このプロトコルは、細胞外マトリックスの特性(剛性、タンパク質組成、細胞形態などの)を、コスト効率の高い簡単な方法で正確に制御できる細胞培養プラットフォームを提供します。この方法は費用効果が高く、特別な訓練や設備は必要ありません。また、免疫蛍光染色やウェスタンブロットなどの複数の細胞定量方法にも対応しています。
この技術は、シュワン細胞生物学の機械的な理解を提供する。神経系再生のための生体材料設計に関する追加の洞察を用いて、任意の停泊細胞に適用することができる。このプロトコルの最も困難な部分は、マイクロコンタクト印刷です。
プロトコルの開始前に、フローレスを使用して基板上でマイクロコンタクト印刷を行い、タンパク質にタグを付け、パターンへの最終印刷を視覚的に検証する。まず、PDMSベースエラストマーと硬化剤をピペットチップで、気泡が混合物内に均質に分散するまで激しく混合します。次に、真空乾燥で気泡を取り除きます。
乾燥したPDMS混合物を正方形または円形のカバースリップに一滴置き、スピンコーターのカバースリップを2,500 rpmで30秒間回転させます。オーブンで60度、1~2時間、または室温で一晩でカバースリップをインキュベートします。マイクロパターン化された基板を作成するには、直径150ミリメートルの直径を15ミリメートルのペトリ皿の内側にパターン化したシリコンウエハーを置き、ガスを取り出したPDMSをウェーハに注ぎます。
一晩で60°CでオーブンでPDMSを固めた。PDMSを室温まで冷却します。次に、外科用メスを使用して、シリコンウエハーに損傷を与えないように注意して正しいパターンを含む30×30ミリメートルの平方の切手をカットします。
PDMSスタンプと調整可能なカバースリップを70%エタノールに30分間浸漬して滅菌します。マイクロパターンの有効性を確認するために、フィルターされた空気流とピペット15マイクログラムを使用してPDMSスタンプの表面を乾燥させて、1ミリリットルBSA溶液でスタンプのパターン化された側面全体をカバーします。スタンプをBSA溶液と一緒に室温で1時間インキュベートし、タンパク質吸着を可能にし、次いでスタンプを空気乾燥させてBSA溶液を除去します。
フィルター処理された空気流を使用して、調整可能なカバースリップの表面を乾燥させます。スタンプのパターン付き側を調整可能なカバースリップとのコンフォーマルコンタクトに持ち込み、カバースリップ表面にBSA吸着を可能にし、スタンプをカバースリップに対して5分間軽く押します。FITCフィルターで蛍光顕微鏡を用いてマイクロパターンを調べます。
蛍光パターンではなく細胞接着領域を印刷するには、BSAタンパク質のラミニンを代用する。カバースリップから切手を取り出し、カバースリップを滅菌された6ウェルプレートに移します。カバースリップの表面を覆い、室温で1時間プレートをインキュベートするために、各ウェルに0.2%プルロニックF-127溶液の2ミリリットルを追加します。
F-127溶液を吸引し、カバースリップをPBSで5回洗浄し、1回は細胞培養培地で洗浄し、シュワン細胞を1000細胞/センチメートル平方の播種密度で播種する。細胞播種後45分後、細胞培養培地を取り出し、カバースリップをPBSで2回洗浄し、複数の細胞が同じパターンに付着するのを防ぎます。細胞培養環境で細胞を48時間保存してから定量化します。
整列した細胞を調べる線パターン細胞培養基質を作成するには、原稿の方向に従ってスタンプを作成し、目的の寸法に切り出します。先に述べたように調整可能なPDMS表面でコーティングされた2つのペトリ皿を準備し、皿の1つにラインパターンの細胞接着領域を印刷するためにマイクロコンタクト印刷を行う。スタンプを取り外した後、ペトリ皿に0.2%Pluronic F-127溶液の4ミリリットルを充填し、1時間インキュベートします。
PDMSスタンプの各側を70%エタノールで3回リンスし、空気で乾燥させます。PDMS スタンプを回転させて、前に説明したように、2 番目のペトリ皿にパターン化されていないセル接着領域を印刷します。F-127溶液で皿をインキュベートした後、溶液を取り除き、PBSで3回、新鮮な細胞培養培地で1回皿を洗います。
次に、皿の上に細胞を播種し、リセートを準備する前に48時間所望の条件でそれらを維持します。溶解物を調製するには、氷冷PBSで細胞を2分間洗浄し、原稿の指示に従って調製した80マイクロリットルのRIPA溶液を各細胞接着領域に加え、25分間氷塊の上に細胞をインキュベートします。シュワン細胞を細胞スクレーパーで5分間掻き取り、ライセートをラベル付き1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに集めます。
12000回Gと摂氏4度で15分間、リゼートを遠心分離します。上清を集め、きれいなマイクロ遠心チューブに移します。ラミニン被覆基材は、コラーゲンおよびフィブロネクチン被覆基材と比較して増殖速度が高い結果となる。
ラミニンコーティングと異なるモジュライを有する基質上のシュワン細胞は、比較的柔らかい基質が細胞増殖速度を低下することを示した。細胞はまた、タンパク質発現について分析した。転写因子c-Jun発現は、基質が柔らかくなるにつれてアップレギュレートされた。
しかし、最も柔らかい基質上で著しくダウンレギュレートされた。硬質基質では、コラーゲン被覆基質が最も高いc-Jun発現をもたらし、基質が柔らかくなるにつれて、ラミニンはc-Junの最高レベルを示した。次に、細胞をローダミン-ファロイジンで染色し、c-Jun発現における細胞の広がりおよび面積の役割を探る。
細胞培養基質上に細胞粘着線を作成すると、パターン基質に播種された細胞の核アスペクト比は、パターン化されていない基質上の細胞に比べて増加した。c-Junとp75の両方のニューロトロフィン受容体の発現は、より小さな広がり領域を有する高密度細胞においてアップレギュレートされた。ラインパターン化された細胞は、非パターン化細胞と比較した場合、c-Junおよびp75 NTRの両方の発現も高い結果となった。
マイクロコンタクトプリントセルの接着形状は、細胞間相互作用を排除しながら、細胞の広がり領域と伸びを正確に制御するために作成されました。細胞縦横比を上げると、核伸長が増加した。c-Junの発現は、細胞伸長と細胞拡散抑制の両方によってアップレギュレートされた。
核とアクチンの両方の免疫蛍光染色により、このマイクロパターン化法により細胞の広がり領域と伸びが正確に制御されていることを確認しました。この技術は、シュワン細胞生物学と再生と癌の文脈におけるシグナル伝達を機械的に分析する方法として、当社の調整可能な基質を使用する方法を開いた。
