このプロトコルは、市販のナノインデンターを使用してヒドロゲルと細胞の剛性を測定するためのステップバイステップガイドを示し、取得したデータを再現的に分析するためのオープンソースソフトウェアも提供します。しかし、このプロトコルにより、原子間力顕微鏡のようなデータを数分の一の複雑さで取得できます。したがって、このプロトコルは、健康なサンプルと病気のサンプルの機械的特性の研究に関心のある科学者にとって有用ですが、ソフトマテリアルのナノインデンテーションのコンテキストでより広く適用できると考えています。
装置の電源を入れ、実験用に選択したプローブを取り付けたら、プローブのキャリブレーションを開始します。ソフトウェアのメインウィンドウで[初期化]をクリックします。表示されるキャリブレーションメニューで、入力ボックスにプローブの詳細を入力します。
次に、底が平らな厚いガラスのペトリ皿にサンプル皿と同じ培地を満たし、培地の温度をサンプルの温度と一致させます。次に、キャリブレーション皿をプローブの下に置きます。液体中での校正の場合は、ピペットの端をガラスフェルールに軽く接触させた状態で、プローブを70%エタノールまたはイソプロパノールの液滴で事前に濡らし、液滴がカンチレバーと球形の先端上を滑るようにします。
次に、プローブが完全に水没するまでナノインデンターのアームを手動で下にスライドさせますが、それでもペトリ皿の底から遠く離れています。液体中で平衡状態に達するまで5分間待ちます。次に、ソフトウェアの初期化メニューで、[波長のスキャン]をクリックします。
干渉計の画面にプログレスバーが表示されます。干渉計ボックスの波長スキャンパネルに移動して、光学スキャンが成功したかどうかを確認します。次に、[初期化]メニューで[サーフェスの検索]をクリックして、プローブを徐々に下げます。
プローブは、ガラスのペトリ皿に接触すると動きを停止します。プローブが表面に接触したら、メインソフトウェアウィンドウのy下向き矢印ボタンを使用してプローブを1マイクロメートル下に移動します。ライブウィンドウの緑色の信号を観察して、各1マイクロメートルステップでのベースラインの変化を確認します。
次に、[初期化]メニューから[キャリブレーション]をクリックします。キャリブレーションが完了したら、表示されるポップアップウィンドウで新旧のキャリブレーション係数を確認します。原稿で説明されているように、新しいキャリブレーション係数が正しい範囲内にある場合は、[新しい係数を使用]をクリックします。
次に、ピエゾを500マイクロメートル上に移動します。次に、干渉計デスクトップの[復調]タブに移動して、復調円が正しく調整されているかどうかを確認します。光学テーブルまたはナノインデンターを軽くたたいて、十分なノイズを誘発します。
不連続データポイントの白い円は、赤い円をほぼ覆う必要があります。サンプルが入ったペトリ皿を顕微鏡ステージにセットし、ナノインデンターのプローブをサンプルの上の目的の位置に手動で移動します。プローブとサンプルの表面の間に1〜2ミリメートル離すように注意しながら、プローブを溶液中にスライドさせます。
プローブが溶液中で平衡化するまで5分間待ちます。光学顕微鏡でプローブに焦点を合わせます。軟質材料のヤング率を測定するには、[実験の構成]をクリックします。
変位制御に[サーフェス検索]ステップと 1 つのくぼみを追加して、後で自動マトリックス スキャンに使用する実験パラメータを決定します。単一のインデントが成功した場合は、10〜100マイクロメートルの間隔で50〜100ポイントを含むマトリックススキャンを構成します。[サーフェスの自動検索]ボックスにチェックマークが付いていることを確認したら、[ステージ位置を使用]をクリックして、現在のステージ位置からマトリックススキャンを開始します。
変位制御でマトリックススキャンプロファイルを設定します。セグメントの数は 5 のままにして、デフォルトの変位プロファイルを使用します。必要に応じて、傾斜した各セグメントの変位プロファイルと時間を変更します。
毎秒10マイクロメートルを超えるひずみ速度を超えないようにしてください。構成した実験を目的の実験パスに保存します。[実験を実行]をクリックし、完了するのを待ちます。
すべてのデータが取得されたら、プローブを清掃し、本文の説明に従って機器の電源を切ります。力-変位曲線のスクリーニングとJSON形式のクリーニングされたデータセットの作成については、prepareを起動します。ラボ コンピューターのコマンド ラインから py を実行します。
ドロップダウン リストから Optics11 データ形式を選択します。データが正しくロードされていない場合は、グラフィカル ユーザー インターフェイスを再起動し、[Optics11 Old] を選択します。次に、[フォルダーの読み込み] をクリックし、分析するデータを含むフォルダーを選択します。
