は、カーブが進行するかどうかである。確かに、カーブの進行は、多くの場合、予測不可能であり、より頻繁に男児7よりも女の子の間で観察されている。未治療の場合、曲線はかなりの物理的な変形、さらには心肺問題を作成、劇的に進行することができます。曲線は70°8,9を超えた場合に、これらの症状は、生命を脅かすになる。カーブの進行を防ぐか、または停止する現在の治療の選択肢は、ブレーシングや手術を含む。手術は曲線よりも大きい45°またはブレースに反応しないために予約されている間、一般的に、ブレーシングは、25〜40°の間のカーブをお勧めします。 およそ、特発性側弯症と診断された子供の10％は矯正手術10を必要とするカーブの進行を持っている。現在、実証済みの方法や患者のこのカテゴリを識別するために利用できるテストは存在しない。その結果、すべての診断された子供は、彼らが、骨格成熟に達するまでは、通常、数年にわたって複数のX線写真を受ける。これは、脊柱側弯症と、典型的な患者が持っていると推定されている3年間で11以上の約22放射線検査。そのため、複数のX線撮影検査の潜在的なリスクのため、電離放射線に子供をさらすことなく、特発性側弯症の予後を実施する可能性があり、代替のアプローチが強く望まれている。この必要性を満たすことを意図して、我々は、以前より早く特発性脊柱側弯症を発症するリスクが無症候性子供を識別するための予後試験として、細胞ベースのスクリーニングアッセイを開発した。試験はGiのタンパク質の機能状態を調べ、CDSによって測定されるのGiタンパク質刺激12に対する最大応答の程度に応じて3つの官能基（FG1、FG2及びFG3）中に子供を分類することによって、両方の無症候性および影響を受けた小児の臨床転帰を予測するベースのシステム。このシステムは、主に様々な細胞型13,14,15,16におけるGタンパク質を介してシグナル伝達を評価するために使用される。なおに関する情報を得る細胞表面受容体の活性化後のインピーダンスの変化を測定することにより、外部刺激に対する細胞の全積分応答。細胞をウェルの底に電極を含み、システムが細胞外および細胞間に電流を誘導する小さな電圧を印加することは、マイクロプレートに播種する。ウェルへの化合物の注射後、細胞表面受容体を刺激し、シグナル伝達事象が発生し、細胞外および細胞間の電流の流れに影響を与える細胞変化をもたらすことにより、測定された大きさに影響を与えている。健常対照被験者と比較した場合に、このアプローチでは、脊柱側弯症を発症する危険性のある脊柱側弯症の患者および子供以上がGiのタンパ​​ク質刺激にあまり反応であり、分類は、対照群と還元の相対的な程度の割合に基づいている。分類範囲はFG3、40及びFG2 60％、および60と12 FG1 90％、10〜40％の間で固定されている。 <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt;最近では、我々は3つの官能基は明らかに王およびGS刺激に対する応答との間の不均衡のプロファイルに応じて区別することができることを実証することで、このアプローチを変更しました。実際に、我々は、明らかな不均衡がFG2において観察されなかったGiの刺激に対する応答は、FG3で優勢であることを見出した。対照的に、FG1は、Gsを刺激に応答するための優位性を示した。加えて、我々はFG2に属する患者は手術を必要とする17の点に進行するリスクがより多くあるという証拠を提供した。この分類試験の精度をさらに官能基のうちGiの刺激に対する応答にオステオポンチン（OPN）の異なる効果を実証することによって改善されている。 ここでは、現在我々の研究室で行われ、この機能試験の実験や分析法の詳細な手順を文書化する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

