この作品は、臨床研究のための学際センター（IZKF）ミュンスター（シード3月12日、SB）によってサポートされていました。

マウス実験のために1。一般的なコメント<ol><li>マウスを用いた実験はすべて、それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。 </li><li>病原体を含まない条件下でマウスを維持し、食物および水を自由にアクセスできるようにすることを可能。注：疾患に対する感受性が、年齢や性別に応じて変動することができますので、それは実験群の年齢と性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。 </li><li> MOG 35-55ペプチドが抗原またはペプチドなしnonencephalitogenic PBSのいずれかにより置換される選択された実験条件に依存して、偽免疫化対照群と考えることができる。 </li><li> （下記参照）の前に、実験を開始する方法論的側面を考慮してください。我々は、EAEスコアリングのための1つまたは2つの盲目の観察者が関与することをお勧めします。 </li></ol> MOG 35〜55エマルションの2。準備<ol><li> MOの1:1の比率の200μLG 35〜55ペプチド溶液と、CFAは、各マウスに注入する必要があります。準備と注入しながら粘性エマルジョンの一部の損失がある。したがって、必要な量の1.5〜2倍を用意。 MOG 35〜55ペプチド溶液とCFAの両方の必要な金額の2によるエマルジ ​​ョン除算の総容量を計算します。 </li><li> 2 mg / mlの終濃度までのddH 2 O中で凍結乾燥したMOG 35-55を希釈する。私たちは通常、マウスあたり200μgのMOG 35〜55ペプチドを使用しています。この量は、ストック溶液100μlに含まれています。ペプチド溶液は-20℃で保存する必要があります</li><li>乳鉢に乾燥さ結核菌H37RA（100 mg）を1バイアルのコンテンツを配置。 <ol><li>薄い粉末を得、乳鉢と乳棒で粉砕した。 </li><li> 4℃で保存することができる10 mg / mlのCFAのストック溶液を得るために不完全フロイントアジュバントを10ml追加</li><li>予防接種の前に、CFAの原液ウィットを希釈2 mg / mlの最終濃度をH IFA。粒子状物質を再懸濁し、実験の準備中の粘性溶液の一部の体積損失を検討するために、各使用前に完全に混合する。 </li><li> 1ミリグラムの最終濃度個/ mlに達するまで、MOG 35-55ペプチド溶液と1:1で混合する。 注意：熱殺菌結核菌は、自然免疫応答を刺激する。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。 </li></ol></li><li>氷上で予冷ソリューションを提供しています。 <ol><li> 2 mg / mlのCFAおよび2 mg / mlの2 2ミリリットル注射器にMOG 35〜55の溶液の1ミリリットルの1ミリリットルを策定。免疫した動物の数に応じて必要な注射器の個数を計算する。 注意：厳密には肉芽腫を引き起こしたり、自己免疫反応を誘発する可能性があるアジュバントの準備中にステッチを避ける。 </li><li> MOG 35〜55溶液と、CFAのための20のGカニューレ27のGカニューレを使用してください。気泡を回避し、時に両方の注射器を接続HREEウェイバルブ。 </li><li>他に1シリンジからエマルジョンを送信し、優れた乳化は重要なステップであるように、少なくとも10分間完全に混合。乳化をサポートするために、3ウェイバルブを近閉じます。解決策は、相の分離なしに、白い硬い粘性である必要があります。 </li><li>エマルジョンは、免疫の前に数日間保存することができる。彼らは安定しているかどうかを観察するために乳剤を調製した後、少なくとも30分待ってください。予防接種の前に、2つのシリンジの1に溶液を描き、27 Gのカニューレを接続してください。 </li></ol></li></ol>百日咳毒素の3。準備<ol><li>百日咳毒素の異なる量は、投与経路（ 例えば、静脈内または腹腔内）に依存文献に見出すことができる。当研究室では、2日後に免疫の日に腹腔内に200μlのPBSで百日咳毒素400ngのを使用しています。注意：百日咳毒素は、多くの生物学的効果を持っている。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。 </li><li> 100μg/ mlの保存溶液を500μlののddH 2 Oに百日咳毒素50μgのを再構成。 