マイクロCTは、形態の多様性のために海洋無脊椎動物に広く適用されていません。我々の方法は形態に適したあらゆる角度でサンプルの容易な土台を可能にする。水、粘土、チューブなどの一般的な材料で、また、適用可能であれば、長いワームから丸いボールまで、さまざまな形状のサンプルに対して実行できます。
この手順のデモンストレーションは、国立遺伝学研究所の技術者、前野明照です。まず、250ミリリットルの円錐フラスコに100ミリリットルの蒸留水に500ミリグラムのアガロースを溶解して0.5%アガロースを調製し、フラスコを電子レンジに800ワットの電力で入れ、約1〜3分間加熱します。フラスコを室温で冷やします。
A.馬などの1000マイクロピペットブルーチップに収まらない大きなサンプルを取り付けるには、まず蒸留水で60ミリメートル皿に染色サンプルを置き、表面から過度の染色液を洗い流します。50ミリリットルのチューブで、泡を作らずに0.5%アガロースの5ミリリットルを静かに注ぎます。氷の上にチューブを置き、アガロースを硬化させます。
その後、チューブに0.5%アガロースの20ミリリットルを加え、アガロースが硬化し始めるまで氷の上に置き、鉗子を使用してアガロース内に標本を配置します。体の軸が垂直になるように、標本の位置を調整します。氷の上でアガロースを固くする。
マイクロCT実装段階に粘土を置き、粘土の上に50ミリリットルのチューブを置きます。ハーモト・スやX.japonicaなどの1000マイクロピペットブルーチップに収まる小さなサンプルを取り付けるには、フォースを使わずに染色したサンプルを60ミリメートルの皿にデカントします。
リングピンセットで、蒸留水で満たされた別の60ミリメートル皿にサンプルを静かに移し、表面から過度の染色液を洗い流します。次に、0.5%のアガロースの100マイクロリットルを1000マイクロピペットブルーチップに引き上げ、氷の上に置いて硬化させます。ハルモトエspを取り扱う場合。
先端のアガロースプラグに0.5%アガロースの1000マイクロリットルを加えます。リングピンセットを使用して、60ミリメートル皿から先端のアガロース溶液にHarmothoe sp.を穏やかに移します。
ペチオレート針または精密ピンセットで、チャエタエが不自然に曲がらないように、ハルモトエsp.の位置と向きを調整します。気泡がないことを確認し、氷の上に先端を置いてアガロースを硬化させます。
X.japonicaのような壊れやすいサンプルを扱う場合は、マイクロピペットを使用して、硬化したアガロースプラグで1000マイクロリットルの蒸留水を青い先端に加えます。X.Japonicaを蒸留水に入れ、先端の壁の間で安定するようにします。より小さいサンプルのために、200マイクロリットルのマイクロピペット黄色の先端を使用することができる。
この場合、プラグにアガロースを30マイクロリットル使用し、200マイクロリットルのアガロースまたは蒸留水を加えます。次に、新しい1000マイクロピペットブルーチップの先端を切り落とし、差し込まれたチップの先端を新しいチップに挿入します。microCT実装ステージに粘土を置き、粘土の中にサンプルを入れて先端を設定します。
サンプルを取り付けた後すぐに、80キロボルトと100マイクロアンペアでX線ビームをオンにします。X線透過画像を観察しながら、x軸とZ軸ボタンをクリックし、取り付けステージでy軸ノブを手動で調整してサンプル全体を見ることができるようにステージを動かします。内部構造が観察されるように画像のコントラスト条件を調整します。
粘土のチューブの角度を変更してサンプルの方向を調整します。回転軸を 90 に設定し、[相対移動]ボタンをクリックして、ステージを 90 度回転します。同じ操縦を4回実行して、完全な回転を完了します。
サンプルドアが開くたびに、システムが自動的にオフに切り替わらなければ、X線ビームを手動でオフにします。Z軸ボタンをクリックし、手動でY軸ノブを調整して、サンプルがビューの中心になるように取り付けステージを移動します。ステージを90度回転させ、サンプルを再び中心に調整します。
ステージを 90 度さらに 3 回回し、必要に応じて調整して、サンプルがすべての方向からビューの中心に位置するようにします。次に、X 軸ボタンをクリックして、X 線のソースに沿ってステージを移動してサンプルを拡大し、必要に応じて調整してビューに収まるようにします。ステージを回し、必要に応じて調整して、サンプルがすべての方向からビュー内に収まるようにします。
スキャン条件を調整してからスキャンを開始します。この実験では、25%ルゴル溶液で染色した後、アクチニア・エキナ、ハルモトエsp、ゼヌートゥベラ・ジャポニカにマイクロCTイメージングを行った。
染色は、すべての標本の内部構造のコントラストをうまく高め、内部軟組織の観察を可能にしました。この方法は、ひどく損傷した表皮を有するX.japonica標本から見ることができるように、外部損傷を有しても壊れやすい標本に適用可能である。ハーモトエspのために標本全体の単一の高解像度データセットを再構築しました。
そして、標本の異なるが重なり合う部分で行われた複数のスキャンからのX.japonica。サンプルをチューブまたはチップにセットし、チューブまたはチップをmicroCTに取り付けて、スキャン中に移動しないようにしてください。この手順から得られたデータは、3D画像の再構築に使用することができ、研究者はサンプルの内部および外部の両方の形態を完全に理解することができます。
マイクロCTシステムは全てX線を使用しますが、仕様はシステムごとに異なる場合がありますので、各システムの指示に厳密に従ってください。