このプロトコルは、無症候性および影響を受けた小児の特発性側弯症の予後を予測するための機能テストとして、我々の研究室で開発された細胞ベースのアッセイのための実験や分析手順を詳しく説明します。アッセイは、自動化されたCDSベースの器具を用いて、細胞誘電分光法（CDS）による末梢血単核細胞（PBMC）中の王とGsタンパク質の機能的状態の評価から構成され、3つの官能基への子供の分類（FG1王およびGSタンパク質刺激に対する反応の程度との間の不均衡のプロフィールに関しては、FG2、FG3）。分類は、さらに、グループ間のGiの刺激に対する応答にオステオポンチン（OPN）の差動効果により確認されると、疾患の重症進行は、FG2によって参照される。およそ、10mlの血液の体積は、フィコール勾配および細胞のPBMCを抽出するために必要とされるその後液体窒素中に保存されている。 Pの適切な数BMCは、アッセイを行うためには、細胞培養の2日後に得られる。本質的に、細胞を最初にphytohemmaglutinin（PHA）と共にインキュベートする。 24時間のインキュベーション後、培地を細胞播種およびOPN処理の前にさらに24時間、PHAを含まない培地によって置き換えられる。次いで、細胞をそれぞれ分光それらの同族受容体を介して王とGsタンパク質を活性化ソマトスタチンおよびイソプロテレノールに対する応答についてスクリーニングする。ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの両方を同時に統合された流体システムを注射し、細胞の回答を15分間モニターされる。アッセイは、新鮮または凍結したPBMCを用いて実施することができ、手順は4日以内に完了する。

細胞生存率は86〜96％の範囲で一致する値を有するすべてのサンプル間で同等であった。対照的に、高い変形が試料（ 表3）のうち、細胞数に認められた。使用される32のサンプルのうち、2セルの数が不足していたと分類されていない。王とGsシグナル伝達との間の不均衡の程度に従って機能分類の結果の例を図3に示している。この図の縦軸は、FG2のための10と-10の間、FG3のために&gt; 10として設立され、ダイナミックレンジを有する官能基の輪郭を描く3つのセクションに分かれており、最終的には&lt;-10 FG1用です。 5人の患者、特に345、353、370、371、および382は、範囲の境界線であったが。30の中では、ここでテストされた患者、14、6、および5人の患者が明確に、それぞれ、FG3、FG2、およびFG1に分類した王刺激に応答に対するOPNの効果の評価は、OPNはPAで応答を増加させたことを明らかにしていた353と371をtients。対照的に、応答はrOPN治療後に患者370の患者345および382で50％以上かつ50％未満に減少した。だから、私たちの分類基準（ 表2）によると、我々はFG1の患者353および371を分類することができました、患者345とFG2 382、およびFG3患者370。並行して、すべての患者は、Giのタンパ​​ク質の刺激に対する応答についてスクリーニングし、対照被験者と比較した。予想されたように、すべての患者は対照被験者よりも少ない応答性のようで、私たちの新しい手順で同じ官能基に分類された患者は、最大応答（ 図5）の同様のレベルを示した。また、各官能基の患者間格差が私たちの新しい手順を検証し、分類12の私達の古典的な範囲と一致した。定期サントジュスティーヌ病院で私達の特別なクリニックが従って、脊柱側弯症患者の大規模コホートの分類は3ことを明らかにしたFG2は、疾患の重症進行するリスクがよりこの官能基に分類された患者を特定し、この分類試験には有用であり得ることを示す、重症例のうち（ 図6）優勢であった、一方の官能基は、同様に、適度なケースの間で分配した特発性側弯症の予後。 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5">溶液A </td><td>無水D-グルコース</td><td> 0.1％ </td></tr><tr><td>のCaCl 2 2H 2 O </td><td> 0.05 mMの</td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム</td><td> 0.98 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 5.4 mMの</td></tr><tr><td>トリス</td><td> 145 mMの</td></tr><tr><td> B液</td><td> NaClを</td><td> 140 mMの</td></tr><tr><td rowspan="2">平衡塩類溶液（BSS） </td><td>溶液A </td><td> 1ボリューム</td></tr><tr><td> B液</td><td> 9ボリューム</td></tr><tr><tdROWSPAN = &quot;3&quot;&gt;完全メディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td rowspan="3">補足メディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40％ </td></tr><tr><td rowspan="4">凍結培地</td><td> RPMI-1640 </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40％ </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20％ </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHAメディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>フィトヘマグルチニン</td><td> 1％ </td></tr></tbody></table> 表1。必須ソリューションを提供しています。 <table border="1"><tbody><tr><td> ΔGとダイナミックレンジ </td><td> 官能基 </td><td> 鉄とダイナミックレンジ </td></tr><tr><td> ΔG&lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> FE&gt; 100％ </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG&lt;10 </td><td> FG2 </td><td> FE &lt;50％ </td></tr><tr><td> ΔG&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50％&lt;鉄&lt;95％ </td></tr></tbody></table> ΔGとFeとの間で確立ダイナミックレンジに応じて官能基の表2。分類。 <table border="1"><tbody><tr><td> 患者 </td><td> 生存率（％） </td><td> 細胞濃度（×10 6個 / ml） </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td>細胞の数が不足</td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td>細胞の数が不足</td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ TD&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。パーセント生存率および細胞濃度自動細胞計数および生存率分析器を用いて測定した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> 図1。細胞播種のためのデザイン 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> 図2。化合物を分配するためのデザイン 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> 図3。CDSベースのシステムを使用した機能的な分類のダイナミックレンジ 。グラフは、特発性側弯症の患者からのPBMCで得られた王およびGS刺激に対する応答の間の不均衡の程度の値を示している。値は、ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの10μMのに反応して、CDSベースのシステムで測定した。各ポイントは、重複しての両方の反応のΔGを表しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> 図4。PBMC中の王刺激に対する応答にrOPNの影響 。細胞を、0.5μg/ mlのrOPNの存在下又は非存在下で18時間血清飢餓状態にし、次いで10で刺激<html> 56;ソマトスタチンのMは王媒介細胞応答を開始する。グラフ内のデータは、最大最小インピーダンスから生成され、重複した応答の平均値に対応した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> 図5。制御とscoliostic被験者からのPBMC中のGiタンパク質の機能状態 。対照被験者と脊柱側弯症患者由来のPBMCを、内因性ソマトスタチン受容体を介してのGiタンパク質を刺激するために、ソマトスタチンの漸増濃度に曝露した。手順の項に記載のように細胞性応答はCDSベースのシステムで測定した。曲線は最大最小インピーダンスから生成した。各曲線は、非線形回帰を表しています。データは、対照被験者からの細胞では最大応答に対して標準化し、各点は、重複での応答の平均値に対応しています。/ 50768/50768fig5large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> 図6脊柱側弯症の異なるフェーズ間での官能基の分布 。定期サントジュスティーヌ病院で続い794中等度（10から44°の間の曲率）と162（45°以上の曲率）重篤な症例で、脊柱側弯症患者の大規模コホートは、王とのGに対する応答の間の不均衡の程度に応じて分類された刺激。応答は、ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの10μMのに反応して、CDSベースのシステムで測定した。