4℃で保存する</li><li> PBSで1:50に希釈する。 200μlのは今のPBS 400 ngのが含まれています。注射器の必要量を用意し、それぞれの針ハブのための〜100μLの追加の過剰量を考慮してください。 </li></ol> 4。動物免疫<ol><li>必要な短期的な安楽死のための具体的な基準のための制度的動物管理使用委員会を参照してください。このようなケタミン/キシラジン注射またはhalothanなどの他のプロトコルも可能かもしれないが、我々の研究室では、イソフルランとの短い麻酔後を使用しています。麻酔を待って、麻酔のレベルを評価するために前足つま先のピンチを使用しています。 </li><li>予防接種は、動物のためのストレスを最小限に抑えるために、最適な予防接種を確実にするために経験のある方が行っていることを確認してください。 </li><li>抗100μlのを注入各後側腹部に2つの異なるサイトにGEN / CFAエマルジョン皮下。皮膚の下の球根質量フォームは実験を通して持続するべきであることを確認してください。 </li><li> intraperitonelly百日咳毒素の200μLを注入。 </li><li>個々のマウスは簡単にテールベースにカラーマーキングするなど 、日々の評価のために識別することができることを確認します。 </li><li>免疫後2日目の百日咳毒素の第二の用量を投与する。 </li></ol> 5。EAEの監視<ol><li>体重および臨床スコアが毎日評価する必要があります。 EAEの発症は、典型的には、疾患活動性の指標として使用することができる体重減少と相関する。制度上の動物の世話を参照して、個々のマウスは実験から取り出さなければならない場合の基準を事前に定義するための委員会を使用してください。体重減少が20初期体重の％以上際に重篤な臨床徴候は（EAE 7または悪化スコア）を超える場合に発生するときに考慮すべきである。再を参照してください許可された最大のスコアのためのそれぞれの制度的動物管理使用委員会のspectiveガイドライン。 </li><li>マウスがEAEの臨床症状を有する場合には、水ボトルがまだ到達することができ、その食品がケージの床に載置されることを保証することが重要である。 </li><li>別のスコアリングの症状を使用することができる。私たちの研究室では、0〜10のスケールが設定される。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> グレード </td><td> 臨床症状 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 0 </td><td>臨床徴候ん</td><td>マウスは尾の基部に保持されていれば定常歩容、尾部が移動して上げることができ、尾部は丸い物体を包み込む</td></tr><tr><td> 1 </td><td>部分的にぐったりテール</td><td>通常の歩行、尾の先端が垂下</td></tr><tr><td> 2 </td><td>麻痺テール</td><td>通常の歩行、尾の垂下</td></tr><tr><td> 3 </td><td>後肢の麻痺、非協調運動</TD&gt; <td>まとまりのない歩行、尾がリンプ、後肢をつまんへの対応</td></tr><tr><td> 4 </td><td>一つの後肢が麻痺</td><td> 1後肢のドラッグと非協調歩行、尾がリンプ、1後肢ピンチに応答しません</td></tr><tr><td> 5 </td><td>両方の後肢が麻痺し</td><td>ドラッグ両方の後肢に非協調歩行、尾がリンプ、両方の後肢のピンチに応答しません。 </td></tr><tr><td> 6 </td><td>後肢が麻痺し、前肢の弱点</td><td>前肢と非協調歩行をつまん後に身体、前肢反射を引くのに苦労し、尾はリンプ</td></tr><tr><td> 7 </td><td>後肢は1前肢が麻痺し、麻痺し</td><td>マウスは尾がリンプ、1前肢がつま先のピンチに応答し、移動することはできません</td></tr><tr><td> 8 </td><td>後肢の両方前肢が麻痺し、麻痺し</td><td>マウスは尾がリンプ、両方の前肢はつま先のピンチに反応しない、移動することはできません</td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td>瀕死の</td><td>動かない、変更された呼吸</td></tr><tr><td> 10 </td><td>死</td><td></td></tr></tbody></table>表1。臨床スコアリングシステム。

