著者は、米軍ERDC軍事技術6.1基礎研究プログラムと監督研究プログラムのERDCセンターが提供する、この仕事のための財政支援を承認したいと思います。著者はまた、実験的な作品を支援するためのERDC地盤と構造研究所のコンクリート·材料支店のスタッフと設備を感謝したいと思います。公開する許可はディレクター、地盤＆構造研究所によって付与されました。

1。魚鱗サンプル調製この研究では、スケールは約600ミリメートル、長GAR（A.ヘラ ）からミドル丈で、米国陸軍工兵隊研究開発センター（ERDC）環境研究所（尾番目の列29）から得た。魚の鱗はERDCに従って入手し、国立衛生研究所（NIH）の動物管理指針た。 <ol><li>材料 研究のために取得したスケールの魚に空間的位置を記録します。このようなNIHの動物保護ガイドラインのような生物学的標本を得るための適切な組織または政府のガイドラインを遵守してください。水和を維持し、彼らは、魚から削除されるとミネラル含有量を維持するために、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの適切な媒体中でのスケールを保管してください。ナノインデンテーションデータに影響を与える可能性がある、ミネラルが失われることが長期貯蔵は避けてください。ブラシとT毛メディアを使用ハードスケールからの軟組織を除去するためにweezers。 </li><li>マウントと分割標本 横FTIRを使用して、魚のスケールの短軸の部分（ 図1）とナノインデンテーションを調べると、最初のそのような樹脂と硬化剤からなる2液型エポキシなどの硬い媒体にスケールを取り付けが必要です。そのような55℃未満のピーク温度を有していたこの研究で使用される市販の汎用エポキシ樹脂などの低ピーク温度を有する汎用RT硬化性エポキシを使用</li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1.jpg" /> A.図1 X線CT画像A.この研究で検討短軸横断面を示すへらスケールナノインデンテーションおよびFTIR [A（前部）、P（後部）、D（背側）、V（腹 ​​側）]を使用してへら 。&lt;/ pの&gt; <ol start="2"><li><ol><li>市販のプラスチック製の試料ホルダーを使用して、32ミリメートルの直径のサンプル型の中で魚のスケールを持ちます。これは、エポキシで取り付けながら、正しい向きにサンプルを保持します。 </li><li>サンプルを金型内に保持されていると、試料上の未硬化のエポキシを注ぎ、その後エポキシは製造者の指示に従って硬化させる。 </li><li>エポキシが硬化した後、セクションは、ダイヤモンドブレード高精度のカットオフを使用して取り付けられた試料は、試料の正中線で見た。 </li><li>検体から破片を除去するための15分間蒸留水中で超音波処理。 </li></ol></li><li>ナノインデンテーションおよびFTIR用研磨 図2に示すように、ナノインデンテーションのために滑らかな平面を入手するには、次の研磨手順とパラメータは研磨製造および試験サンプルとの協議に基づいて提案されている。しかしパラメータが応答に基づいて別の生体材料のために調整する必要があるかもしれませんこのような材料除去率など。研磨工程の間に蒸留水の浴内のサンプルの超音波は、研磨工程粗いから粒子を確実にするために不可欠であるが、その後の細かい研磨工程に導入されていません。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2.jpg" /> 研磨された短軸横断面Aの図2の画像エポキシに搭載されたヘラスケール 。 <ol start="4"><li><ol><li>潤滑剤として15μmのSiCのパッドと水で粗ポリッシュサンプルは、毎分200回転（rpm）の7 LBFと速度の自動研磨ヘッド力を用いて平面になるまで。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li><li>水130回転のプラテン速度で潤滑剤のための7 LBFの力を利用して6ミクロンのSiCパッド付き中間ポーランド5分。 </li><li> 15分間蒸留水の浴槽に超音波処理のサンプル。 </li><li> 130回転のプラテン速度で5分間7 lbfでの力で水潤滑剤を用いて1μmのSiCのパッドとポリッシュ。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li><li>このような製造業者が50 nmの懸濁液のために示唆している高密度の不織布、低昼寝多孔質ポリウレタンのような、適切な研磨パッドを使用して50nmのコロイダルシリカ懸濁液で最終仕上げ。 5分間の7 LBFの力で130 rpmの速度でポーランド。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li></ol></li></ol> 2。ナノインデンテーションテスト<ol><li>あたりのテストの各バッチの前にナノインデンテーションシステムを校正ガイドラインを製造しています。キャリブレーションは、ベルコビッチチップとフレーム剛性のためのシステムの面積関数を決定することを含むべきである。また、この段階での顕微鏡への圧子キャリブレーションを実行インデントを確実にするためには、選択された顕微鏡の場所に相関している。 </li><li>ナノインデンターにサンプルをロードし、焦点にサンプルを持って来るためにナノインデンターに光学顕微鏡コントロールを使用します。 </li><li>最初のインデントのための位置に試料を移動するためのソフトウェア·コントロールを使用します。理想的には、これは、スケールの断面の中心線に沿っ硬鱗質層の端部からのエポキシでは約10μmである。 </li><li>インデントの4平行な列を実行し、統計的に有意なデータを得るために離れて15μmの間隔をあけ、この位置から設定してください。 5 0.1 MN /秒のミネソタ、ロードとアンロード速度、30秒の保持時間、および行ごとに5μmの最小インデント間隔の最大負荷にナノインデンターを設定します。インデントの行は硬鱗質面に直交実行するように設定する必要があり、EPOXに約10μmを横断しながら、インデント十分な数のスケールの断面を横切って移動するように指定する必要があります骨の層の過去のy。 </li><li>バッチが完了すると、ナノインデンター、それぞれ硬鱗質層前と骨の層の後にエポキシでなければならない最初と最後のインデントで100 MNの最大荷重と基準インデントを作成している。これらは、インデントの行ごとに、開始点と終了点に相関している。 </li><li>ナノインデンテーションした後、さらに脱水を避けるために、PBS溶液中に試料を置くバック。 </li><li>時間に依存しない材料の応答が観察された場合、オリバー·ファー法13に基づき、弾性率と硬さを決定するために、ナノインデンテーションソフトウェアを使用してください。そうしないと、ホールド·タイムがあまりにも急速にアンロードから見たクリープを克服するために拡張する必要があるかもしれません。 </li></ol> 3。空間的に分解され、ATR-FTIR分光法スライドオンFTIR顕微鏡に装着ATRアクセサリーを使用すると、LAの赤外（FTIR）スペクトルを変換空間的に分解フーリエ変換を収集するための1提案された方法である魚鱗サンプル中のyers。 ATRアクセサリーは、他のFTIR技術では達成可能ではない、非常に小さい（〜10ミクロン2）空間分解能、高品質のスペクトルの収集が可能になります。同じ研磨された試料ナノインデンテーション実験のために調製された（ 図2）は 、これらの実験に使用した。 <ol><li>高品質のスペクトルは、ATR-FTIRのspectromicroscopyから取得されていることを確認するための分析に使用されているFTIR顕微鏡のための適切な表面と寸法のサンプルを選択してください。 </li><li>データを収集するために、FTIR顕微鏡を準備します。顕微FTIR試料を測定するために使用されるように、同一のサンプリング条件でFTIRシグナルのキャリブレーションを必要とする。典型的には、これは、検出器を冷却し、それが安定するための時間を可能にするだけでなく、同​​一の環境条件下で、すべてのバックグラウンドスペクトルとサンプルスペクトルを集める含む。これは、空気中のため、CO 2と水蒸気、特に重要になることができるDramatically FTIRスペクトルに影響を与える。これは、測定器の光学系が位置合わせされることを保証することも重要である。 </li><li>に対してサンプルを減算するために、適切なバックグラウンドスペクトルを収集します。これらの実験のために、研磨され、金被覆顕微鏡スライドを、FTIRのspectromicroscopyの背景として使用した。 </li><li>適切な対物レンズを使用して、サンプルに焦点を当て、分析の対象となる領域を選択します。 </li><li>関心領域が見つかると、それはATR内部反射要素と密接に接触するまで試料を上げ、FTIR顕微鏡対物レンズにATRアクセサリを取り付け、試料スペクトルを収集する。 </li><li> FTIRスペクトルを収集した後、必要に必要な標準的なデータ処理を行う。 </li></ol> 4。X線コンピュータ断層撮影（CT） <ol><li> 1.1節で述べたように、スケールを取得して準備</li><li>スキャナのセットアップ<ol><li>メーカーの仕様に合わせてウォームアップのX線源。 </li><li>それぞれ、X線電圧、50 kVの160μAの電流の設定。 </li><li> 1450ミリ秒の露光時間を設定します。 </li><li> 1.0ミリメートルのアルミフィルタを選択します。 </li><li>試料ローディングの前に、X線源がオフ（暗視野）である場合フラットフィールド補正を行うと（明視野）へ。 </li></ol></li><li>マウントと負荷試験片 彼らがシフトしたり、スキャンの長さ全体を移動しないように、スケールが可能に取り付けられている必要があります。これらのサンプルはまた、X線に対してほぼ透明である材料を使用してマウントする必要があります。発泡スチロールやパラフィルムの組み合わせは、CTステージにスケールを固定するために使用することができる。 <ol><li>最長寸法は、検出器と平行になるように厳密にサンプルをマウントします。 </li><li>スキャナステージに取り付けられたサンプルを固定します。 </li><li>それは、スキャン全体の回転の中心になるようサンプルを置きます。 </li><li>この場合、全体の規模は視野（FOV）の分野であることを可能にする最高の解像度を選択する7.5以下である。 </li></ol></li><li>取得設定 0.25°の回転工程及び15のフレーム平均値と、この研究でスキャンを実行する。低解像度が許容される場合には、ステップサイズを増加させるおよび/または総スキャン時間を短縮するために平均化フレームを減少させる。 </li><li>再構成パラメータ データセットが得られると、断面画像を含むデータセットを作成するためにX線投影画像を再構成する。以下を除いSKYSCANのNReconソフトウェアのデフォルト設定を選択します。 <ol><li> 20個の環アーチファクト補正を変更します。 </li><li> 25パーセント、ビームハードニング補正を変更します。 </li><li>断面画像のレベルを作るために、CS静的回転を調整します。 </li></ol></li><li>画像処理 最終的な3次元濃淡画像を得ることがSKYSCANのCTANソフトウェアを使用してください。