イメージングは​​、博士マーティンSpitalerによって管理インペリアル·カレッジ·ロンドンの膜施設内に位置直立ライカSP5共焦点顕微鏡上で実施した。 試料ホルダーおよびヘッドピースはサミュエル·ジョーンズ博士とサイモン·シュルツからの助言で、インペリアル·カレッジ·ロンドンの化学工学部門と共同で行われました。 ニコラRuivo、フランシスコ·ディアスとインペリアル·カレッジでのCBSのスタッフは、マウスの飼育上の支援や助言のため尽力した。 マーク·スコットはCRUK、KKLF、BBSRCとHFSPによってCRUKとクリスティーナ·ローセルソによりHFSPや映画、Olufolake Akinduroによって資金を供給されている。

動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われる。私たちの仕事は、英国内務省だけでなく、インペリアルカレッジ倫理審査委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載され、常に動物の福祉を確保するガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律を遵守することを確認してください。 1標識およびHSPCsの注入： <ol><li>ローセルソ14-15によって記載されているように細胞を回収する。 </li><li> PBS中10 6細胞/ mlの濃度で細胞を調製する。注：細胞をカウントし、血球計数器やセルソーターによって提供された情報を使用します。標識し、注入される細胞数は、細胞型（ - 2万HSCは、100,000 - 例えば染色10,000〜300,000のHPC）に依存して変化する。 10未満の5個の細胞を扱う場合には、100μlのPBSに再懸濁;血清は染色を阻害するように、それは、いずれの血清を含まないPBS中で細胞を有することが重要である。 </li><li> 5μMの最終濃度で細胞懸濁液に行なったし、溶液から沈殿し、細胞を標識するために失敗しない染料を確実にするために、すぐに停止をボルテックス追加。 </li><li> （ - 150μlの〜100）、5分間500×gでスピンし、液体をデカントし、IV注射のために適切なボリュームにペレットを再懸濁することにより洗浄、次いで37℃で10分間インキュベートする</li><li> 200μlのPBSで細胞を再懸濁し、インスリン注射器に集める。注：それは針デッドスペースがないため、マウス全体の細胞懸濁液を投与することを可能にするので、インスリン注射器は、従来の注射器をお勧めします。 </li><li>尾静脈注射を介して、致死的に照射したマウスに細胞を注入する。注：TIにわたって開発して骨髄微小環境（造血および間質成分の両方）、上の照射が知られている、かなりのインパクト私。これは、照射、細胞注射（最高の生着のための照射から4〜24時間）、およびイメージングのための一貫性のあるタイミングを維持することが非常に重要である。ここで照射は、注射の前に6時間行われ、イメージングは​​、注射後20時間で行われる。 <ol><li>尾静脈を血管拡張表示されるまで、暖かい室内（37℃）でマウスを置きます。 </li><li>制止にマウスを移動し、慎重に尾静脈に針をスライドさせます。 </li><li>静脈内に細胞を注入 - 注入への抵抗に遭遇してはならない。 </li><li>細胞は、骨髄空間に移行することを可能にするために、マウスのO / Nのままにしておきます。 </li></ol></li></ol>イメージングのためのマウスを準備する2。 <ol><li>細かい鉗子の1対1の微細ハサミだけでなく、無菌環境での使用前にヘッドピースとストアをオートクレーブ。 </li><li>可能な限り新鮮なように麻酔薬を構成する、（0.38ミリリットルケタミン+ 0.25ミリリットルメデトミジン+ 4.47ミリリットルの水）。注：OTイソフルランおよび他の注射など、彼女の承認された麻酔薬としては、あまりにも効果的であろう。 1時間毎に45分間投与し、50μlの - に記載カクテルは、30のトップアップを、体重10g当たり0.1 mlの腹腔内に投与される。 </li><li>必要に応じてメッセージが表示されたら、ステージを校正、顕微鏡やソフトウェアを起動し、二光子レーザーのスイッチをオンにします。レーザーのスイッチを入れ、それらをウォームアップし、画像化のために、マウスを準備中に安定化させる。 </li><li>腹腔内注射を介して選択された麻酔薬のために準備された麻酔薬の混合物（ステップ2.2）を使用して、マウスを麻酔。