<ol>
	<li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+a+complicated+picture+of+autoimmunity.">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li><li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+the+world+is+not+enough.">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li><li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis.">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li><li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+multiple+sclerosis.">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li><li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men:+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis.">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAE:+an+immunologist's+magic+eye.">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li><li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund's+adjuvant:+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells.">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

能動免疫プロトコルと異なるEAEモデルの多数は、過去数十年にわたって説明してきた。ラットモデルが広く、最近まで使用されてきたが、マウスは現在、EAE研究のための最も人気のあるモデル生物である。この開発は、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーにとりわけある。 MOG 35-55ペプチドを用いたC57BL / 6マウスの免疫化は、最も広く分布EAEモデルの一つであり、信頼性の高い複製可能かつ十分に使い動物モデルとして考えることができる。他のEAEモデルは、より具体的な実験の質問のために使用されているが、多くの神経免疫学研究室では、MOG 35〜55誘発性EAEは、選択したモデルとして確立されている。 考慮すべき重要な点は、EAE実験は方法論的に正しいが行われていることを確認するための実験設定を計画しています。内部妥当性については、疾患症状の盲目採点を強くお勧めします。 Experimentalグループがあるべき年齢に、体重、および性別をマッチさせたマウスを無作為に処置群に割り当てる必要があります。実験は、常に動物福祉の規制を遵守して実施されるべきである。 EAEの研究は、多くの場合、パワー不足であると考慮した統計タイプIIのエラーを取るこ​​とはありません。したがって、実験前に、サンプルサイズの計算は行われるべきである。必要なグループサイズは、予想される効果の大きさに依存します。統計分析のための専門家の相談は、EAE実験を開始する前に考慮されるかもしれません。 プロトコルのいくつかの制限を念頭に置いておく必要がある。最も重要なことは、aEAEデータの解釈は、アジュバントおよび免疫学的反応の両方に付加的な影響を有する百日咳毒素を用いて免疫化モードによって損なわれる。また、MOG 35-55 EAEモデルは、CD4 + T細胞は免疫応答を駆動し、主に示すことを考慮すべきである。 CD8 + T細胞およびB細胞がプレーこれらの細胞型に対処する際にあまり顕著な役割や代替プロトコルが考慮されるべきである。予想される疾患経過は、急性単相および自己限定です。あるいは、再発寛解型疾​​患経過は、また別のEAEモデルにおいて達成することができる。プロトコルの追加の重要な制限は、MSの病態生理の免疫学的構成要素に向けて一定のバイアスである。最後の年の間に、MSは、強力な神経変性成分を有していることが次第に明らかになってきた。オリゴデンドロサイトとニューロンの死は神経障害の進行性の蓄積になる。これは、EAEモデルは、自己免疫性炎症の神経変性メカニズムに関する実験質問への回答が、完全に適していないかもしれないことを考慮に入れなければならない。中枢神経系の病理学を中心とした代替動物モデルが考えられるかもしれない-末梢免疫系の関与なしに有毒な脱髄を損なうキュプリゾンモデルEG。 記載されたプロトコルは、基本的な神経免疫実験モデルとして考えること及び他の用途のために修飾することができる。上述の実験手順を容易に、例えば 、治療を評価するために特に適している再発寛解型EAEの疾患経過のためのPLP 139-151ペプチドおよびSJLマウスを使用して（タンパク質のマウス系統または種類および量を変えることによって、他のEAEプロトコルに適用することができる再発への影響）。記載されたプロトコルはまた、養子移入実験（パッシブEAE）のために使用することができる。上述したように、このモデルでは、C57BL / 6マウスを、MOG 35-55ペプチドおよびCFAで免疫化する。対照的に、百日咳毒素は不要である。 7-15日後、脾臓またはリンパ節を単離し、免疫細胞を、MOG 35-55ペプチドおよびC57BL/6seマウスの新しいグループに移す前に、種々のサイトカインを用いてインビトロで再刺激されている。これらのレシピエントマウスは、数日前にCLAS時よりもEAEを開発sical予防接種。 インビトロ条件下で特異的な免疫学的な質問のために変化させることができる（ 例えば 、偏光T H 1またはT H 17細胞へ）。 時々、低い疾病の発生または弱い症状が実験的挑戦であるかもしれません。トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項は次のとおりです。 - 疾患の重症度は、ペプチド/マウスの異なる量を変化させることができる。 - 最適なCFAの濃度は1〜5 mg / mlのとは異なる場合があります。実験を確立するときに、CFAの滴定を考えてみましょう。できるだけ多くの規制は2 mg / mlのを超えて、CFAの濃度を禁止許可CFA濃度について、それぞれの施設内動物のケアと使用委員会のそれぞれのガイドラインを参照してください。 - 種々の方法は、エマルジョンを調製するために記載されている。貧しい乳化possibとして考えた場合、例えば、1時間または超音波処理のためのボルテックスのような別の方法が考えられるかもしれないル·エラーソース。 - 年齢、性別、年の季節や動物施設内の環境条件は、EAE感受性に影響を与える重要な要因である。これは、条件が独立した実験間で同等であることを確実にすべきである。 上述したように、上記プロトコルは、養子EAE実験のための出発点として使用することができる。このモデルは、（野生型レシピエントマウスに脳炎ノックアウト細胞を転送することによって）、遺伝的表現型の末梢およびCNS効果を分離するための転写および細胞の表現型などの特定の免疫学的な質問のために特に適している十分に特徴づけることができる。最後の年の間に、EAE研究の最新の開発は、T細胞受容体トランスジェニックマウスである。これらのマウスは、アジュバント接種の問題を回避し、外部の影響を受けることなく自然にEAE症状を開発しています。しかし、このモデルはbreediのために動物を大量に必要とする十分なグループサイズを確保することngの。ノックアウトマウスの評価は前aEAEとは対照的に、EAE実験に交配を必要とします。各マウスが別の日に病気の症状が発展するにつれ、新規物質の評価はかなり複雑になる可能性があります。そのため、神経免疫ための古典aEAEの値は比類のないままになります。

