This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

Eの1。確立と維持アメーバ培養 <ol><li> （他のすべての汚染の生物の完全無料）無菌的に成長する赤痢アメーバ株のHMLの1×10 5栄養型：InterScan MSSはテフロンライナースクリューキャップ（または使い捨てのT-1×10 6栄養型と18 125×16 mm培養チューブのクローンを作成するTYI-S-33培地、3％ダイヤモンドビタミン混合物を補充した（TYIブロス、10％熱不活化成体ウシ血清、0.5 IU / mlペニシリン、および35μgの25フラスコ）にし、15ml（又はT-25フラスコ中の50ml）中/ストレプトマイシン）19 37℃のインキュベーター内</li><li>ガラス培養管に取り付けられた栄養を放出する氷水浴中で5〜10分間培養管を冷却することにより、通常、48〜96時間間隔（ 図1）での対数増殖期の間に収穫栄養。 </li><li> CELを分散させるための円錐チューブに文化を転送し、それを数回転倒LS。血球計算板（ノイバウアー室）を使用して、細胞数を決定し、新鮮なTYI-S-33培地を含む培養チューブに接種物を移す。 <ol><li>長い潜伏期間（〜5日間〜3×10 5細胞）と短い期間のためのより高い番号（〜1日の〜1×10 6細胞）のためにアメーバの低い数字を使用してください。カウント接種材料が望ましいが接種物の推定体積が実現可能であるように、確立された文化が予測可能になる。 </li><li>各実験について、細胞数を最適化するために、栄養の量を滴定する。 </li><li>不注意による汚染やチューブの破損の場合にはバックアップを持っているパラレル·重複の文化を維持している。 </li></ol></li><li>キャップチューブしっかりと5°傾いた水平画角で、37℃でそれらをインキュベートする。 </li><li>文化の過度の成長が多く、溶解した細胞が含まれている可能性があるので、定期的に目視での文化を確認してください。 </li></ol> MDCK培養2。確立と維持&lt;/ pの&gt; <ol><li> （マディンダービーイヌ腎臓）細胞/ 0.08 U（インスリン、ペニシリン（100 IU / ml）を、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を補充したDMEM培地10mlの使い捨てT-75フラスコ中でI（高抵抗）型MDCKを成長させるml）と37℃で5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中の10％新生児ウシ血清</li><li>セルを分割するには、倒立顕微鏡でそれらを確認してください。彼らは〜百分の85から100までコンフルエントのときセルを分割。 </li><li>無菌フードや文化からメディアを除去する滅菌ガラスパスツールピペットで真空吸引器を使用してください。スクレーピング細胞を回避するために、下の隅から逆さまにフラスコを回して吸引メディア。 </li><li> T-25フラスコの場合にT-75フラスコ（5mL中へ予め温めたPBS（140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4）を10mlのを分与）、静かに細胞を洗浄するために、フラスコを揺する。真空吸引によって、PBSを除去します。血清はトリプシンを阻害するので徹底的な洗浄が必要です。 </li><li> （T-25フラスコに0.5mlのを使用）および穏やかにトリプシンで細胞層を覆うようにフラスコを揺するT-75フラスコ中に0.05％トリプシンを1.5mlの分注する。 </li><li> （正確な時間は、トリプシン活性に依存します）インキュベーター内で5〜10分間インキュベートします。 </li><li>逆光フラスコを保持することによって細胞の剥離をチェックし、細胞を流すためにしています。 （細胞を四捨五入）細胞剥離はまた、顕微鏡を用いて確認することができる。多くの場合、細胞はフラスコの側への迅速な、優しい平手打ちで速い放出。 </li><li> T-75フラスコ（T-25フラスコのために5ミリリットル）に添加したDMEMの15ミリリットルを追加します。ピペッティング4または5倍に細胞を再懸濁。 </li><li>細胞を増殖させる、新鮮な補充されたDMEMで細胞懸濁液を1:5に希釈する。セル番号は、血球計数器を用いて、この時点で決定することができるが、特定のアッセイのための特別な形式にセルを分割する場合、これは通常は必要である。 </li></ol>栄養型全溶解の3。準備<ol><li>立方から栄養を切り離す氷水浴中で5〜10分間チューブを冷却することによりlture管。 4℃で10分間360×gでコニカルチューブと遠心分離機に無菌的に文化を転送慎重に、デカンテーションにより上澄み液を捨て、ペレットを氷冷PBSを追加し、10分間360×gで再び細胞や遠心分離機を分散させるために、チューブを数回転倒。 TYI-S-33培地を完全に除去するために二回、この手順を繰り返します。 </li><li>血球計数器を使用した栄養型の数を決定します。 </li><li>溶解は、凍結融解サイクルによって栄養型。 1分間、液体窒素中で氷冷PBSで希釈した栄養体の測定された接種材料（60万栄養個/ ml）を、スナップ凍結。 4℃、激しくボルテックスでサンプルをアンフリーズします。細胞溶解を完了するために、凍結融解を3回繰り返します。 </li><li> 0.02％β-メルカプトエタノールと溶解液中に存在するプロテアーゼをアクティブにします。 </li></ol>栄養型分泌生成物の4。準備<ol><li>ステップ3.2に3.1を実行してください。 </li><li>決定する血球計数器を使用し、トリパンブルー排除試験20を適用し、この時点での細胞数及び生存率： <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブに9×10 6 3ミリリットルの氷冷PBS中栄養型と転送細胞を希釈する。