This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

全てのマウスを飼育し、取り扱う国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って、およびNHLBI動物実験委員会が承認したプロトコルに登録された。雌B6.SJL-Ptprc（d）は6-12週齢PEP3（b）に/ BoyJ（B6.SJL）およびC57BL / 6マウスを、それぞれ、ドナーとレシピエントとして使用した。 材料、試薬、および機器のリストを表1に提供される。 マウスHSPCs 1。LEGO伝達および骨髄移植認定されたバイオセーフティーレベル2（BSL-2）キャビネット（組織培養フード）に以下の手順を実行します。 <ol><li> LEGOベクターのエンコーディング5FPSの生産<ol><li>レンチウイルス「遺伝子オントロジー」（LEGO）ベクタープラスミドを使用してくださいLEGO-CER2（セルリアン）、レゴ-G2（EGFP）、レゴ-V2（金星）、レゴ-T2などの強力な構成SFFVプロモーターから異なるFPをコードする各（TdTomato）、そして親切に博士ボリスFehse（大学医療センターハンブルク·エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）により提供さLEGO-C2（mCherryを）; Addgene 5-7からも利用可能になりました。 </li><li> I10メディア8mlにLEGOベクトル、トランスフェクション前に10cmの皿（各ベクトルのための12の皿を使用）、24時間でのシード5×10 6個の293T細胞を作製するために、（IMDM、10％FCS及びグルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）。 </li><li>わずかに変更されたCAPHOSキットの推奨を使用して、リン酸カルシウムと細胞をトランスフェクション： <ol><li>各プレートミックス15μgのレゴベクトルの場合、12μgのpCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE、4μgのPREV-TAT、および1μgpMD2.G-VSV-Gプラスミドを50μlの2.5MのCaCl 2の存在下で、および水を加える500μlの総容量が得られます。 </li><li> 2×HEBS（HEPES緩衝生理食塩水）500μlのプラスミドDNAを沈殿させ、前293T細胞の各プレートに添加する室温で20分間インキュベートする。 </li><li>のために細胞をインキュベート37℃、5％CO 2インキュベーター中で6時間;メディアを取り出し、新鮮な培養培地6時間後に、トランスフェクションを追加します。 </li></ol></li><li> 3日間、毎日、各プレートからレンチウイルス粒子を含む培養上清を収集します。毎日、以下の上清の収集を各プレートに新鮮I10メディアを追加します。 <ol><li> 0.22μmの細孔を、プールを通して濾過し、71900×gで、4℃で2時間SW28ローターに超遠心分離によって上清を集中。 </li><li>ステムスパン培地1 mlの上清を再懸濁する。 -80℃で200μlの、店舗でのレンチウイルス株を分注し。 </li></ol></li></ol></li><li>レンチウイルス粒子の滴定 NIH3T3細胞を用いて、単位/ mlに形質導入​​の定量を介して収集上清中のレゴベクター粒子の力価を決定します。力価は、実験対象のための感染（MOI）の所望の相対多数になるために必要な各ベクトル上清の体積を計算することができ細胞。 <ol><li>プレート1日滴定前I10メディア2ml中のウェル（12ウェルプレート）当たり5×10 4 NIH3T3細胞。 </li><li> （4 mg / mlのは1,000倍である）、硫酸プロタミンを補充したI10メディアのベクトル上清の5倍連続希釈液を調製する。 </li><li>細胞から培地を除去し、濃縮したウイルスの2、0.8、0.32、及び0.128μlのと同等のものを含む上清の希釈液を500μlと交換してください。 </li><li>うまくつのコントロールを数える、形質導入の際にウェル当たり存在する細胞数（なし）を決定します。 </li><li>形質導入後6時間、I10培地2 mlを追加し、37°C、5％CO 2で3日間インキュベートする。 </li><li>各ウェルトリプシン-EDTAを使用してから細胞を採取し、フローサイトメトリーを介した蛍光細胞の割合（％FP）を決定。 </li><li>無価（ベクター粒子/ ml）= 1〜50％％のFP結果として各ウェル（希釈）について得られた力価の平均を、以下のような力価を計算するベクター上清（ミリリットル）のX％、FP /音量。 FPは1〜50％の間である％あれば各希釈について得られた力価を平均する。 </li></ol></li><li>マウスの細胞採取、精製、形質導入、および移植（模式的に図1Aに示すがMalide ら 4から採用）。 <ol><li>承認された手順により、ドナーマウスを生け贄に捧げる。前部と後部の手足から収穫骨髄：、上腕骨、大腿骨と脛骨を解剖徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯および余分な組織を除去し、関節にできるだけ近い各骨の終わりを横断し、外に骨髄をフラッシュI10メディアを入れた注射器に27-0 Gの針を用いて骨。 </li><li> 500×gで、4℃で10分間、全骨髄細胞をペレット化し、50mlのACK緩衝液で2回赤血球を溶解。 10ミリリットルI10培地中の細胞を再懸濁。 </li><li>修正されたキットのprotocoに従って、MACS系統枯渇キットで系統陰性（リニア）前駆細胞を精製L： <ol><li>抗ビオチンマイクロビーズ30μlの代わりに10μlの/ 10 7個の細胞を使用してください。 I2メディア（2％FCSを添加したIMDM）の代わりに緩衝液での洗浄ステップを完了します。 </li><li>ビオチン抗体カクテルとのインキュベーションと抗ビオチンマイクロビーズとのインキュベーションの間に1つの洗浄工程を挿入します。とI10の代わりに緩衝液を用いてカラムを平衡化。 </li></ol></li><li> 10ng / mlのネズミIL-3、100ng / mlのネズミIL-11、100ng / mlのヒト体Flt-3を補充したステムスパン培地中で5×10 5細胞/ mlの出発密度で48時間培養リニア細胞リガンド、および50ng / mlのマウス幹細胞因子。 </li><li>レトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートに移す1〜5×10 4個の細胞およびステムスパンの存在下で、それぞれのFPのための50％の発現効率を達成するために6-7のLEGO上清を、感染多重度での各（MOI）で形質導入するメディアやサイトカインは、上記に詳述し、4 / mlの硫酸プロタミン。 </li><li>細胞を形質導入各LEGOベクターによる個別同時にすべて5 LEGOベクター上清と共に形質導入​​（ミックスと呼ばれる）または共形質導入細胞を、次のステップ1.3.5で説明して混合細胞など（株と呼ばれる）。 、24時間後に細胞を除去するサイトカインずにステムスパンメディアで1回洗浄し、移植のためのサイトカインなしにステムスパンメディアで再懸濁し、またはサイトカインで新鮮な培地に転送し、さらに96時間の培養、共焦点顕微鏡の前およびフローサイトメトリー。 <ol><li> 1に対応したマウスあたり細胞用量で、100μlの容量で、11 Gyの単回投与前の放射線照射レシピエント（6-18時間移植前の）レシピエントに尾静脈注射を介して伝達リニアHSPCsを注入することにより、骨髄移植を行います-4×10 5リニアもともと形質導入のためにプレーティングした細胞。各実験において、形質導入されたドナーBM細胞の同じ集団での動物のコホート全体を移植。 </li><li>形質導入されたH のin vitro特徴付けのためSPCはは、文化ステムスパンで追加の4-5日間、細胞がサイトカインを補充し、導入効率のために、フローサイトメトリーによって分析して、色の多様性のための顕微鏡法による。 <ol><li>個別のマウスを犠牲にし、さまざまな時間は、移植後120日までの時点で、イメージングのための組織や臓器を取り出す。 <ol><li>エタノールでマウスの毛皮をスプレーし、髪の普及を回避腹側の皮膚を切開。 </li><li>標準的な手順脾臓、膝窩リンパ節、肺、心臓、皮膚、脂肪組織、骨格筋、腎臓、肝臓だけでなく、頭蓋冠へのアクセスへの​​ヘッドによれば解剖と消費税。 </li><li>または、頭蓋冠を使用するか、またはそのような生きた動物での皮膚やリンパ節などの時間2,8,9-や画像、表在臓器にわたって繰り返し、ライブイメージングのための骨のウィンドウを設定します。 </li></ol></li><li> 50-100で35ミリメートル数0カバーガラス培養皿に、個別の器官を配置56;ステップ2.5で説明したように、切片、固定またはさらなる処理なし無傷でそれらを画像化するためのPBS。 </li><li>ボリュームイメージングのために、冷PBS中で使用するまで臓器をしてください。タイムラプスイメージングのために、20mMのHEPESを含有する10％FBS、37℃でDMEM中で臓器を画像化するに直ちに進む</li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2共焦点と二光子顕微鏡と画像解析<ol><li>マルチラインアルゴン、ダイオード561 nmのヘリウムネオン594ナノメートル、およびヘリウムネオン633nmの可視光レーザーを搭載したライカSP5 5チャンネル共焦点および多光子システムを使用して、顕微鏡イメージングを実行します。 