今とプロトコルを通じて定期的にペダルレフを経由して深麻酔の開始を監視します。注：マウスは処置を通して注意深く監視し、麻酔を軽量化しているように見える場合は、しなければならない - （2.2で詳述）（通常は後に45〜60分）後、トップアップ用量を投与。異なる年齢と性別のマウスの間にいくつかの変化を期待しています。それはimporです適切な予防策を確実にするために、お近くの獣医官による麻酔プロトコルを議論するために重要、マウスの福祉を確保するために取られる。 </li><li>マウスの目にはどんなエタノールを取得しないよう確保し、組織上の70％エタノールで頭皮の上部を綿棒。 </li><li>滅菌ピンセットやハサミを使って、慎重に画像化される頭蓋冠面積を露出するように頭皮の中央部分を削除します。ピンセットで皮膚を持ち上げて耳の間の頭の後ろに小さな切開を行います。皮膚を上に押しながら、皮膚の下にハサミをスライドさせ、ゆっくりと所望の撮影領域の外側に沿ってカット。 </li><li>湿ったそれを維持するために滅菌PBSで湿らせ、滅菌綿棒を用いて露光骨を拭きます。 </li><li>イメージングのための準備ができて、マウスの頭蓋骨にメタルヘッドピースを取り付けます。 <ol><li>それはペースト状になるまで計量ボートに歯科用セメントを適量混合し、すばやくsに付着するヘッドピースの底面に適用されますカル。 </li><li>セメントのセットの前に、マウスの頭蓋骨にヘッドピースを配置し、撮像領域上の任意の歯科用セメントを得るためにわからないこと、それが設定するために、待ちます。 </li><li>湿った頭蓋骨を保持サイト内ハイドロゲルの少量を適用します。 </li></ol></li><li>ホルダーにヘッドピースを取り付け、ネジを使用して所定の位置に固定し、溝がホルダーの切り欠き内に収まることを確実にする。 </li><li>無菌綿棒で頭蓋からヒドロゲルを取り出し、顕微鏡に移す前に、滅菌PBSで洗浄してください。 </li><li>顕微鏡ステージにホルダーを挿入し、マウスの下に加熱マットを置き、直腸温度計プローブを挿入し、粘着テープでステージ上の場所ですべてのものを固定します。 </li><li>彼らは麻酔下ながら乾燥させないことを確認するには、マウスの目に眼軟膏の小滴を置きます。注：麻酔下でマウスが画像化プロセス中にいつでも放置してはいけません。 </li></ol>in vivoイメージング ：高解像度のスタックとタイムラプス獲得<ol><li>接眼レンズを介して、頭蓋骨に焦点を当てています。 <ol><li>精製され、滅菌水で撮像窓を記入し、水浸漬レンズを使用して、それが水滴に触れるようにそれを下げる。 </li><li>光源などの外部ランプを使用して、顕微鏡の接眼レンズを使用して、頭蓋骨の上部に焦点を当てています。 </li><li>中央の縫合糸上の撮像領域を置き、開始位置などの冠状縫合を見つけるために、ヘッドの後方に向かって移動。 </li></ol></li><li>励起と発光テーブルに指定され、関連するフルオロフォアの効果的な励起および検出を可能にするために顕微鏡を設定します。注：LAS-AFソフトウェアプラットフォームを実行して、従来のガルバノスキャンヘッドを備えたライカSP5直立共焦点がここで使用されている間は、手順は簡単に他の顕微鏡/ソフトウェア·プラットフォームで複製することができます。ここで使用されるレンズは、ライカHCX IRAPO L 25X W / 0.95 NA bである他のメーカーのUT同等のレンズは、適切な倍率と高NAで利用できます<ol><li> 512×512ピクセル、400 Hzから解像度にXYの画像だけでなく、3D Zスタックおよび設定された撮像速度の両方をキャプチャするモードにソフトウェアを配置します。注：ここでのセットアップとハードウェアは、620ミクロンの視野をもたらし、これは他のプラットフォームでは異なる場合があります。 </li><li>複数のチャネルは/トラック並びに収集方法は、最低でスタック可能な場合又はフレーム間の設定を変更するように設定されていることを確実に捕捉することがすることができるようにソフトウェアを設定する。各スタックの取得の終了時にレーザ照明のスイッチを切る、3つの独立したキャプチャ設定をセットアップします。注：3つのチャネルが、チャネル間のクロストークを低減するには、この手順のために必要となります。 </li><li>セットアップ2光子のSHG骨信号（840 nm励起、400から440 nmの発光）の最初の順次スキャンの設定。 