発泡スチロールやパラフィルムから成果物を削除するために適切なレベルにグレースケール範囲を調整します。 </li></ol>ナノインデンテーションおよびmicro-/nano-structure特徴付けのために研磨することによって作製された標本を走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて調べた。低真空モードは、標本の脱水及び導電性コーティングの適用の必要性を最小限にするために利用された。局所的な化学分析は、エネルギー分散型X線分光法（EDX）を用いてSEM画像と併せて研磨し試験体で実施した。 EDX分析は、化学的および機械的特性間の相関を提供するために、ナノインデンテーションによって分析された同じ行/グリッド上で行われた。新たに破砕面はまた、魚鱗中に存在するバイオミネラリゼーションの構造の形態および配向に関するより良い情報を提供するために、SEMにより検査した。破断面上にナノスケールの構造を観察するための分解能を向上させるために、試験片をスパッタ金（Au）でコーティングし、高真空モードで画像化した。以下使用手順に関する追加の詳細を提供します。 <ol><li>研磨された表面のSEM画像<ol><li> SEM室内に研磨し、試料を配置し、0.1〜0.5ミリバールのチャンバ圧力と低真空モードにチャンバをポンプ。 </li><li>約5.0ミリメートルの作動距離を調整します。 </li><li>高電圧（HV）を有効にして、硬鱗質と骨のサブレイヤーまたはその他のテーマの間の移行ゾーンを含む試料上の関心領域に移動します。 </li><li> 15 kVのHVは、約3.9 nAのビーム電流で画像を取得します。 </li><li>画像の焦点を、すべての必要なアライメントおよび非点補正の調整を行う。 </li><li>関連の倍率（通常は250倍〜10,000 X）の多孔質骨対バイオミネラル含有量や密度の変化（ すなわち 、密度の高い骨の識別を支援するために低真空反射電子（BSE）検出器を使用しての関心の少なくとも三つの領域から画像を取り込む）。 </li></ol></li><li>破断面のSEMイメージング<ol><li>破断面を上に​​して、両面カーボンテープを使用して90°のSEMスタブにたて破砕片を貼り付けます。 </li><li>破面上のサブナノメートルの厚さの導電層を提供するために、金でコーティングをスパッタ。 </li><li> SEMチャンバ内に試料を置き、高真空モードにチャンバをポンプ。 </li><li> 3.0〜5.0ミリメートルに作動距離を調整します。 </li><li> HVを有効にして、試料上の関心領域に移動します。この場合、関心のある主な分野は、硬鱗質と骨の層に存在する構造であった。 </li><li>分解能を向上させるために、5〜40kVおよび15kVでのHVと0.24 nAののより低いビーム電流で画像を取得します。 </li><li>最初に試料を集中し、予備的なアライメントを行う。 </li><li>より大きい5000 Xに倍率を増加させ、浸漬/超高解像度（UHR）レンズに通常の電界放出レンズに切り替える。 </li><li> UHRアライメントおよび非点補正の調整を行う。 </li><li>少なくとも三つの領域Oから画像をキャプチャする関連の倍率でのFの関心は（通常は5000 X X 250,000）の二次電子（SE）モードで動作させるレンズ検出器（TLD）を介して使用。 </li></ol></li><li> （SEM像と併せて行う）研磨された表面のEDX分析。これらのパラメータは、モーザー14で説明したようにEDX相互作用体積はナノインデンテーション相互作用体積のサイズに類似している材料に依存しており、調整する必要があります。 <ol><li>インデントの各行の最後に基準マークが示すナノインデンテーションのグリッドが含まれて洗練された試料上の関心領域に移動します。 </li><li> HVは、少なくとも15 kVのであることを確認し、ビーム電流は、少なくとも3.9 nAのであり、作動距離は5.0ミリメートル以上である。 </li><li> EDXを用いて分析される領域のBSEイメージをキャプチャします。 </li><li> EDX分析ソフトウェアを使用して、インデントの線に沿って化学分析を実行するためのエリアを見つけるのを助けるために同じ画像を取り込む。 </li><li> 「オンライン分析」技術、POを使用して最初のインデントで始まり、最後のインデントで終わるインデントの注目ラインに沿って化学分析を実行するための行をsition。 </li><li>線に沿って配置される解析点の数を指定します。これは、化学組成と機械的性質との間の直接の空間相関を提供するために存在する分析点とインデントの同じ番号を使用することをお勧めします。 </li><li>線が正しく配置され、点が指定されると、EDXソフトウェアを使用してライン分析を開始する。 </li><li>ライン分析が完了すると、試料の研磨面上の指定された線に沿って得られた点スペクトルから定量化することに関心の要素を識別します。 </li><li>関心対象の要素が識別されると、制動放射放射線および他の効果を説明するためにバックグラウンド·キャリブレーションを行う。 </li><li>クォンタイズために、指定されたラインに沿った各ポイントでの定量的な分析を得るためにソフトウェアのデコンボリューション解析オプションを選択してください各点での化学組成をtify。 </li><li>ナノインデンテーションを用いて測定した機械的特性を有する空間的相関を補助するために分析された指定された行の画像と共に定量化学分析結果を保存する。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