多発性硬化症（MS）は、中枢神経系の慢性脱髄性炎症性疾患であることを特徴とする異種および蓄積臨床症状におけるオリゴデンドロサイトおよびニューロンの破壊をもたらす。 MSは、中枢神経系（CNS）の原型の自己免疫疾患と考えられている動物モデルは、その複雑な病因を解明するために開発されている。さらに、現在の治療は、部分的にしか有効であり、神経変性成分が、おそらく将来の治療的アプローチ1,2の大きな課題である間、主に疾患の炎症期を対象としています。 疾患の正確な病因は未だ不明であるが、CNSにおける軸索のミエリン鞘上のエピトープに対する自己免疫反応は、疾患の発症を誘発すると想定されます。免疫系の遺伝的脆弱性と環境要因（ 例えば感染症、ビタミンD）の調節不全があると考えられているMSの病態生理学的メカニズムの中心的な側面に影響を与える。 動物モデルの3つの異なるタイプが現在、MSの病理学的なパターンの探索のために確立されています。タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）のようなウイルスのモデル、クプリゾンのような有毒物質により誘発されたモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）3の最後に異なる変形、 4。彼らはすべてのMSの機能を模倣するが、彼らは適応免疫系の関与のような基本的な病理学的特徴で途方も異なっている。それは神経炎症経路を調査するために特に有効であり、多くの場合、新たな治療戦略の5,6の有効性のための「証拠の原則」のモデルとして役立つように、EAEは、最も一般的な動物モデルである。 EAEは、多くの異なる動物（ 例えばマウス、ラット、ミニブタ、モルモット、ニワトリ、又は霊長類）において誘導することができる。しかし、マウスは、少なくとも部分的に起因する最も広く使用の種となっている洗練されたトランスジェニックやノックアウトマウス7のレパートリーを拡大する。 EAEの病態生理は、脳特異的抗原に対する免疫系の反応に基づいている。この反応は、MS患者において観察されるものと同等の神経学的および病理学的特徴で、その結果、構造体を担持する抗原の炎症および破壊を誘導する。 3つの異なるアプローチに区別することができます。積極的に誘導されるEAE（aEAE;能動免疫）、受動的にEAE（pEAE、免疫動物から脳炎誘発細胞の転写）自己免疫の研究を可能にする、より最近では、自発的なEAEマウスモデル（SEAE）外因性の操作をすることなくメカニズム。最も簡単な誘導可能なモデルは、高速かつ堅牢な結果に得たマウスでaEAEです。このモデルは、フィールド8での多くの研究者によって神経免疫動物モデルの「ゴールドスタンダード」として考えられている。 aEAE誘導のため、動物予防接種の日に百日咳毒素を腹腔内投与に伴う選ばれた抗原および完全フロイントアジュバント（CFA）からなるエマルジョンの皮下注射で免疫し、2日後にされている。その結果、ミエリン特異的Tリンパ球は末梢で活性化され、血液脳関門を横切ってCNS内に移動される。 CNSに入ると、T細胞は、後続の炎症カスケード、単球またはマクロファージ、最終的には、脱髄および軸索細胞死9のような他の細胞の関与が生じる局所浸潤性および抗原提示細胞によって再活性化される。免疫化プロトコールおよびマウス系統との組み合わせに応じて（ 例えば、C57BL / 6、SJL / J、Biozzi）および抗原（ 例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（PLP））、疾患コー​​スは、急性、慢性進行性または再発寛解型疾​​患経過を取ることができます。 35〜55ペプチド10、病気の最大値を有するC57BL / 6マウスの免疫のためのプロトコルを記述次の10から20日間の。単独MOG 35-55ペプチドの免疫原性は、疾患を誘発するのに十分でないように、このようなCFAなどのアジュバントが必要である。これは、CFAの成分は、これらの分子の食作用およびサイトカインの分泌を誘導する単核食細胞を活性化することが想定される。これは抗原の存在およびリンパ系へのこれらのより効率的な輸送の延長をもたらす。 EAE誘導は、特に調節することが示唆されている百日咳毒素（PT）の適用によって促進される血液脳関門および免疫学的応答性自体は11。疾患誘導した後、特別なケアは、病気の症状のためのマウスの日々の評価のために注意する必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Jackson Laboratory, Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Pepceuticals Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:119px;">F5506</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle&#160;</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes, 2 ml</td>
			<td style="width:205px;">e.g. B. Braun</td>
			<td style="width:119px;">7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needles, 25G5/8 and 30G1/2&#160;</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Becton Dickinson &#38; Co.,</td>
			<td style="width:119px;">305122, 305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Three way halve</td>
			<td style="width:205px;">e.g. B. Braun</td>
			<td style="width:119px;">16494 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pertussis toxin, lyophilized in buffer</td>
			<td style="width:205px;">Enzo Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">BML-G100</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M. tuberculosis H37 RA</td>
			<td style="width:205px;">BD Difco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">231141</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myelin oligodendrocyte glycoprotein (mog35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) in c57bl/6 mice

