この作品は、財政的に化学設計（NRSC-触媒反応）によって制御オランダの国立研究学校コンビネーション、触媒反応から研究助成金によってサポートされていました。ライデン大学から博士HY Steensma博士とGPHバンフースデンは、Sの組換え発現との支援のために認められている出芽酵母 Nar1。

セットアップとソリューションの作製<ol><li> 100mMトリス、250mMのNaClおよびpH8.5の10％グリセロールを含む緩衝溶液を調製する。アルゴンでフラッシュすることによりバッファを脱気。嫌気性チャンバー内にバッファを導入する。 </li><li> 2回に分けてバッファを分割します。一部分（緩衝液A）に1mMのDL-ジチオスレイトール（DTT、Mは、154.25グラム/モルrを）および1mMのL-システインを加える。他の部分（バッファーB）は、還元剤が含まれていない。 </li><li>酸化剤と還元剤溶液を調製する。 1ミリリットルの2の溶液20、および200mMのフェリシアン化カリウムを加える（FIC、Mは、329.26グラム/モルrを）および嫌気性緩衝液B中の亜ジチオン酸ナトリウム（SD、Mは、174.11グラム/モルrの ）の</li><li>次のようにメディエーターミックスを調製する： <ol><li> Bバッファするために、以下のレドックスメディエーターおよび50mMのNaClの各160μMの追加：N、N、N &#39;、N&#39; -テトラメチル-p-フェニphenylendediamine（TMPD、Mは、237.17グラム/モルrは 、E &#39;0 0.276 V） 、2,6-ジクロロフェノールインドフェノールメチレンブルー（M rは 319.85グラム/モル、E &#39;、&#39;フェナジンエトサルフェート（PES、Mは、334.4グラム/モル、E rは 、（0 0.217 V 0 0.055 V）DCIP、Mは、290.08グラム/モル、E rを&#39;）を0 0.011 V）、レゾルフィン（M rは 235.17グラム/モル、E &#39;0 -0.051 V）、Indigodisulphonate（M rは 466.35グラム/モル、E&#39; 0 -0.125 V）、2-ヒドロキシ-1,4- naphtaquinone（ M rは 174.15グラム/モル、E &#39;0 -0.145 V）、アントラキノン-2-スルホン酸（M rは 328.28グラム/モル、E&#39; 0 -0.225 V）、フェノサフラニン（M rは 322.8グラム/モル、E &#39;0 -0.252 V）、サフラニンO（M rは 350.84グラム/モル、E &#39;0 -0.280 V）、ニュートラルレッド（M rは 288.8グラム/モル、E&#39; 0 -0.340 V）、ベンジルビオロゲン（M rは 409.4グラム/モル、E &#39;0 -0.350 Vの）、およびメチルビオロゲン（M rは 257.16グラム/モル、E&#39; 0 -0.440 V）。 </li><li>仲介者を保護するためにアルミホイルで瓶をラップ光からS。 </li></ol></li><li>準備10mg / mlのS. cerevisiaeの StrepタグNar1タンパク質バッファーAエクスプレスSに（181μM、Mは55.2 kDaのR） E.で出芽酵母 Nar1のpET24a発現ベクターを用いて、連鎖球菌タグ化タンパク質として大腸菌 。のStrep-Tactinのクロマトグラフィー媒体（IBA）を用いて、嫌気性チャンバー内のタンパク質を精製などのAkta精製装置（GE Healthcare社）のようなタンパク質精製システムを用いて精製する。 </li><li>次のように嫌気性チャンバー内酸化還元滴定のセットアップを準備します。 <ol><li> Ag / AgCl参照電極および白金線電極を滴定容器に接続する。 V.までmVのから測定することができます電圧計に両電極を接続します</li><li>小さな撹拌棒を挿入します。 </li><li>マグネチックスターラー上記滴定容器を置きます。 </li><li> すなわち、72μMタンパク質および各38μMの最終濃度までバッファーB、最大2 mlのメディエーター混合溶液及びタンパク質溶液で滴定容器に充填仲介者。注：タンパク質濃度に依存して、必要なメディエーター三つの溶液の量が調整されるべきである濃度。 </li><li> 30分間攪拌し、電圧計のスイッチを入れる。 </li></ol></li><li> 10清潔な石英ガラスEPR管を準備します。嫌気性チャンバー内チューブを導入する。 </li><li>液体窒素で（200ミリリットル年頃 ）小型の液体窒素デュワーを埋める。 </li></ol> 2.レドックス滴定を行います<ol><li>ソリューションの電位が安定するまで待ちます。注：実際には、これは、潜在的には毎分1mV未満漂うことを意味する。 </li><li>電圧計によって与えられた可能性を書き留め。 </li><li> 200μlのの最初のサンプルを描画し、EPR管に注入する。 </li><li>ゴム栓でチューブをキャップと嫌気性チャンバーからチューブを取り外します。 </li><li>注意：以下のように液体窒素中でチューブを凍結！これは、ゆっくりと行う必要があり、そうでなければ、チューブが破損します。 <ol><li>まずTを挿入液体窒素中でチューブのIP。 </li><li>シューという音が聞こえるまで待ってください。