先行研究は、石灰化した魚の鱗の機械的性質を示しているので、実験的観点からは、研究者が依存している自然な鉱物化魚の鱗のような生物学的物質を発生して作業する場合、魚のスケールの空間的位置を報告することは重要であることを覚えておく必要がありますスケールが魚4に位置していた場所へ。 鉱化生物学的材料の機械的特性はまた、試料4の水和状態に依存することが示されている。これが適切に乾燥化石のサンプルを使用、公開文献において公開された結果、水和された新鮮なサンプルを比較しようとしているこの技術の有用性を制限する。したがって、長時間の試験時間は、ナノインデンテーション中にサンプルの機械的性質に脱水の影響を最小限に回避する必要がある。材料固有のパイロット研究は実験を確保することをお勧めしますMENTランタイムは、材料の機械的動作を変更しないために十分最小限に抑えられます。湿潤細胞ナノインデンテーションは、試験装置で許可されている場合は、材料の一定の水和状態を維持することが好ましい方法である。 除荷曲線から弾性率を算出し、この研究で使用したナノインデンテーション法では、材料は線形弾性等方性材料として挙動すると仮定しています。技術は、圧子先端の様々な使用することができる。しかし、65.35°の半角を有する三方バーコビッチ先端をこの研究で使用した。このようなキューブコーナー（半角= 35.36°）のような代替のヒントは、この原稿で提示手順に適していますが、キューブコーナー先端はベルコビッチチップ割れが持つよりもはるかに低い負荷で、試料中に生成することができるよりもより深刻であるため、ベルコビッチチップ。 研磨を最小限に抑えるsurfacに滑らかで平坦な表面を得るために不可欠なステップであるE粗さは、ナノインデンテーション結果に影響を及ぼさない。本稿で提示研磨工程は、使用されている研磨の種類に応じて変更が必要な場合がありますの提案した手順である。しかしながら、正確なナノインデンテーション·データを確保するために重要な工程は、表面粗さが最小化されることで、この特定の材料については50nm最終仕上げは、プローブされる押し込み深さで滑らかな表面を得ることが必要であった。 インデントの間隔は、前のインデントから発生する材料変形の影響を受けない正確なナノインデンテーションデータを保証します。本研究では機器のナノインデンターのユーザーマニュアルには、インデントの間隔がベルコビッチ圧子15の最大侵入深さは少なくとも20-30Xであるべきことを示唆した。代替材料の場合、必要​​なインデントの間隔が開いているに前述したように加えられた荷重及び最大押し込み深さに基づいて決定する必要があります文献16,17。さらに、この材料の保留時間は、使用するナノインデンターソフトウェアのオリバー·ファー分析方法を可能にするプローブした異なる材料相について観察された任意のクリープを克服するために選択した。しかし、オーエン18で説明したように、代替の分析方法は、時間依存材料の応答は、適切な保持時間で克服されない場合があり、生物学的材料のために用意されています。 X線CTから高解像度の結果を達成するために、いくつかの設定を最適化する必要がある。本論文では、ユニークなサイズとレイヤード厚みのある魚の規模での使用のためのパラメータの非常に特定のセットの概要を説明します。サンプルサイズが変化すると、これらの設定は、最高品質のデータセットを得るために調整する必要がある。各パラメータを選択するプロセスは、明らかにマシンが使用されているが付属してマニュアルで定義する必要があります。スキャン設定（電圧、電流、露出、フィルタ選択）と復興の設定（リングアーティファクト、ビームハードニング）は、他のサンプルの大きさと形状の様々な対応するように変更する必要があるかもしれません。 X線CTは、スケールが互いに重ならなかった唯一の材料の骨層を覆う硬鱗質層を識別する全体のスケールモルフォロジーの画像を提供した。 X線CTの画像はまた硬鱗質層がスケールにわたって不均一な厚さからなり、完全に硬鱗質層を欠いていてもピット示したことを確認した。 興味深いことに、空間的にSEM / EDXの化学分析に相関ナノインデンテーションデータは、2層の間に鋭い遷移の代わりに離散P.の鉱化魚鱗について観察されたより緩やかな移行を同定senagalus（Bruetら 2）。 ナノインデンテーションの組み合わせ、FTIR、EDX、およびSEMを確認するために、機械的特性、化学分析、および構造情報を提供しエナメル様の形態と化学と硬鱗質として外層。さらに、これらの技術は、材料の骨層として内層を確認した。 結論として、この研究で概説した方法は、A.の鉱化魚鱗を検査する手順および対応する結果を同定しナノ構造と化学組成までバルク構造からヘラ 。

