この方法は、新薬候補を臨床段階に安全に移行するための実際のヒトベースのデータを使用して、前臨床心臓の安全性と毒性に関連する質問に答えるのに役立ちます。このハイブリッドシステムの主な利点は、一連の異なるインビトロおよびインビボ技術を使用する代わりに、ヒトiPC由来の心筋細胞、電気生理学的および生存率パラメータの同時評価、および生理学的条件下での収縮特性の分析です。この方法は、心筋細胞の電気生理学的、構造的、収縮的変化と、69ウェルの同時試験を可能にするハイスループットシステムをカバーするため、創薬に適用できます。
プレートコーティングを開始するには、収縮性モジュールで測定するまで、収縮プレートの底部を追加供給のメンブレンガードで覆ったままにします。心筋細胞を播種するには、2.75ミリリットルのEHSゲルのすぐに使用できる溶液と8.25ミリリットルのDPBSをカルシウムとマグネシウムを含む滅菌遠心チューブに移して、希釈したEHSゲルコーティング溶液を調製します。それから溶液を混ぜる。
収縮プレートからメンブレンガードを取り外します。調製したコーティング液をラボオートメーションロボットの滅菌試薬リザーバーに移します。プログラムを使用して、ラボオートメーションロボットで100マイクロリットルを追加し、ウェルごとに100マイクロリットルのコーティング溶液を追加します。
次に、蓋を96ウェルプレートに戻し、摂氏37度で3時間インキュベートします。細胞を解凍してカウントした後、細胞メーカーの指示に従って推奨プレーティング培地で細胞を調整し、96ウェルプレート全体を播種するために11ミリリットルあたり10〜6番目の細胞を11倍にします。プログラムを使用して100マイクロリットルを除去し、ラボオートメーションロボットでウェルからEHSゲル溶液を除去します。
次に、11ミリリットルの細胞懸濁液をラボオートメーションロボットに設置した滅菌試薬リザーバーに移し、ウェルあたり100マイクロリットルの懸濁液を細胞に播種します。プログラムを使用して、セルは100マイクロリットルを追加します。細胞播種直後に、柔軟な96ウェルプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の湿度制御インキュベーターに移し、細胞を一晩沈降させます。
各プレートに添加する心筋細胞維持培地22ミリリットルを50ミリリットルの遠沈管で摂氏37度に温める。プレートを播種してから18〜24時間後に、新鮮な培地を滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットの横に置いておきます。次に、プログラムで培地の除去を実行し、100マイクロリットルを除去します。
次に、新鮮な培地を含む試薬リザーバーをラボオートメーションロボットに入れ、プログラムでウェルあたり200マイクロリットルの新鮮な培地を分注し、100マイクロリットルを追加します。このステップを2回実行して、ウェルあたり200マイクロリットルに到達します。培地交換直後に、プレートをインキュベーターに移します。
化合物添加まで1日おきに培地交換を行う。化合物添加の4〜6時間前に、22ミリリットルの新鮮で温かいアッセイバッファーを滅菌試薬リザーバーに移し、ラボオートメーションロボットの横に置いたままにして、最終的な培地交換を行います。培地交換直後にフレキシブルプレートをインキュベーターに戻します。
ベースライン測定の1時間前に、プレートをそれぞれの測定装置に移します。制御ソフトウェアで[プロトコルの編集]を開き、それぞれの測定モード、フレックスサイト、またはインピーダンスEFPを選択します。プロトコル番号を保存する前に、1回の測定のスイープ期間または長さを30秒に、繰り返し間隔を10分に定義します。
次に、[プロトコルの開始]を選択し、要求されたフィールドに入力し続けます。パラメータを設定したら、[測定の開始] を選択します。化合物添加の直前に、5分間隔で最低3回のベースライン測定を実行します。
可撓性96ウェルプレートを測定装置から取り出すことなく、各ウェルから50マイクロリットルのアッセイバッファーを除去し、続いて、測定計画に従ってプレートの各ウェルに50マイクロリットルの4倍濃縮化合物溶液を添加した。コンパウンド添加後、[試薬マーカーの追加]を選択して、コンパウンドプレートのレイアウトとコンパウンド溶液の容量を定義します。次に、実験計画に従って標準測定を続行するか、測定シリーズを続行を選択します。
代表的な分析は、ヒトiPS細胞由来心筋細胞の収縮性に対するキナーゼ阻害剤エルロチニブの効果を示しています。最低濃度では、エルロチニブは統計的に有意でない振幅の減少を誘発したが、エルロチニブのマイクロモル濃度は時間および用量依存的な心毒性効果を示した。効果の発現は、1マイクロモルのエルロチニブで96時間から見られましたが、10マイクロモルのエルロチニブで処理すると、化合物添加後24時間で有意な減少が見られました。.
10マイクロモルのエピルビシンの適用後、細胞は24時間以内に拍動を停止した。1マイクロモルのエピルビシンを適用すると、24時間後に振幅が劇的に減少し、その後48時間まで完全に拍動が停止しました。.100ナノモルでは、拍動振幅の時間依存的な減少が観察された。
10ナノモルの最低濃度では、振幅は着実に変動し、エピルビシンの効果が用量依存的であることを確認した。ドキソルビシンとニフェジピンによる24時間の治療は、濃度と時間に依存する方法で細胞の生存率を低下させます。.増加したニフェジピン濃度を適用すると、細胞上の電界電位記録は、正規化された野外持続時間の濃度依存的な短縮を明らかにする。
心収縮性に関するニフェジピンの評価も、10ナノモルおよび13ナノモル濃度の急性測定時に有意な濃度依存振幅減少を示しました。.細胞は一般に、温度やpHの変化などの環境パラメータや、収縮プレートで特にサポートされている機械的シミュレーションに敏感であることを覚えておくことが重要です。