MPレーザ用のシャッターを開けて、Mを確保25％レーザがオンになって - Pゲインおよびオフセットが正しく設定され、レーザパワーが12.5である。唯一の検出器として適切なPMTを選択し、色を白に変更します。注：使用可能な明るく、より深い信号を達成するために適切なときにフィルターを備えたNDD検出器は、骨の検出に使用されるべきである。 </li><li>リピート組み合わせた自家蛍光のために、GFPチャネルのために使用されるチャネルのセットアップ手順（543 nm励起、560 - 600nmの発光）とDID（633nmの励起、650から720 nm発光）は、第2の設定では、2つの適切な光電子増倍管を利用して、スキャンします。 DIDのための自己蛍光と赤緑色にチャンネルカラーを変更します。注：自家蛍光チャネルは2つのチャネルがオーバーレイされているDID陽性細胞の検出を容易にすることができますように、緑を用いて - 自家細胞による両方のチャネルのしばらくあることにイエロー/オレンジ色に表示されてなかった細胞は、それらがのみに表示されるので、赤で表示されますチャンネルをしました。自己蛍光チャネルユーザは、このGFPチャンネルとの混同を避けるために、表示目的のため異なる色に変更することができることを望むしかし場合のみ、この比較のために使用され、任意の最終的な分析で使用されていない。 </li><li>最後に、セットアップGFPについて3番目と最後のスキャン（488 nm励起、500から530 nmの発光）;必要に応じて、シャッターが開いていることを確認してから約15％まで488nmのレーザー線または使用されているレーザーのための適切なレベルのレーザパワーを設定、唯一の活性検出器として適切なPMTを選択し、緑色の擬似カラーを変更します。 </li><li>選択したチャンネルのプレビュースキャンを開始し、検出器利得を調整し、最適な露出のためにオフセットするように「ライブ」の撮像モードを有効にします。シーケンシャルウィンドウ内の各スキャンのためにこれを繰り返します。 </li><li>簡単に再利用するため、これらのマルチチャンネルスキャンの設定を保存します。注：これは、ユーザーが以降のセッションの設定を再ロードすることができます。 </li></ol></li><li> 「マークAと呼ばれる多位置キャプチャを活性化するND実証ソフトウェアで「検索し、座標点をリセットします。 </li><li>中央と冠状縫合の交点から出発して、骨の撮像領域をスキャンし、両方の自己蛍光を使用して、骨髄領域の深さをスキャンする（疑似緑色）とDID（疑似色の赤）複合ビューで。注：自家細胞は、両方のチャネルに存在することと、標識された細胞は、合成画像内の赤のみのセルとして表示されますDIDのに対し、合成画像において黄/オレンジ色が表示されます。 </li><li>細胞が検出されるとマークとの検索」ウィンドウ」の左側に新しい位置のアイコンを追加」をクリックすることで、新たな座標位置（x、y、およびz）としてこれをマークする「Markと検索」ツールを。 </li><li>現在の視野が検討されている場合には、アップ/ダウン/左/右どちらかのステージを1つの視野の距離を移動します。次第に目の左に全体イメージングウィンドウ領域の周囲で作業を、各視野のためにこのプロセスを繰り返しE中央縫合糸、マウスの鼻に向かって移動。中央縫合分岐が見えになると、縫合糸の右側に移動して（ すなわち 、冠状縫合に向かって）逆方向に、左側をスキャンする手順を繰り返します。マーク &#39;Markと検索]ツールを使用して、関心のある任意の新しいセルの座標。 </li><li>撮像窓のスキャンが完了すると、「マークし、Find &#39;を使用ポイントをレビューするためのツールを（所望の点を選択して、個別に各ポイントを確認）。各位置のための各セルの周囲Zスタックの上部と下部を設定し、（多くのソフトウェア·プラットフォームを使用すると、空の領域をキャプチャ低減し、各位置のための独立したZ-スタックを実行できるようになります）。各ポイントでは、最大焦点を当て、ダウンして、3Dのzスタックキャプチャの上部と下部のZ位置を設定し、「Markと検索 &#39;内の個別のポイントを更新。 5μmのにzスタック間隔を設定し、適切な品質への各シーケンシャルスキャンチャネルごとに平均化：ラインORフレームの平均。 NOTE：収集時間の長さの平均増加するスキャンの数を増やす。 </li><li>全体スキャン手順を開始することにより、各関心点に対して、高品質の基準スタックを取得する（多くの場合、かなりの「キャプチャー」よりも「開始」と呼ばれる）。注：このスキャンは、将来の高速撮像のための基準として作用することができる。 </li><li>一度高品質なスキャンが終了し、捕獲のためのタイムラプス設定を有効にします。 </li><li>タイムラプスの設定では、所望の長さ（ 例えば 5時間）に5分の時間間隔と全体の実行時 ​​間を設定します。全体的なスキャンにこれらの設定を適用]。注：5分の経過時間間隔を許可するには、このスキャン時間を短縮するために、人は、平均化に使用されるスキャンの回数を減らす512×512ピクセルの解像度を制限し、必要な位相補正を（双方向に走査変換する必要があり）両方のスキャン方向を揃える、かつ/または600 Hzまたは以上（600人以上にスキャン速度を向上させるHz）は実証したソフトウェアプラットフォーム用の撮像領域のズーミングが発生します。これは、シーケンシャル撮像モードが最初に高品質の画像スタックを取得するために使用しながら、同時取得をタイムラプスイメージング中の速度を増加させるために使用されることに注意することも重要である - これは余分な配置チャンネル間の若干のクロストークを生じ得る正確に分離されたリファレンス·スタックの最初のキャプチャを重視。 </li><li> （実証ソフトウェアの「スタート」ボタンをクリックして以前のように）イメージングを開始。注：乾燥してバイタルサインおよび加熱パッド温度を監視しません定期的に、必要​​なときに、マウスを過剰摂取にならないように注意しながら、さらに少ない用量を投与することにより麻酔の適切なレベルを維持する目標を確実にするために水を補充するようにしてください全体に。 </li><li>終了したら、ホルダーからレンズを調達した後、直腸プローブおよびhからの配線を確保し、顕微鏡ステージからホルダーを取り外すマットを食べて損傷していない。 </li><li>ステージホルダーからヘッドピースを外し、慎重にマウスを取り外します。頸椎脱臼を使用して、マウスを淘汰し、頭蓋骨から、それをスナップすることにより、メタルヘッドピースを削除します。ディスクにデータを保存し、後で分析するために、サーバに転送します。注：ヘッドピースは、理想的には数時間をアセトンに浸漬し、最終的に残留セメントをオフに擦ってクリーニングされる。 </li></ol>

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There is nothing to disclose.

何が達成された？ プロトコルは、精製されたFACSの移動を監視するために、マウス頭蓋冠骨髄におけるex vivoで標識された、移植されたHSPCsをタイムラプス多次元イメージングを使用しています。単一の移植された細胞の同定が達成されており、これらは高精度に時間（hr）を長期間にわたって監視されている。呼吸誘発性運動アーチファクトが最小化され、細胞が繰り返し延長された時間経過にわたって再イメージされています。 今後の方向性は何ですか？ 技術の開発を短縮し、注意してください（マウス用リカバリプロセスを簡素化するために一週間以上かかるイソフルランなどのガス麻酔薬の使用の過程で、複数の日に撮影を可能にするために、回収実験に向けて進行できます。回収実験は、厳密に必要と無菌手術条件および適切な鎮痛薬の投与）。開発in vivoでの染料の大きなカラーパレットだけでなく、また、多標識実験を容易に骨髄内の細胞間相互作用により多くの洞察を提供し、将来的にはより複雑な実験を可能にする、造血細胞の効率的な遺伝標識elopment。さらに、複数の骨髄構造および間質成分の同時標識はHSPCニッチで起こるイベントのより完全な像を提供する。タイムラプスムービーの画像安定性は、さらに、顕微鏡の安定化、ならびに画像レジストレーションアルゴリズムを用いて試料とpostacquisitionに温度勾配を最小化することによって買収前を向上させることができた。 制限事項 ： 記載されている技術には、いくつかの制限を提示します。注射用麻酔薬の投与後のマウスの生存率は予測不可能であり、それはに対する個体の応答に応じて合併症を経験することは非常に容易である麻酔薬。マウスを麻酔から回復するために一般的に、撮像セッション長く、困難であり、それは、マウスは、理想的には、タイムラプス撮影の継続時間を制限する、回収される場合に慎重に計画することが重要である。注射用麻酔薬の使用は、各撮像セッションが続くことができる時間を制限する。