研究者は、構造的な生体材料を調査して、そのような個々の構成要素に比べてはるかに高い靭性や強度などの改善された機械的性質と構造的な生体材料を提供する設計原理を解明しようとしている。 マダイ7のための装甲魚の鱗の設計原理に調査、 ポリプテルス属senagalus 2,6、 ピラルク3、コイ 4、およびAtractosteusヘラ 1は、構造的な応答を研究するために、既存の実験的方法の適用を拡大する必要性を実証しているおよび微細構造の特性、詳細な標準手順は材料や実験のこれらのタイプでは使用できませんので、。 議論異なる装甲魚の鱗のうち、A.ヘラは、中央アメリカ8の歴史的頂点捕食者であり、高いと種であるLY鉱化さに比例します。以前に9述べた同等の大きさの魚に比べて改善されたプレデター防衛システムを取得するために、皮膚の質量のための種を交換する筋肉量。ページバリ10、Aに従ってヘラは白チョウザメ（ シロチョウザメ）以上の種であること大西洋チョウザメ（ チョウザメ属のオクシリンクス ）と北米最大の三淡水魚である。 Aの高度石灰化した魚の鱗ヘラは最近になって研究されている。トンプソンとマッキューン11がガースケールの形態は硬鱗質外層、骨拡散層と、層状骨層からなる三層の組成を有することを示唆した。 A.上の現在の研究ヘラスケールは、拡散または層状骨領域に骨の層を区別していませんが、ただ一つの内部層1,12として骨領域を研究している。 本研究では、中の手続き微細構造、ナノ構造、化学組成、およびA.のスケールの機械的特性の空間分布をvestigating スパチュラ FTIR分光法の結果に基づいて、SEM、X線CT、及びナノインデンテーション技術が提示されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">701-501512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epoxy hardener</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">703-501528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Samplkups</td>
			<td style="width:71px;">Buheler</td>
			<td style="width:119px;">20-8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SamplKlips I</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">20-4100-100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High precision cut-off saw</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">Isomet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraMet 2002 sonic cleaner</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">B2510R-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polisher</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">49-1750-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1200 grit (15-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4000 grit (6-um) SiC paper</td>
			<td style="width:71px;">Struers</td>
			<td align="right" style="width:119px;">40400014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50-nm colloidal silica</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-10075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chemomet polishing pad for 50-nm suspension</td>
			<td style="width:71px;">Buehler</td>
			<td style="width:119px;">40-7918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanoindenter</td>
			<td style="width:71px;">MTS</td>
			<td style="width:119px;">G200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FTIR continuum microscope</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Nicollet</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-ray Computed Tomography</td>
			<td style="width:71px;">Skyscan</td>
			<td style="width:119px;">Skyscan 1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SEM</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">NovaNanoSEM 630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EDX</td>
			<td style="width:71px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">AXS Xflash detector 4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sputter Coater</td>
			<td style="width:71px;">Denton</td>
			<td style="width:119px;">Desk II</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-layered fish scales (atractosteus spatula) using nanoindentation, x-ray ct, ftir, and sem