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

構造化されたプロトコルは、細胞誘電分光法（CDS）を用いて、特発性脊柱側弯症の予後を予測するための機能テストのような細胞ベースのアッセイのために提示される。アッセイは、新鮮または凍結末梢血単核細胞（PBMC）を用いて行うことができ、手順は4日以内に完了する。

携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.6K ビュー.  Sainte-Justine University Hospital Research Center. 構造化されたプロトコルは、細胞誘電分光法（CDS）を用いて、特発性脊柱側弯症の予後を予測するための機能テストのような細胞ベースのアッセイのために提示される。アッセイは、新鮮または凍結末梢血単核細胞（PBMC）を用いて行うことができ、手順は4日以内に完了する。 

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An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

手術後の痛みの予測のための実験パラダイム（PPOP）

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

医学

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

マウスモデルを用いた急性電離放射線による皮膚毒性の定量的評価のための光学分光拡散

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

MRIにおける視神経断面領域の定量化:フィジーソフトウェアを用いた新規プロトコル

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

心肺機能改善のための現実世界の高強度インターバルトレーニングプロトコル

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

ネットワーク薬理予測とメタボロミクス 高脂血症に対するフルクタス・フィランティのメカニズムの検証

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

LC-MS を用いた涙液プロテオミクスのための非侵襲的バイオマーカーの探索

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

著者スポットライト:プロテオミクス研究のための標準化されたプロトコルを使用した涙液分析の進歩 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

液体クロマトグラフィータンデム質量分析による涙液プロテオミクスのためのタンパク質懸濁液トラップサンプル調製

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...