多発性硬化症は強力な神経変性成分を有する中枢神経系の慢性神経炎症性脱髄疾患である。この疾患の正確な病因はまだ不明であるが、自己反応性Tリンパ球は、その病態生理学において中心的な役割を果たしていると考えられている。 MSの治療は、これまで部分的にしか有効であり、研究努力は、病気の病態生理に関する我々の知識を拡大し、新たな治療戦略の開発を続けています。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、MSが、多くの臨床的および病態生理学的な機能を共有するための最も一般的な動物モデルである。人間、MSの異なる、臨床免疫学的および組織学的な側面を反映して、EAEモデルの幅広い多様性があります。マウスでは、積極的に誘導されるEAEは、堅牢で複製可能な結果を​​最も簡単な誘導可能なモデルです。それは、自己免疫neuroiによって挑戦トラ​​ンスジェニックマウスを用いて、薬物の又は特定の遺伝子の影響を調査するために特に適しているnflammation。したがって、マウスは、CNSホモジネートもしくはミエリンタンパク質のペプチドで免疫化する。によるこれらのペプチドの低免疫原性のために、強力なアジュバントが使用される。 EAE感受性と表現型は、選択された抗原および齧歯類株に依存します。 C57BL / 6マウスは、トランスジェニックマウスの構築のための一般的に使用される菌株であり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）に特に反応する。免疫原性エピトープのMOG 35〜55は、免疫前および百日咳毒素に完全フロイントアジュバント（CFA）に懸濁されている予防接種の日に適用され、2日後にされている。マウスは、免疫後9月14日日以内に弛緩性麻痺の昇順で &quot;古典的な&quot;自己限定単相性EAEを開発しています。マウスを、25〜50日間の臨床スコアリングシステムを用いて毎日評価する。 EAEを有する動物だけでなく、このモデルの潜在的なアプリケーションと限界のケア取るための特別な考慮が議論されている。