注：これは10秒ほどかかる場合があります。 </li><li>サンプル部品が完全に浸漬されるように、ゆっくりとチューブの残りの部分を挿入します。 </li></ol></li><li> -0.6 Vにソリューションの可能性を下げるために滴定容器内の溶液に2 mMのSD液の​​小アリコート1-2μLを追加 注：複数の10μlを添加しなければならない場合、20 mM溶液に切り替える。それは、特定の潜在的な値にポイズのは非常に困難であるように、電圧計に記録された実際の値は切下げと滴定曲線を構築するために使用される。 </li><li>ステップ2.3から2.5で説明したようにサンプルを描画します。 </li><li>電圧計によって与えられた実際の電位を下に注意してください。 </li><li>ポテンシャルは約 50 mVに増加しているまで、酸化剤を追加します。 2 mMのFICソリューションの小アリコート1-2μLを追加することで起動します。以上の10μlを添加しなければならない場合、20 mM溶液に切り替える。 </li><li> HOを下に注意してくださいワットソリューションの多くが追加されました。注：これは、滴定中のサンプルの希釈を補正する必要がある。 </li><li>ステップ2.3から2.5で説明したようにサンプルを描画します。 </li><li>電圧計によって与えられた実際の電位を下に注意してください。 </li><li>繰り返しますが、-0.6 Vから0.2 Vへの潜在的な範囲まで、2.9と2.12ステップがカバーされており、全10 EPR管は200μlの各充填される。 注：すべての撤退と体積が減少すると、電極の位置を調整する必要が攪拌の干渉なしに溶液との良好な接触を有することができる。これは、最後のサンプルの回収後に電位を測定することは困難であるので、そのサンプルの電位はあまり正確であってもよい。 </li><li> EPR測定が行われることができるまで、必要に応じて、液体窒素中で凍結したEPRのサンプルを格納。 </li></ol> EPR分光法およびデータ解析を使用して3.メジャー滴定サンプル<ol><li>異なるの記録EPRスペクトル滴定のサンプル次のように： <ol><li> &lt;10 -5バーに石英クライオスタットを排気する高真空ポンプを使用してください。 </li><li> EPRマグネットの水冷に切り替えます。 EPRの空洞を通して乾燥空気の流れを開きます。 </li><li>磁石への電源供給とEPRのコンピューターのスイッチをオンにします。 </li><li>周波数較正プログラムを実行します。 EPR測定パラメータを設定します。液体ヘリウムデュワーにクライオスタットを接続します。 9-16 Kに空洞を観る</li><li>キャビティ内のEPRサンプルを紹介します。 EPRスペクトルを記録します。 </li></ol></li><li>別のEPR種を同定し、シグナルを定量化するために最善のスペクトルを使用しています。スペクトルと外部銅標準溶液を10mMのCuSO 4月 10日mMの塩酸/ 2 MのNaClO 4のスペクトルとの比較の二重積分によりEPRの定量化を実現。8 </li><li>次のように滴定曲線を行います。 <ol><li>パラに特徴的なg値でEPR信号振幅をプロット潜在に対する関心の磁気種。 </li><li>ステップ3.2からEPR定量を用いてスピン/分子スケールにEPR信号振幅スケールを変更する。 </li><li>酸化または還元剤の添加により発生した希釈のため、各サンプルの信号振幅を補正する。 </li><li> Ag / AgCl参照電極の中間電位の可能性を修正する。 注：（飽和KClを含む）、Ag / AgCl参照電極は、25℃における標準水素電極（SHE）に対して0.194 Vの中点電位を有する。電圧計の電位が-0.6 V 年頃読み込みしたがって、彼女を参照して、可能性は-0.4 Vです。 </li></ol></li><li>次のようにネルンストの式に信号を合わせる： 還元状態で常磁性である種の場合： <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> Oで常磁性である種のためにxidized状態： <img alt="式2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> 中間状態で常磁性である種の場合： <img alt="式3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> これらの式は、一つの電子が転送されるレドックス反応のために有効であるので、n = 1である。 ボルトでE =潜在的な ボルトでのE、M =中間電位 F =ファラデー定数= 96480 C·モル-1 R =気体定数= 8.314 J·K -1·モル-1 Tケルビンで=温度</li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

13レドックスメディエーターのシリーズは-0.45からSHEに対して0.3 V（ 表1および図3）の範囲内の溶液中での酸化還元平衡を可能にする。さて上およびこれらの電位以下のすべてのメディエーターは、どちらか完全に還元または完全に酸化、したがって、タンパク質の酸化還元活性中心との更なる平衡化が発生しないことができている。時々還元滴定は、狭い範囲11?...