それは麻酔薬のより少ない用量を再投与することによって麻酔を延長することが可能であるが、それは困難であり、正確かつマウスを過剰投与、これを実行するin vivoイメージングの早期終了の最も頻繁な原因の一つである。イソフルランの&gt; 2時間長い投与はめったに成功した後のガス麻酔は、マウスのしかし急速な回復、低毒性で、より長い初期撮像セッションが可能になります。技術の別の制限は、迅速に画像を取得する必要性、多点タイムラプス撮影中に得られる画像の解像度が限られている。焦点ドリフトやフィールドと相まってこれは、（ディスクをジャンプ上記ussed）、細胞の追跡を困難にすることができます。 代替的な方法と比較： HSPCsは通常DID親油性色素で標識されているが、[16]で検討としてDIRとのDiI色素には、同等の代替及び他の細胞色素は限り、十分に明るい使用することができます。 DIDの細胞のex vivoで標識化HSCの長期的な機能に影響を与えないことが示されているにもかかわらず、それがDID制限（または任意の他の化学色素）を有し、細胞分裂の際に希釈される。 HSCは、移植後最初の日の間に増殖しているので、これらの細胞のための信号対雑音比が急激に劣化する。遺伝子操作蛍光タンパク質の発現による細胞の内因性標識は、蛍光タンパク質は、頭蓋骨を通して検出可能なシグナルを生成するために十分に高いレベルで発現される限り、実行可能な代替法である。代替？と思ったらがいくつかあります骨髄空間内HSPCsの撮影を行うために利用可能iques、独自の利点と限界を持つ各。共焦点画像は、外科手術用ドリルで骨エナメルの脛骨および薄化の外科的露出に追従して、[8]長骨における骨髄再構成のイメージングのために許可された光ファイバベースのイメージングデバイスを挿入する[12]内に存在するHSPCsの詳細な画像を生成し長骨の周辺領域。しかしこれらの方法は、はるかに侵襲ここで説明するので、同じマウス内の同じ骨髄エリアに焦点を当てたイメージングセッションを繰り返すことが許可されていないものよりもある。また、これらの技術は、周囲の組織に豊富な損傷に応答不可避与えられた観察細胞に影響を及ぼす可能性がある。 HSPCsしかしHSPCs上の組織のこの過酷な準備の影響はクレアではないが、[11]切除した、骨折した大腿骨の上に配置されたカバースリップを通して短期間に結像されていますrおよび技術は、単一時点の観測を得るために一意的に使用された。固定された骨は染色され、連続切片に区分し、得られた画像は、血管のキャストを使用する特に優れた3次元分解能を提供する、3Dモデルに再構築された[17]は 、最近レーザー走査サイトメトリー（LASC）定量得るために使用されている免疫染色によって強調され、その場で HSPCs約措置、[18]が、細胞の挙動についての時間的情報を提供することはできません。したがって、骨髄と相互作用HSPCsの長期モニタリングを達成するために理想的なアプローチを提供し、この新たな技術に記載された技術は、4Dで細胞を監視するために、3D、十分な時間的サンプリングで良好な解像度との組み合わせを提供し、それらは比較的非侵襲的である微小環境。

幹細胞ニッチは、嗅球、筋線維、毛包バルジまたはCNS脳室下帯4-7として何十年3について認識し、多くの組織において特徴付けされたにもかかわらず、造血幹細胞（HSC）と骨髄微小環境との間の相互作用（ BM）はまだ不十分による直接骨を通る単一の細胞ならびに組織自体の非常に流動性を観察するのが困難に理解されている。これは、異なる細胞型および調節シグナルの複雑なネットワークが休止の間に微妙なバランスの調節に関与することを、アブレーションまたはHSCまたはその微小環境自体の間質細胞のいずれかにおける特定の遺伝子を過剰発現に基づく機能多数の研究を通して、示されたHSCは1-2の、増殖、拡大および分化。 HSCおよびそれらのニッチの間のクロストークは、直接観察を通して深く理解することができる。これはACHですのみならず、顕微鏡の観点で利用可能な技術を組み合わせた高度な画像処理プロトコルの開発にievableおかげで、だけでなく、試料ホルダソリューションと取得ソフトウェアの。 マウス頭蓋冠の骨の骨髄コンパートメント内移植した造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）の単一細胞の解像度のライブイメージングは、移植するHSPCsは、SDF-1およびVCAM-1陽性血管8-9とそのより未熟細胞の近傍に局在することが示された彼らの子孫は10より遠位であるがGFP陽性骨芽細胞（骨芽制限コラーゲン1αプロモーターは、GFPの発現を駆動するCol2.3-GFPトランスジェニックマウス系統）から20ミクロン- 15内に発見された。