免疫化後、マウス体重の変化および臨床症状について毎日評価されなければならない。疾患の発症は、通常、EAE症状が表示されている1〜2日前に開始可能性があり軽量化と相関している。 EAEの臨床症状は通常、一日9と14免疫後の間で始まる。病変は、主にC57BL / 6マウスにおけるMOG-EAEにおける脊髄に局在化されると、それらは、典型的には、吻側尾側のパターンで主に運動の症状を発症する。 EAE症状（スコア6）で免疫したマウスの代表的な画像が図1Aに示されている。いくつかの非定型EAE症状はまた、 表1に示した古典のEAEスコアの中に反映されていない軸回転可能に転がり、猫背の外観や過敏症などの発生する可能性がある。運動症状がこのモデルの主な特徴であるように、このスコアは私たちを与えるん疾患の重症度を示す目安。異なる監視システム（ 例えばスコア0 -別の赤字を評価する5または0-6）、より複雑な複合スコアも発表されている。それぞれの制度的動物管理使用委員会によると、実験から取り出されなければならない重篤な症状で、そのマウスに注意してください。マウスは、次の10〜20日以上の症状の一般部分的な回復を示しています。代表的な疾患経過は、 図1Bに示されている。結果パラメータを評価するために重要であるEAEの間の異なる時点がある。頻繁に見つけることができるいくつかの典型的なアッセイは、非常に簡単に説明する。疾患最大で、マウスは、in vitroでの MOG 35-55ペプチド（MOGリコールアッセイ）を用いて単離された免疫細胞の再刺激後のサイトカイン産生または増殖を評価することができる。免疫細胞はまた、EAEの症状を有するマウスからの脳及び脊髄から単離され、さらに処 ​​理され、フローサイトメトリーにより、例えばすることができる。脊髄切片の組織学的分析は、疾患mで行うことができる病変の負荷と脱髄のためaximum、後で神経変性および神経細胞死のためのマーカーを指している間は、対象となる可能性があります。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> 図1。代表EAE結果。 30日間の免疫後のEAE症状を免疫したC57BL / 6マウスのA.代表画像（EAEが6得点）。B.代表の疾患経過。データは、平均値と平均値の標準誤差として示されている（N = 5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

80.9K ビュー.  University of Münster. 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ビデオ: Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