それはこの惑星、光合成、窒素固定と呼吸に生命を維持する最も基本的な化学プロセスは、有機および無機の酸化還元補因子の広い範囲を含む大きなタンパク質複合体によって触媒されることに顕著である。これは、全てのタンパク質の約30％が1つまたは複数の金属補因子を含んでいると推定されている。1,2は 、酸化還元補因子を直接電気化学（ 例えば 、タンパク質フィルムボルタンメトリー）または酸化還元滴定を使用して確立することができる識別し特徴付ける。 2の技術は、その性質や適用性で相補的である。ボルタンメトリーは電極表面と反応することができるの中点電位および補因子の電子移動速度の速い決定を提供しています。3,4は通常、このようなシトクロムcまたはフェレドキシンなどの電子伝達タンパク質、に適しています。そして、それは時々、電極表面に固定化されたより複雑なタンパク質のために働く。の詳細な知識タンパク質における補因子の性質は、ボルタングラムは、補因子のアイデンティティ上の任意の直接的な情報を与えることはありませんように、利用可能でなければならない。レドックス滴定は、タンパク質のmgの量を実行し、必要とする方が面倒である。しかしながら、それらは中間電位と補因子のアイデンティティに関する情報を提供する。 図5は、さらに、単一の滴定にタンパク質内の複数の補因子を監視することができる。 酸化還元滴定の原理は、レドックス活性タンパク質または酵素は、化学的に還元または酸化されることである。補因子は、還元剤または酸化剤の酸化還元メディエーターが使用されていると反応していることを確認するために。溶液の電位を測定することができるように、これらの酸化還元メディエーターは、電極と反応する。メディエーターは、酸化還元緩衝剤として作用し、蛋白質と電極における補因子との間で平衡化する。 AW化学的に所望の値に電位をpoisingした後、サンプルが引き出されるとすぐに液体窒素中で凍結させ分光技術とのさらなる分析をAIT。 EPR分光法は、それを定量的に常磁性金属中心または有機基を測定するために使用することができるように、この点で特に有用である。 酸化還元滴定は、二方向に実行することができます：ローからハイに、またはハイからロー中間電位に。選択は、研究対象の補因子の安定性に依存している。多くの場合、低電位で開始し、可能性を高める段階的に酸化剤を追加することが賢明です。これは、酸化滴定と呼ばれ、ここで説明されている。ここでは、 出芽酵母由来のタンパク質Nar1を含む鉄-硫黄クラスターの酸化還元滴定を示した。このタンパク質は、細胞質の鉄硫黄クラスター生合成機構（CIA経路）において、足場タンパク質として、可能性が関与している。6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

電子常磁性共鳴（EPR）は、酸化還元滴定は、強力な方法は、タンパク質中の補因子の中点電位を決定し、それらの検出可能なレドックス状態に補因子を同定および定量するために監視されている。 それは電子伝達率に関する情報を提供していませんが、検討中のタンパク質に補因子のアイデンティティと酸化還元状態を確立しないような技術は、直接電気化学（ボルタンメトリー）のアプローチ、と相補的である。技術は、電子常磁性共鳴（EPR）検出可能な補因子を含有する任意のタンパク質に広く適用可能である。 典型的な滴定は1〜100μMの範囲の補因子の濃度が2ミリリットルのタンパク質が必要です。タンパク質は、特定の電位における試料ポイズのために、化学的還元剤（亜ジチオン酸ナトリウム）または酸化剤（フェリシアン化カリウム）で滴定する。白金線及びAg / AgCl参照電極をボルトに接続されている。タンパク質溶液の電位を測定するための計器。 13の異なるレドックスメディエーターのセットは、タンパク質の酸化還元補因子と電極との間に平衡化するために使用される。試料タンパク質の異なる酸化還元補因子に特徴的な、異なる電位および電子常磁性共鳴スペクトルで描かれているが、測定される。試料電位に対する信号強度のプロットは、補因子の中点電位を決定するために、ネルンストの式を使用して分析される。

Nar1：[3FE-4S]クラスター、[4FE-4S]クラスター及び単核鉄センター（ 図1） サッカロマイセス·セレビシエ由来のタンパク質Nar1を含む鉄-硫黄クラスターの酸化還元滴定は、3つの異なる補因子を同定した。 EPR信号は、それらのG値によって特徴付けられる：用[3FE-4S] + G Z 2.01、G クロスオーバー 2.00（ 図1B）。 [4FE-4S] +、G Z 2.02?...

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EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPRは、補因子の酸化還元滴定を監視対象<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

epr-monitored-redox-titration-cofactors-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K ビュー.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.