この懸濁液10μlを取り、0.4％トリパンブルー原液のpH 7.2の1を添加する。 </li><li>低倍率での細胞をカウントするためにノイバウアー室を使用してください。 </li><li>すべての細胞を計数し、細胞が青色色素を取り込んだとデッド考慮しなければならないので、青色細胞の数を分離する。 </li><li>細胞の総数により生存細胞の数で割り、100を掛けることによって生存細胞の割合を計算する。 </li></ol></li><li> 5°傾いた水平画角での2時間37℃でインキュベーターに栄養型懸濁液を含むコニカルチューブに移します。 </li><li> 10分間360×gで分泌される製品、遠心管を収集します。使い捨て無菌注射器を使用し、丁寧にSUを収集pernatant、ペレットからの栄養型とサンプルの汚染を避ける。 0.22μmの酢酸セルロース膜を通して上清を渡すことで、任意の転送細胞を排除する。 β-メルカプトエタノール、0.02％とプロテアーゼをアクティブにします。 </li><li>死細胞から放出された分子と推定される不必要な汚染を破棄するには、細胞の生存率のために、トリパンブルー排除試験を再適用します。ステップ4.2で得られた細胞の生存と総数は同じである必要があります。そうでない場合には、回収した上清は、分泌タンパク質を含有することができるのみならず、破棄されるべきである。 </li></ol>栄養型、栄養型溶解物または分泌生成物とのMDCK細胞の5。相互作用<ol><li>ライブ栄養型（1:1のMDCK対アメーバ比）でコンフルエントのMDCK細胞単層をインキュベート、栄養型溶解物（MDCK·ツー·アメーバ1:2）または分泌生成物（1のMDCK対アメーバ比：2と30分（ 図2A）、37℃で10）。 </li><li>非結合分子または栄養型を排除するために、氷冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。 </li></ol>免疫蛍光のためのサンプルの6。準備<ol><li> 24ウェル細胞培養皿の内側に配置滅菌ガラスカバースリップ上で培養MDCK細胞。彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。その後、新鮮なDMEM培地1mlで培地を交換し、より多くの24時間37℃のインキュベーターにプレートを転送する。 </li><li>真空吸引器と滅菌ガラスパスツールピペットを用いて培地を除去し、各ウェルに暖かい1mlのPBSを加える。 PBSを削除し、新しいPBSでの洗浄を繰り返します。ガラスピペットで井戸の底から細胞を傷が付かないように注意してください。 </li><li>ライブ栄養型（T）、栄養型全溶解（TL）と分泌生成物（SP）：暖かい1mlのPBSで希釈した栄養体のさまざまな条件を追加します。 <ol><li> 2または30分間インキュベーター内で培養プレートを置く。 </li><li> 1という時間0分、MDCK細胞を大腸菌とインキュベートしていないする必要があります。2の制御条件を準備アメーバだけ暖かい1mlのPBSで;この場合の二次抗体コントロールなどの他の条件は、2または30分間、T、TLやSPとMDCKインキュベートし、一次抗体とのインキュベーションを省略します。 </li></ol></li><li>非結合分子または栄養型を排除するために、冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。 </li><li>修正して、-20℃で30分間、96％エタノール1mlで細胞を透過</li><li>エタノールを除去し、室温で1mlのPBSで3回洗浄し、迅速に実行します。 </li><li>サンプルの乾燥を避けるために、湿潤チャンバー内の次の手順を実行します。 <ol><li>閉じられた試料を安全に載置可能なウェットペーパータオルで充填することができる任意の利用可能な箱を使用する。たとえば、空のピペットチップボックスは、この目的を果たす。 </li><li>室内に、均等にブロックのパラフィルム層とピペット25μLを配置各カバースリップ用の溶液（0.5％BSA）をING。 </li><li>微細鉗子でウェルからカバースリップを取り、注意深く濾紙で縁から過剰な液体を除去し、細胞をブロッキング溶液に対向してブロッキング溶液（0.5％BSA）を含有する液滴にカバースリップを置く。室温で1時間試料をインキュベートする。 </li></ol></li><li> PBS中の一次抗体の混合物を準備したIgMマウス抗EhCPADH112（Mα-EhCPADH112、1:10希釈）およびIgGウサギ抗ZO-1（Pα-ZO-1、1:100希釈）。 </li><li>湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。 </li><li>ブロッキング溶液からカバースリップを持ち上げ、濾紙を用いてエッジで余分な液体を乾燥させ、そして抗体溶液に面する細胞と滴にそれらを配置する。 4℃で一晩サンプルをインキュベート</li><li> 24マルチウェル（上部のセル側）のウェルに各カバースリップを入れて、1mlのPBSを加える。 <ol><li&gt;非結合分子を除去するために1mlのPBSで5回洗浄する。 </li></ol></li><li> FITCと結合したヤギ抗IgMマウス（1:100希釈）とTRITC（1:50希釈）に結合されたヤギ抗IgGウサギ：PBS中に蛍光二次抗体の混合物を準備します。 </li><li>湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための二次抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。 </li><li> 6.10のようにサンプルを転送し、蛍光色素の退色を避けるために、暗所で室温で1時間インキュベートする。ステップ6.11.1を繰り返します。 </li><li>核染色のために、室温で0.05 mMのDAPI溶液200μlで3分間インキュベートし、光から保護します。ステップ6.11.1を繰り返します。 </li><li> 、蛍光色素を節約する5μLVECTAシールドにカバースリップ（細胞を下向き）を配置するために顕微鏡用スライドガラス上にマウントソリューションを退色防止。試料乾燥を避けるためにマニキュアを使用してカバーグラスをシール。 </li><li>長期保存のために、スライドを保つ-20℃での顕微鏡用スライドボックス</li><li> zスタックセクションとXZ-面（ 図2A）を介して共焦点顕微鏡による調剤を分析します。 </li></ol>プロテアーゼ阻害剤または特異的な抗体を用いて栄養型の7。インキュベーション<ol><li>繰り返して3.2に3.1を繰り返します。各実験条件については、4でプロテアーゼ阻害剤（コンプリート1 mMおよび40μg/ mlのE-64）、または20分間EhCPADH112（mαEhCPADH112）21に対して、30μgのモノクローナル抗体（50μlのPBS中に再懸濁）1×10 5栄養型インキュベート℃（ 図2B）。ステップ8.5で説明したように同時インキュベーションアッセイのためにこれらの製剤を使用してください。 </li></ol>経上皮電気抵抗（TER）の8。測定<ol><li>無菌トランスウェル透過性サポート（0.4μmの孔径）上で培養したMDCK細胞。上部コンパートメントには、細胞懸濁液を100μlを配置し、下部コンパートメント内DMEM培地を600μlを置く。 <ol><li>定期的に中レベルを確認してください。必要に応じて新鮮な培地を添加することができる。 </li><li>彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。 2〜3日ごとに培地交換。 </li><li>細胞接着（必要な場合）を改善するために、細胞懸濁液を添加する前にDME​​Mで37℃で一晩トランスウェルフィルターを平衡化。 </li></ol></li><li> UV光下で、15分間ずつエタノールに浸漬することによりフード内STX2電極を殺菌した後、滅菌PBS中。 EVOM上皮voltohmmeterに電極を接続し、抵抗モードを選択します。 </li><li>各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を収集し、それらをプールする。このメディア混合液50μlを取り、栄養型懸濁液50μl（PBS中1×10 5栄養型）またはPBSのみ（対照）とそれを組み合わせる。各トランスウェルのために同じような混合物を使用してください。 </li><li>各トランスウェルcontaininの上室に混合物を添加G MDCK細胞。実験条件は、栄養型（コントロール）することなく、栄養型またはプロテアーゼ阻害剤又はmαEhCPADH112と共にプレインキュベートした栄養体との共培養をMDCK細胞が挙げられる。フィルタによって提供される抵抗を排除するために、培地のみとインキュベートしたトランスウェルを使用しています。各実験条件について少なくとも3トランスウェルを使用しています。 </li><li>すぐに、各トランスウェルにSTX2電極を浸漬することによりTERを測定します。 <ol><li>長い電極が下部チャンバーの底部に接触し、短い電極は（ 図2（b）参照 ）は、上部区画内の媒体によって覆われていることいることを確認してください。 </li><li>毎回垂直に電極を保持するようにしてください。これは、有意に、再現性を改善する。これは、データの変化につながるように移動したり、測定中に電極を傾けることは避けてください。 </li></ol></li><li>この測定は、初期のTER値を考慮する必要があります。すると、次の中にTERを監視30分。 </li><li>最終のTER値を計算するために、唯一のフィルタのTER値を減算する。異なる実験からの結果を比較すると、100％（ 図2B）、これらを考慮して、初期値に各データポイントを正規化する。 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDCK+variety+pack:+choosing+the+right+strain.">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li><li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis:+from+molecules+to+disease.">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li><li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica.">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li><li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites.">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li><li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica.">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li><li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions.">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