680から分散補正と1,080 nmの励起用サファイアチタン（Ti-SA）レーザー、波長可変：2光子モード、パルス状のフェムト秒チタンで使用してください。 tと共に順次または同時に、1,030-1,300 nmのものであれば、出力波長範囲を拡張するために赤色にシフトしたFP（tdTomatoおよびmCherryを）、光パラメトリック発振器（OPO）レーザーを含む実験で使用のTi-Saのレーザー彼。 </li><li> HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA水浸漬対物レンズ（WD = 2.5ミリメートル）、HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA乾燥対物レンズ（WD = 0.6ミリメートル）、またはHC-PL-IRAPO 40Xを用いた画像さまざまな組織/1.1 NA水浸対物レンズ（WD = 0.6 mm）である。 </li><li>コントロールのと同様に、単一のFP LEGOベクターで形質導入骨髄細胞から可視スペクトルの5nmの帯域幅で発光した光のラムダスタック（xyλ）を収集し、共焦点蛍光スペクトルを取得し、BMを移植しない。 <ol><li>ライカLAS-AFのV2.4.1ソフトウェアとプロセスイメージは、すべて5 FPの参照スペクトルだけでなく、自家蛍光のように（ 図2A）を作成する。個別のFPスペクトルおよび蛍光の明るさの差を使用して次のように5シーケンシャルイメージングチャネルを設定セルリアン（79％）、金星（156mg％）、tdTomato（283％）およびmCherryを（47％）の（EGFPの％として表される）。セルリアン（458/468から482 nm）を、EGFP（488/496から514 nm）を、ヴィーナス（514/523から558 nm）で、tdTomato（561/579から597 nm）を、そしてmCherryを（594/618から670 nm）を（ <strオング&gt;図2B）。 </li><li>各個別のFPで形質導入された細胞が残ります（ 図2C）からのみ対応するチャネルに表示して存在しないように、正確なfpsの分離を検証します。また、この定義されたマルチチャネルアプローチは、その後の色分析およびクローン追跡を可能にし、スペクトルイメージングと比較して、取得時間を減少させるという利点を有するユニークな5チャンネル &quot;colorprint」を作成する。 </li></ol></li><li>高効率のカスタムダイクロイックミラーによる2光子モードでの個別の蛍光発光、および以下のように非デスキャン検出器（NDD）、4つのチャネルで収集し、続いて465 nmのダイクロイックミラーに続く568 nmのダイクロイックミラーを、 SHGまたは自己蛍光及びセルリアンための45分の452 nmの発光フィルター、EGFPや金星のための40分の525 nmの発光フィルター、および648 nmのダイクロイックミラーとtdTomatoまたはmCherryをするための60分の620 nmの発光フィルター。 <ol><li>二光子顕微鏡iで構造情報を明らかにするntrinsicコントラストエラスチンからの組織自己蛍光画像化（上述のように）、NADH、（780で励起）であり、第2高調波は、骨および後方散乱収集920 nm以上860 nmでの線維性コラーゲン（興奮からの信号（SHG）を生成し方向）10,11。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームレンダリングのために、骨髄およびその他の組織全体の深さの範囲（150〜300ミクロン）上に5μmの間隔で、z軸に沿ってのxyz一連の画像（典型的には1×1×4μmの3ボクセルサイズ）を収集し、大規模な、全体を自動的胸骨窩を備えたステッチのボリュームを生成するために、約2.5×1.2ミリメートル2（XY）と300μmの（z）が（ 図2D-2E）のソフトウエアのタイル機能を利用して地域やムービー1オーバー。 <ol><li>画像は2,8を区画することなく頭蓋骨を介して直接、骨髄頭蓋冠。 </li><li>矢状面（二分）に沿ってセクション胸骨、その後横方向に切断面3,4,12を通じて2胸骨堀と画像の間の共同で（ 図1（b）の概要高久ら 3から採用）。 </li></ol></li><li> 4Dタイムラプスイメージングのために、50〜100μlのDMEM、37℃で20mMのHEPESを含有する10％FBS中、35ミリメートル番号0カバーガラス培養皿上に新たに切除した膝窩リンパ節、脾臓、肺、または頭蓋冠骨サンプルノーカットを配置と〜（Z-スタックを取って、共焦点励起（458 nmの488 nmの514 nmの561 nmの594 nm）であり、ライカレゾナントスキャナ（8000ヘルツ/秒）と組み合わせた2光子のTi-Saの励起（860 nm）を使用し最大で1時間20秒間隔で80程度）。 <ol><li> （ 動画2）同時3色2Pイメージング用のTi-Saが860 OPOの（または1140 nmのmCherryをtdTomatoのための1,130 nmのチューニング）レーザーと同時にnmでチューニングしてください。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームと4Dの時間シーケンスの再構築と分析<ol><li> Imaris x64のSOFTWを使用して、バージョン7.6、または代替ソフトウェアパッケージ骨髄および異なる組織内部の蛍光細胞のボリュームレンダリング（3D）データへの生画像のタイル張り·スタックを変換すると、以前に3,4に記載されているように、3D回転ムービーとして書き出すべきである（ 動画1）ステップバイステップの例： <ol><li> Imarisでは、zスタック画像を開きます。選択3Dボリューム視覚化を表示するために「サーパス」。 </li><li> 360°の周りにボリュームを回すために、「ナビゲート」を使用します。 </li><li>アニメーションを作成する「アニメーション」を選択します。選択したビュー、ズーム、ボリュームの回転を追加するために、キーフレームを使用します。ムービーをプレビュー、必要に応じて編集し、目的のムービー形式でファイルを保存します（例：AVI、MOV）。 </li></ol></li><li> 3D細胞とクローン周波数、位置、大きさや分布の定量的評価、さらにプロセスの場合、距離MEASを実行するMATLABアプリケーションを統合Imaris XTモジュールを使用してのzスタック以前3,4に記載のように（距離変換アルゴリズムを使用して）urementsおよびクラスター分析。 Imaris x64のソフトウェアとボリュームレンダリング四次元（4D）ムービーに時間をかけて画像スタックのシーケンスを変換し、自己回帰移動アルゴリズムを用いて3次元的に細胞運動の半自動トラッキングスポットと表面解析を使用しています。 </li><li>次のように細胞のマルチスペクトル分析を実行します。新しいチャネルにImaris XTのチャンネル演算を介してすべての5つのチャネルを追加することによって、マルチカラーラベルスポットを抽出する。全てのスポット（セル）5成分のチャネルのそれぞれの平均輝度蛍光を決定する。個別のセル内の各FP（図2Eグラフ）の相対％ すなわちユニークな「colorprint」を表示するグラフをプロットするためにExcelソフトウェア内の値をエクスポートします。組織ドリフトを設定されたデータを修正して、セル速度と変位時間をかけて、トラックの長さ、パス、および距離を計算。 ExcelのSOFにおける輸出額グラフをプロットするtware。 Adobe PhotoshopのCSS 5ソフトウェアを使用して複合図形を組み立てます。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy.">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li><li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+ontology+(LeGO)+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis.">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li><li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+'gene+ontology'+(LeGO)+vectors+for+functional+gene+analysis.">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li><li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking.">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li><li>Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow.">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones.">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues.">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li></ol>