グラフィカル・ユーザー・インターフェースの右側にあるタブを使用して、データ・セットをクリーンアップします。次に、[JSON の保存] をクリックし、クリーニングされたデータ セットの適切な名前を入力します。現在のコンピューターと異なる場合は、NanoAnalysis ソフトウェアがインストールされているコンピューターに JSON ファイルを送信します。
ナノを起動します。コマンドラインからpyファイルを作成します。グラフィカル ユーザー インターフェイスの左上にある [実験の読み込み] をクリックし、JSON ファイルを選択します。
これにより、ファイルリストと、力-変位曲線の観点からデータセットを示す生の曲線グラフが入力されます。[統計] ボックスで、3 つのパラメーター (アクティブ化された N、失敗した N 、および除外された N の値) を確認します。特定の曲線をより詳細に視覚化するには、曲線をクリックします。
これにより、緑色で強調表示され、現在の曲線グラフに表示されます。1つのカーブを選択すると、Rとkのパラメータが統計ボックスに入力されます。データセットをさらにクリーンアップしたら、[フィルタリング]ボックスに実装されているフィルターを使用して、曲線内のノイズをフィルタリングします。
次に、現在の曲線グラフでフィルタリングされた曲線を調べます。フィルタリングされた曲線は黒で表示され、フィルタリングされていないバージョンは緑で表示されます。接触点を見つけるには、[接触点]ボックスから、ソフトウェアに実装されている一連の数値手順のいずれかを選択します。
原稿で説明されているように、接触点が正しく配置されるように、データセットに合わせてアルゴリズムのパラメータを調整します。接触点が 1 つのカーブ上のどこにあるかを表示するには、カーブをクリックして選択します。次に、[検査] をクリックします。
表示されるポップアップウィンドウをチェックして、接点が配置されている場所を特定します。次に、ヘルツ分析をクリックします。これにより、3つのグラフが生成されます。
データセット内の各曲線の力のインデントデータと、赤で示されている平均ヘルツフィットを確認します。次に、1標準偏差を示す誤差バンドを持つ平均力押し込み曲線と、赤で示されている平均ヘルツフィットを確認します。次に、ヘルツモデルを個々の曲線に当てはめることから生じるヤング率の散布図を確認します。
計算された平均ヤング率とその標準偏差について結果ボックスを調べ、それらが特定の実験に対して妥当であることを確認します。次に、[保存] ボックスで [Hertz] をクリックします。ポップアップウィンドウで、ファイル名とディレクトリを入力し、[保存]をクリックします。
tsv ファイルが作成されます。統計分析とさらなるプロットのために、追加のソフトウェアでtsvファイルを開きます。細胞ナノインデンテーションデータについては、弾性スペクトル分析をクリックしてください。
生成された2つのプロット、すなわち、各曲線のくぼみの深さの関数としてのヤング率と、二層モデルによって適合された押し込みの関数としての平均ヤング率を調べます。分析が終了したら、[保存] ボックスの [ES] をクリックします。これにより、指定したディレクトリにtsvファイルがエクスポートされ、他の任意のソフトウェアで開いてプロットできます。
実験が成功すると、力-変位曲線のアプローチセグメントが得られ、明確で平坦な基線、遷移領域、および傾斜領域があります。この形状からの変化を示す曲線は、NanoPrepareを使用してデータセットから簡単に削除できます。ここでは、軟質ポリアクリルアミドヒドロゲルと硬いヒドロゲルの平均力-押し込み曲線と平均ヘルツモデルを示します。
ヤング率の個々の値をプロットすることによって、両方のヒドロゲルについて予想される平均ヤング率を検索した。細胞ナノインデンテーション実験の場合、平均力-圧痕曲線と対応する平均ヘルツモデルは、ヘルツモデルが細胞ナノインデンテーション実験の押し込み深さの増加に伴う力の進化を完全には捉えていないことを示しています。ここでは、200ナノメートルのくぼみまで適合した平均弾性スペクトルを示します。
平均弾性スペクトルは、200ナノメートルのくぼみの深さで増加し始め、プローブされた見かけのヤング率に対する基板の寄与を示しています。このため、ヘルツモデルと二層モデルの両方のフィッティング範囲として200ナノメートルが選択されました。二分子膜モデルを当てはめると、本文で説明されているように、細胞のアクチン皮質の厚さ、細胞のアクチン皮質弾性率、細胞の体積弾性率など、細胞の機械的状態に関するより多くの情報を抽出できます。
ヤング率分布の観点からヘルツモデルと弾性スペクトルアプローチを直接比較すると、同等の平均で重複する分布が明らかになり、弾性スペクトルアプローチの実現可能性が実証されます。接触点を正確に特定し、比較したいデータセット間で選択したアルゴリズムパラメータの一貫性を維持することは、サンプル間の信頼できる比較を得るために最も重要です。この方法は、スフェロイド、オルガノイド、組織、および一般にすべてのソフトマターを含む生物学的サンプルの局所弾性特性を定量化するための一般的な適用性です。