このような鉱物化魚の鱗、腹足類の貝殻、ラムの角、枝角、および亀の殻のような保護の生物学的物質の階層アーキテクチャは、将来的に保護材料やシステムの設計をガイドするためのポテンシャルを持つユニークな設計原理を提供します。障害が開始マイクロおよびナノスケールでこれらの材料系のための構造 - 特性の関係を理解することが不可欠です。現在、このようなナノインデンテーション、X線CT、およびSEMなどの実験技術は、これらの材料系1-6の階層的微細構造を有する機械的挙動を相関させる方法を研究者に提供する。しかし、石灰化した生体材料の試料を調製するための、明確に定義された標準的な手順は現在使用できません。本研究では、空間相関化学的、構造的、およびA.多層のスケールの機械的特性をプロービングするための方法ヘラナノインデンテーションを使用して、とのFTIR、SEM、エンERGY分散型X線（EDX）微量分析、およびX線CTを提示する。

図3は 、約800ミクロン、長、短軸横断断面にわたって実施し、空間的に相関nanoinidentation / SEM / EDX分析の平均結果を示す。約60μmの厚さの硬鱗質層では、ナノインデンターは69.0 GPaで3.3 GPaでの硬さの平均弾性率を算出した。ナノインデンターは、約740ミクロ​​ンの厚さの骨の層のための0.5 GPaの14.3 GPaで、硬度の平均率を決定した。 EDXは、典型的には、鉱化スケールに見出される炭素、酸素、カルシウムおよびリンを、決定した。しかし、硬鱗質と骨の層は、化学組成物中の定量化の違いを含んでいた。骨層において観察されたカーボンスパイクはまた、BSE画像全体の明るさで観察された減少を引き起こした炭素のわずかな増加をもたらすものなどの高度に石灰化した領域ではないことに起因し得る。具体的には、硬鱗質層 &#39;、Sは、Caの原子濃度比の平均：1.71のPが1.67の理論比でハイドロキシアパタイトと同様に見えた。骨層の平均のCa：P比は硬鱗質層からの石灰化の量の減少を示す1.51に減少した。 骨層及び硬鱗質層用の図4のFTIRスペクトルは、アミド、カルボン酸、リン酸、及びカルボニルなどの主要な官能基を同定した。具体的には、FTIRは、内側（骨）の層に外側（硬鱗質）層とコラーゲンの署名にハイドロキシアパタイト署名の目視観察を確認した。 3,500-3,000 cm -1に起因する1550〜1,500 cm -1の間のNH伸縮及びNHで曲げのピークは骨の層にアミド基を表す。波数1,470-1,365センチの領域におけるピーク-1のアミド置換アルキル基を表す。さらに、1641センチメートルで延伸独特のC = Oは-1骨層上に観察された。エンドウ3,000-2,500センチ-1からKSはカルボキシル基を表す。骨と硬鱗質両層&#39;スペクトルは1,079.33 CM -1リン酸を延伸することを示すに近い独特のピークを作り出した。 図5のX線CT画像は硬鱗質層はスケールが互いに重なり合う骨層を覆っていないことを捕捉する。濃い灰色の骨層が低密度の少ない硬いのフェーズを示しながら、明るいグレー硬鱗質層は、より密難しく、そして堅い段階を示している。また、X線CT画像は硬鱗質層の厚さの不均一性を識別するのに助け。実際には、明確なピットは全く骨の層をカバーしていない硬鱗質層の中心部に近い観測される。 H 3 PO 4でエッチング破断面図6AのSEM画像は、硬鱗質層用積層パターンで組織化ナノ構造を明らかにした。このナノロッド組織化構造は硬鱗質領域に対してFTIRから得たハイドロキシアパタイトの署名と相関する。 図6Aは、明確に破線で硬鱗質と骨の層の間の遷移を識別する破断面の典型的な低倍率のSEM顕微鏡写真を示す。 図6Bは、H 3 PO 4を用いたエッチング後の破断面の高倍率SEM像を描いている。繊維状ナノ構造は、骨層において観察されている間エッチング後、外側硬鱗質層における配向ナノロッドは明確に識別可能である。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3.jpg" /> 図3モジュラスおよび硬度データをSEM / EDXの化学組成に空間相関ナノインデンテーションする。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4.jpg" /> 図4。層（骨の）（硬鱗質）、外側と内側から収集されたFTIRスペクトル。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5.jpg" /> 図5の外側（硬鱗質）上のピッチングを示した。X線CT画像は、内側（骨の）層を覆う層を形成する。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6.jpg" /> 図6の典型的な破断面の（A）低倍率のSEM像、（B）は、外側（硬鱗質）中のナノロッドの高倍率の画像と内側の（bにおける繊維ONY）の層が.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