著者らは、競合する金融利益を宣言しません。

私たちは、生きた組織で、体積とダイナミックイメージングを実現するために、タンデム共焦点および2光子顕微鏡で5FPコードLEGOベクトルおよびイメージングマーキング組合せにより発生する大きな多様性を組み合わせて、ここ最近、クローン細胞の追跡のために考案強力な方法論の詳細を説明します。これは5 &quot;個別の&quot; 8ビットのチャネルでの共焦点分光身元を記録することにより、?...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

血液細胞の産生、造血と呼ばれるが、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）の小集団によって維持される。これらの細胞はすべて、自己再生および分化1,2の制御に関与し、骨芽細胞、間質細胞、脂肪組織、及び血管構造からなる複合微小環境ニッチにおける骨髄（BM）内に存在する。無傷のBMは直接観察に伝統的にアクセスできなくなっているように、HSPCとその微小環境との相互作用は、生体内での大部分は未同定のまま。以前は、私たちは共焦点蛍光および反射顕微鏡3を使用して、無傷のBMの3次元構造を可視化する方法論を確立した。私たちは、BM中のEGFP-マークHSPCsの拡大を特徴とするが、単一のFPの使用は、クローンレベルでの再生の分析を排除。ごく最近、私たちは、構成的にFLを発現するレンチウイルス遺伝子オントロジー（LEGO）ベクターを利用しました効率的に細胞4,5をマークするuorescentタンパク質（FPS）。 3または5ベクターとHSPCの共同形質導入は、複数の個別HSPCクローンの追跡を可能にする、組み合わせの色の多様なパレットを生成します。 マークの新しいイメージング技術と組み合わせたHSPCは、照射されたマウスのBM中の個別のHSPCホーミングおよび生着をトレースすることを許可。 LEGOベクターは、骨やその他の明確な可視化を可能にする、（セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、およびmCherryをから）3または5異なるのFPにHSPCをマークし、共焦点および2光子顕微鏡によるBM中の時間をかけて彼らの生着に従うために使用されたマトリックス構造、及びそれらの微小環境の成分にHSPCクローンの関係。 HSPCはLEGOベクターで形質導入したC57BL / 6マウスのBMからの系統陰性細胞、のように精製し、そして骨髄アブレーションコンジェニックマウスに尾静脈注射によって再注入された。胸骨骨髄組織を大量に監視することにより、私たちは、初めに発生した骨内膜移植を可視化BMの再生。多様な色のスペクトルを有する細胞クラスターは、骨に近接して、最初に登場し、時間をかけて集中的に進行した。興味深いことに、3週間以上後に骨髄ではなく、血流を介してHSPCsの広範な普及よりも、連続して骨髄中の個別HSPCsから派生造血の広がりを示唆し、巨視的なクローンのクラスタで構成されていた。後半の時点ではあまり色の多様性は、複数のベクターとの長期的な再増殖細胞に形質導入​​することが困難で示唆がありました。 また、HSPCsは、脾臓において、マウスにおける造血を担う臓器をクラスターを形成した。 HPSC由来の個体の細胞は、同様に、胸腺、リンパ節、脾臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、骨格筋、脂肪組織、および腎臓において解決することができる。 3D画像は、組織の最小限の摂動を有する細胞の分布を理解するために定性的および定量的に評価することができる。最後に、説明共振スキャニング多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせることにより、4Dでのライブの動的試験のdの実現可能性。この方法論は、組織再生および病理学の研究で​​強力なツールを提供し、彼らの無傷の3Dアーキテクチャでスペクトル的にマークされた細胞集団の非侵襲的な高解像度、多次元細胞運命のトレースを可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Production of viruses</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-Cer2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27338</td>
			<td>Expression of Cerulean</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-G2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">25917</td>
			<td>Expression of eGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-V2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27340</td>
			<td>Expression of Venus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-T2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27342</td>
			<td>Expression of tdTomato</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-C2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27339</td>
			<td>Expression of mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Calciumm Phosphate Transfection Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAPHOS-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Tissue culture dish</td>
			<td style="width:493px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:216px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">IMDM</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pen Strep Glutamine</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">SW28 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">L60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um)</td>
			<td style="width:493px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:493px;">Quality Biologicals Inc.</td>
			<td style="width:216px;">118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LS columns + tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pre-Separation Filters (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:493px;">StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc&#160;</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">murine IL-11 CF</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>418-ML-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine SCF</td>
			<td style="width:493px;">RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&#160;</td>
			<td>RDI-2503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>403-ML-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">FLT-3 Ligand</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-096-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">12-well plates, Costar</td>
			<td style="width:493px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:216px;">3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Retronectin</td>
			<td style="width:493px;">Takara Bio Inc</td>
			<td style="width:216px;">T100A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Protamine Sulfate</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Confocal and two-photon microscopy</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">DMEM</td>
			<td style="width:493px;">Lonza</td>
			<td style="width:216px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:493px;">Cellgro, Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:216px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Imaris software version 7.6</td>
			<td style="width:493px;">Bitplane</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

私たちは、開発し、マウスの骨髄移植実験モデルを用いたin vivoでの造血に勉強する高い空間および時間分解能で、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）のクローン追跡のための方法論を蛍光マーキングを検証しました。蛍光タンパク質をコードするレンチウイルスベクターを用いてマーキング遺伝子コンビナトリアル（FPS）は、高度な顕微鏡撮影により細胞運命マッピングを可能にした。五つの異なるFPをコードするベクター：セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、そしてmCherryをカラーマークされたセルの多様なパレットを作成し、同時にHSPCsを伝達するために使用された。共焦点/ 2光子ハイブリッド顕微鏡を用いて画像化は、同時高解像度一意にマークされた細胞の評価と組織の構造部品に関連してその子孫を可能にします。スペクトル的に符号化されたHSPC由来細胞は、骨髄（BM含むさまざまな無傷の組織に非侵襲的に検出することができる体積が大きい面積にわたって分析明らかにする）、移植後の時間の広範な期間について。 4Dにビデオレートの多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせたライブの研究では、定量的にダイナミックな細胞およびクローン追跡の可能性を実証している。

胸骨骨髄時間経過の全体マウント3D共焦点/ 2光子顕微鏡再構成が顕著な特性を有するパターンにおける移植共同5FPSの生着·拡大を明らかにした：クローンは、均一に広い、最初は色のパレットと進歩が付いて、線引きを明確に現われ時間をかけて優先的に主に一つの色のセルが含まれています。共焦点顕微鏡のセットアップ及び胸骨の骨髄における撮像5FPSマーキングHSPCの代表例を図2</s...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K ビュー.  NHLBI/NIH. 造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命の?...

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

生物学

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.