E.により、上皮感染中インビトロ宿主-病原体相互作用を研究するためにアメーバは、上皮細胞と栄養の両方の老舗の文化と連携することが重要である。例えば、以前は、E.アメーバ培養は通常、細菌やtrypanosomatids 22,23の特定の種に関連して確立されていた。 Eのが、共培養アメーバ培養宿主細胞で観察された影響がはっきりとameobasに帰するこ?...

赤痢アメーバは、人間のアメーバ、炎症や下痢を引き起こす腸の感染症の責任ある単細胞の原生動物である。E.アメーバは毎年5000万個人にまで感染するが、感染者の約10％がアメーバ1に関連した症状を起こす。感染はEを含む汚染された食物や水の摂取時に起こるアメーバ嚢胞 。腸内で、嚢胞は、大腸ムチンに付着し、2を増殖するライブ栄養型を生産する。栄養型は通常、便を経由して排泄される嚢胞を形成している。他のケースではまだ未知の理由のために、栄養型は腸管上皮層を破壊し、下層組織に侵入する。最悪のケースでは、それらは血流に入り、肝臓3など他の臓器に影響を与える。 上皮バリアを破ることは入社細胞を維持する上皮性膜貫通構造の破壊を必要とします。上皮細胞連絡先はタイト（TJ）からなる頂端接合部複合体により形成され、接合（AJ）を接着結合、および4をデスモソームている。ほとんどの頂端接合部は、TJであるため、彼らはEで侮辱し第一関門であるホスト侵入中にアメーバといくつかの他の病原体。 TJは、隣接セルの受容体とホモまたは異種相互作用に関与クローディン、オクルディンおよび接合部接着分子（JAM）のような膜貫通接着受容体で構成されている。それらは、細胞内で上皮にさらなる機械的強度を提供するために、アクチン細胞骨格に接着レセプターを接続する閉鎖帯（ZO）ファミリーの足場分子によって結合される。 TJは、過剰な水および溶質の漏れを防止する、腸管内腔から腸組織をシールするための責任がある。 TJは、寄生虫によって破壊された後にこのように、組織を侵略している。E. （I）TARGにアメーバの接着に関与するもの： アメーバのようないくつかの分子を分泌するらセル5; （ii）は、例えば、エキソサイトーシスによって宿主細胞の殺傷に関与する膜活性因子、6,7 amoebaporesと呼ばれるイオンチャネル形成ペプチドを;および（iii）細胞外マトリックスタンパク質を分解し、組織崩壊を媒介5,8,9プロテイナーゼ。 一緒にEhCPADH112複合体を形成するシステインプロテアーゼEhCP112及び接着分子EhADH112は、2つのE.あるTJ 10の分解に大きな役割を果たしているアメーバの病原性タンパク質。ライブ栄養型、それらの総溶解物および分泌された製品は、上皮バリアのTJ複雑で機能障害の分子の変化を誘導する。本研究では、EhCP112とEhADH112は、このようにEを容易に細胞タンパク質の内在化と分解をもたらすオクルディンとクローディン1タンパク質と相互作用することが示されている傍細胞経路を介したアメーバの入り口。 我々のデータは、これらのOF他のグループ11から17を強く寄生虫の侵入を可能にする特定宿主-病原体相互作用の必要性を示唆している。これらの相互作用の分子基盤を解明することはアメーバ症の病因のより良い理解のために最も重要である。傍細胞透過性の増大によって特徴付け栄養によるTJの選択的な外乱が、経上皮電気抵抗（TER）の減少によって測定することができる。宿主上皮に向かって寄生タンパク質の移動は、免疫蛍光染色および共焦点レーザー顕微鏡法も可能での直接的な相互作用を示す上皮接合部のマーカーとアメーバの病原性因子の共局在を明らかにすることができる方法によって決定することができる。この記事では、上皮細胞と栄養が、栽培収穫し、宿主 - 病原体相互作用とその結果を検討するために操作する方法を詳細に説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A&#160;</td>
			<td>IMSS Hospital, Mexico</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Virulent trophozoites18&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">TYI broth</td>
			<td rowspan="8">Becton, Dickinson and Company 
			Merck 
			Merck 
			Merck 
			J.T. Baker 
			Reproquifin 
			SIGMA-Aldrich 
			SIGMA-Aldrich</td>
			<td rowspan="8">211862 
			K35625437 626 
			21578 
			4873 
			3252-01 
			CAS 50-81-7 
			C7880 
			F-5879</td>
			<td rowspan="8">3.45% BBL Biosate peptone 
			58 mM glucose 
			39 mM NaCl 
			5 mM KH2PO4 
			6.5 mM K2HPO4 
			16.3 mM ascorbic acid 
			8.1 mM L-cysteine 
			&#160;0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum adult</td>
			<td>Microlab , Labs., Mex.</td>
			<td>SU146</td>
			<td>Use at 10% and inactivated to 56&#176; C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond&#160; vitamin&#160; mixture- Tween 80</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>SR-07</td>
			<td>Use at 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>34564SSA IV</td>
			<td>0.5 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>75757SSA IV</td>
			<td>35 &#181;g/ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps</td>
			<td>Corning-Pyrex</td>
			<td>9826-16X</td>
			<td>16x125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 Well</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.&#160; Rings on lid prevent cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430168</td>
			<td>Canted neck flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK (Madin Darby canine kidney) type I</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL34</td>
			<td>Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium with high glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Calf Serum</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>S-02</td>
			<td>Use at 10%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin mixture&#160;</td>
			<td>In vitro&#160;</td>
			<td>A-01</td>
			<td>Stock solution 10,000 U/&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>AMSA</td>
			<td>398MJ94SSA IV</td>
			<td>Stock solution 100 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution&#160;</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>EN-005</td>
			<td>0.05% enzyme solution without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430720</td>
			<td>Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3470</td>
			<td>0.4. &#181;m polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836 153 001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td>Cystein protease inhibitor, final concentration 40 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p&#945;ZO-1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td>IgG rabbit policlonal&#160; antibody&#160; against&#160; a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m&#945;EhCPADH112</td>
			<td>Homemade antibody</td>
			<td>Without/ Number</td>
			<td>IgM mouse monoclonal antibody&#160; against&#160; 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-goat anti-mouse IgM</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>62-6811</td>
			<td>Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary&#160; antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>816114</td>
			<td>Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled&#160; goat anti-rabbit IgG&#160; secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 Electrode</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>102711</td>
			<td>Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>12111</td>
			<td>Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>MEARIENFELD</td>
			<td>610610</td>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS_SP5_MO</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#180;, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>0.05 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A-1310</td>
			<td>0.5%&#160; final concentration for blocking solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the epithelial damage produced by entamoeba histolytica infection