免疫・感染学

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for study of the human demyelinating disease, multiple sclerosis (MS). EAE is characterized by pathologic infiltration of mononuclear cells into the CNS and by clinical manifestation of paralytic disease. Similar to MS, EAE is also under genetic control in that certain mouse strains are susceptible to disease induction while others are resistant. Typically, C57BL/6 (H-2b) mice immunized with myelin basic protein (MBP) fail to develop paralytic signs. This unresponsiveness is certainly not due to defects in antigen processing or antigen presentation of MBP, as an experimental protocol described here had been used to induce severe EAE in C57BL/6 mice as well as other reputed resistant mouse strains. In addition, encephalitogenic T cell clones from C57BL/6 and Balb/c mice reactive to MBP had been successfully isolated and propagated.
The experimental protocol involves using a cellular adoptive transfer system in which MBP-primed (200 &mu;g/mouse) C57BL/6 donor lymph node cells are isolated and cultured for five days with the antigen to expand the pool of MBP-specific T cells. At the end of the culture period, 50 million viable cells are transferred into naive syngeneic recipients through the tail vein. Recipient mice so treated normally do not develop EAE, thus reaffirming their resistant status, and they can remain normal indefinitely. Ten days post cell transfer, recipient mice are challenged with complete Freund adjuvant (CFA)-emulsified MBP in four sites in the flanks. Severe EAE starts to develop in these mice ten to fourteen days after challenge. Results showed that the induction of disease was antigenic specific as challenge with irrelevant antigens did not induce clinical signs of disease. Significantly, a titration of the antigen dose used to challenge the recipient mice showed that it could be as low as 5 &mu;g/mouse. In addition, a kinetic study of the timing of antigenic challenge showed that challenge to induce disease was effective as early as 5 days post antigenic challenge and as long as over 445 days post antigenic challenge. These data strongly point toward the involvement of a "long-lived" T cell population in maintaining unresponsiveness. The involvement of regulatory T cells (Tregs) in this system is not defined.

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Certain mouse strains are able to resist induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) with myelin basic protein. Described here is a simple immunization protocol that reverses the unresponsiveness and induces paralytic disease in several typical EAE resistant mouse stains.

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

自己免疫性脳脊髄炎における マイコバクテリウム・パラ結核 による免疫原性増強

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) containing inactivated Mycobacterium tuberculosis. The antigenic components of the mycobacterium activate dendritic cells to stimulate T-cells to produce cytokines that promote the Th1 response via toll-like receptors. Therefore, the amount and species of mycobacteria present during the antigenic challenge are directly related to the development of EAE. This methods paper presents an alternative protocol to induce EAE in C57BL/6 mice using a modified incomplete Freund&#39;s adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strain K-10.
M. paratuberculosis, a member of the Mycobacterium avium complex, is the causative agent of Johne&#39;s disease in ruminants and has been identified as a risk factor for several human T-cell-mediated disorders, including multiple sclerosis. Overall, mice immunized with Mycobacterium paratuberculosis showed earlier onset and greater disease severity than mice immunized with CFA containing the strain of M. tuberculosis H37Ra at the same doses of 4 mg/mL. The antigenic determinants of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)&#160;strain K-10 were able to induce a strong Th1 cellular response during the effector phase, characterized by significantly higher numbers of T-lymphocytes (CD4+ CD27+), dendritic cells (CD11c+ I-A/I-E+), and monocytes (CD11b+ CD115+) in the spleen compared to mice immunized with CFA. Furthermore, the proliferative T-cell response to the MOG peptide appeared to be highest in M. paratuberculosis-immunized mice. The use of an encephalitogen (e.g., MOG35-55) emulsified in an adjuvant containing M. paratuberculosis in the formulation may be an alternative and validated method to activate dendritic cells for priming myelin epitope-specific CD4+ T-cells during the induction phase of EAE.

著者スポットライト:実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強におけるパラ結核菌のアジュバント活性  

Here, we present an alternative protocol to actively induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, using the immunogenic epitope myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspended in incomplete Freund's adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強における 抗酸菌パラ結核の アジュバント活性

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...