本稿では、空間相関化学的、構造的、およびナノインデンテーションを用いAtractosteusへらの多層スケール（A.ヘラ ）の機械的特性をプロービングするために使用される方法を提示し、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、走査電子顕微鏡（SEM）およびX-線が断層撮影（X線CT）を計算しました。実験結果は、保護生物学的材料の設計原理を調査するために使用されてきた。

多層魚の鱗の特性（<em&gt; Atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

characterization-multi-layered-fish-scales-atractosteus-spatula-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

15.1K ビュー.  U.S. Army Engineer Research and Development Center. 本稿では、空間相関化学的、構造的、およびナノインデンテーションを用いAtractosteusへらの多層スケール（A.ヘラ ）の機械的特性をプロービングするために使用される方法を提示し、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、走査電子顕微鏡（SEM）およびX-線が断層撮影（X線CT）を計算しました。実験結果は、保護生物学的材料の設計原理を調査す?...

ビデオ: Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

生物工学

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique where X-rays are elastically scattered by an inhomogeneous sample in the nm-range at small angles (typically 0.1 - 5&deg;) and wide angles (typically &gt; 5&deg;). This technique provides information about the shape, size, and distribution of macromolecules, characteristic distances of partially ordered materials, pore sizes, and surface-to-volume ratio. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) is capable of delivering structural information of macromolecules between 1 and 200 nm, whereas Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) can resolve even smaller Bragg spacing of samples between 0.33 nm and 0.49 nm based on the specific system setup and detector. The spacing is determined from Bragg's law and is dependent on the wavelength and incident angle.
In a SWAXS experiment, the materials can be solid or liquid and may contain solid, liquid or gaseous domains (so-called particles) of the same or another material in any combination. SWAXS applications are very broad and include colloids of all types: metals, composites, cement, oil, polymers, plastics, proteins, foods, and pharmaceuticals. For solid samples, the thickness is limited to approximately 5 mm.
Usage of a lab-based SWAXS instrument is detailed in this paper. With the available software (e.g., GNOM-ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg and EasySWAXS software) for the SWAXS system, an experiment can be conducted to determine certain parameters of interest for the given sample. One example of a biological macromolecule experiment is the analysis of 2 wt% lysozyme in a water-based aqueous buffer which can be chosen and prepared through numerous methods. The preparation of the sample follows the guidelines below in the Preparation of the Sample section. Through SWAXS experimentation, important structural parameters of lysozyme, e.g. the radius of gyration, can be analyzed.

The demonstration of the small and wide angle X-ray scattering (SWAXS) procedure has become instrumental in the study of biological macromolecules. Through the use of the instrumentation and procedures of specific angle methods and preparation, the experimental data from the SWAXS displays the atomic and nano-scale characterization of macromolecules.

溶液中の生体高分子の小型·広角X線散乱による研究

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should mimic the human tissues they are aiming to replace; to provide the required anatomical shape, the materials must be able to sustain the mechanical forces they will experience when implanted at the defect site. Although the mechanical properties of tissue-engineered scaffolds are of great importance, many human tissues that undergo restoration with engineered materials have not been fully biomechanically characterized. Several compressive and tensile protocols are reported for evaluating materials, but with large variability it is difficult to compare results between studies. Further complicating the studies is the often destructive nature of mechanical testing. Whilst an understanding of tissue failure is important, it is also important to have knowledge of the elastic and viscoelastic properties under more physiological loading conditions.
This report aims to provide a minimally destructive protocol to evaluate the compressive and tensile properties of human soft tissues. As examples of this technique, the tensile testing of skin and the compressive testing of cartilage are described. These protocols can also be directly applied to synthetic materials to ensure that the mechanical properties are similar to the native tissue. Protocols to assess the mechanical properties of human native tissue will allow a benchmark by which to create suitable tissue-engineered substitutes.

Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.

インデントと引張試験を用いたヒト軟部組織の生体力学的特性評価

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate structures&#160;while processing and histological observation provide limited information through cross-sectional imaging. Micro X-ray computed tomography (microCT) is an effective tool for obtaining three-dimensional information without damaging specimens. However, it shows limited efficiency in differentiating soft tissue parts. Use of contrast-enhancing agents, like phosphotungstic acid (PTA), can solve this problem by improving soft tissue contrast. We implemented microCT with PTA to investigate the human orbicularis retaining ligament (ORL), which is a delicate structure in the orbit area. In this method, harvested specimens are fixed in formalin, dehydrated in serial ethanol solutions, and stained with a PTA solution. After staining, microCT scanning, 3D reconstruction, and analysis are performed. Skin, ligaments, and muscles can be clearly visualized using this method. The specimen size and duration of staining are essential features of the method. The suitable specimen thickness was about 5&#8211;7 mm, above which the process was slowed, and the optimum duration was 5&#8211;7 days, below which an empty hole in the central area occasionally occurred. To maintain the location and direction of small pieces during cutting, sewing on the same region of each part is recommended. Furthermore, preliminary analyses of the anatomical structure are needed to correctly identify each piece. Parafilm can be used to prevent drying, but care should be taken to prevent specimen distortion. Our multidirectional observation showed that the ORL is composed of a multilayered meshwork of continuous plates, rather than thread-like fibers, as reported previously. These results suggest that microCT scanning with PTA is useful for examining specific compartments within complex structures of human tissue. It may be helpful in the analyses of cancer tissues, nerve tissues, and various organs, like the heart and liver.

Micro X-ray computed tomography is effective in obtaining three-dimensional information from undamaged human specimens but has limited success in observing soft tissues. The use of phosphotungstic acid contrast agent can resolve this issue. We implemented this contrast agent to examine human delicate fibromuscular tissues (the orbicularis retaining ligament).

ヒト線維筋組織を可視化するホスホトン酸調製のマイクロX線コンピュータ断層撮影の使用

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

シーケンシャル3D-3D登録を用いた4次元CT解析

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described protocol is easy to apply, fast and suitable for larger soft-tissue samples. The presented methodology enables the characterization of crucial tissue structures in three dimensions and is demonstrated on a whole mouse kidney. The multiscale approach allows to image the entire mouse kidney and supports the selection of further volumes of interest, which are acquired with higher resolutions ranging into the nanometer range. Thereby, soft-tissue morphology with a similar detail level as the corresponding histological light microscopy images is reproduced. Deeper insights into the 3D configuration of tissue structures are achieved without impeding further investigations through histological methods.

A protocol for 3D visualization of microscopic tissue structures by using an X-ray specific staining method designed for X-ray computed tomography is presented.

X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

超音波による患者特異的ポリビニルアルコールファントム作製法とX線コントラストによる脳腫瘍手術計画

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

ソフトマターナノインデンテーションの実験・データ解析ワークフロー

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Viscoelastic Characterization of Soft Tissue-Mimicking Gelatin Phantoms using Indentation and Magnetic Resonance Elastography

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the biomechanics-related mechanisms of disease, injury, and development. The mechanical testing method is the most straightforward way for tissue characterization and is considered as verification for in vivo measurement. Among the many ex vivo mechanical testing techniques, the indentation test provides a reliable way, especially for samples that are small, hard to fix, and viscoelastic such as brain tissue. Magnetic resonance elastography (MRE) is a clinically used method to measure the biomechanical properties of soft tissues. Based on shear wave propagation in soft tissues recorded using MRE, viscoelastic properties of soft tissues can be estimated in vivo based on wave equation. Here, the viscoelastic properties of gelatin phantoms with two different concentrations were measured by MRE and indentation. The protocols of phantom fabrication, testing, and modulus estimation have been presented.

This article presents a demonstration and summary of protocols of making gelatin phantoms that mimic soft tissues, and the corresponding viscoelastic characterization using indentation and magnetic resonance elastography.