赤痢アメーバは、人間のアメーバ症の原因物質、下痢や熱帯諸国における肝膿瘍の主要な原因である。感染は、腸上皮細胞と病原体との相互作用によって開始される。この相互作用は、このようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）のような細胞間構造の破壊につながる。 TJは、腸管内腔から宿主組織を分離する上皮層のシール性を確保。最近の研究では、寄生タンパク質EhCPADH112によるTJの破壊がEのための前提条件であるという証拠を提供上皮バリア機能障害を伴うアメーバ侵入 。このように、E.中にTJ分解に関与する分子メカニズムの解析アメーバの侵入はアメーバ症の病因の理解を向上させるために最も重要である。この記事では、最初の宿主 - 病原体相互作用の評価と寄生虫の侵入の可能性を可能にする簡単なモデルを提示。分析対象となるパラメータは、Tが含まれransepithelial電気抵抗、上皮表面受容体発現の変化および上皮接合マーカーおよび上皮細胞内寄生生物分子の局在化の局在化との相互作用EhCPADH112。

成功のためのE.アメーバ文化 、二つの重要な条件が満たされなければならない：対数期における無菌状態や収穫を増加します。 Eの以前に、文化アメーバは容易に細菌やtrypanosomatids 22の特定の種に関連して設立された。しかし、今では、細菌、真菌、原生動物、または後生動物の細胞を代謝しない環境にアメーバの無期限継代培養を意味するこの寄生虫の無菌栽培...

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Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。

プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

18.6K ビュー.  Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute.  赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデル?...

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In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

免疫・感染学

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

のための負の選択マーカーの開発赤痢アメーバ</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; Nicotiana benthamianaの</emVLPは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

ソフト寒天オーバーレイ技術の使用は、細菌産生阻害する化合物をスクリーニングするために

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...