同様の観察を切開し、骨折した大腿骨11及び薄くtibeal骨12から得られた。頭蓋冠骨髄のイメージングは​​、目の中HSPCsの直接可視化を実現するために最も侵襲アプローチのままEIRネイティブ微小環境。 任意の生標本撮像に起因する試料の移動に不要なアーチファクトを回避することができる限り、サンプルを保持する固有の必要性がある。呼吸は、頭蓋冠、骨髄を撮像する場合に回避する必要があるマウスヘッドの振動運動を引き起こす。彼らは前頭骨を妨げているため、脳のイメージングと電気生理学のために、例えば使用される従来の定位保有者は、頭蓋冠イメージングには適していません。ライブイメージングと電気生理学的研究の13時の苦痛を最小化するために使用したマウスホルダーから出発し、2部品ホルダとの安定したホールド性を確保する大きなアームに接続されたイメージング·ウィンドウを作成するには、マウスの頭部に固定された小片で、開発されました顕微鏡ステージにしっかりと固定している重いベースプレート。まだ所定の位置にヘッドを固定し、十分メートルを排除し、マウスの頭蓋骨にヘッドピースの確保が無料で呼吸を可能にする呼吸によるovements。ホルダ本体にヘッドピースを連結する「鍵と鍵穴」メカニズムは、したがって、手術が簡素化ウィンドウのサイズが最小化ならびに位置決め精度を向上させることができるため、ステージにベースプレートのフィット顕微鏡での正確な位置合わせが可能になります。正確な運動性細胞をモニターするために、多点タイムラプスプロトコル時点間5分間隔で経時的に細胞の追跡を可能にするように設計された。ここでは、ラベルされたDID HSCはcol2.3GFPのosteoblasitcレポーターマウス10,14に注入し、約20時間後に撮像される。設計された、複数の時間の期間にわたって同じ分野の急速な多点タイムラプス撮影を実行するために必要なイメージング設定は詳細に記載されているマウスホルダー。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

静止状態と増殖、自己再生と分化した子孫の生成との間の微妙なバランスにより、造血幹細胞（HSC）は、すべての成熟血液細胞系統の売上高を維持している。特定のHSCの運命につながる複雑な信号の調整は、HSCおよびまだ十分に理解されていない複雑な骨髄微小環境、[1-2]の間の相互作用に依存している。 私たちは、多段階の共焦点およびin vivoイメージング技術における二光子との安定した動物の位置決めのために新たに開発された試料ホルダを組み合わせることにより、高解像度の3D HSPCsを含むスタックとその周囲のニッチを取得し、時間をかけてそれらを監視することができる方法について説明多点タイムラプスイメージングを通して。高精細イメージングは、ex vivoでの検出を可能に骨髄内にある造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）を標識した。また、多点タイムラプス3Dイメージング、Oより速く取得設定でbtained、HSPCの動きとHSPCsと間質細胞との間の相互の相互作用に関する正確な情報を提供しています。 GFP陽性骨芽細胞に対するHSPCsの追跡は、この方法の応用例として示されている。この技術は、マウス頭蓋冠、骨髄空間内の関心のある任意の適切に標識された造血または間質細胞を追跡するために利用することができる。

特注は、頭蓋冠の観察窓を含む高精度なマウスホルダーは致死量の放射線を照射したレシピエントマウス（ 図1A）に注入され、FACS精製された、ラベルされたHSPCsの長期イメージングを可能にする。一般的に、15〜注射後 - 千20標識細胞、8から15の細胞は頭蓋骨の骨髄撮像領域内、通常、次の日認識可能である。特定さHSPCsの4Dタイムラプスムービー（ 図1Cおよび映画）に続いて120μmの厚さ、（ 図1B）、 -ここでは、約90のHSPC含有骨髄領域の単一細胞の解像度の3Dスタックを取得する方法を示します。 歯科用セメントを最適に準備ができていない場合、次善の結果が得られ、例えば、水、非密封領域から漏れる可能性があり、それは、ホルダの上部、レンズが浸漬されていない任意の期間から補充することができるにもかかわらず水の中に黒Fにつながる<html> rames。画像の一部のドリフトが、しかし、それはマウスの進行性の脱離​​につながる、次善のセメント接着によって強調され、セットアップイメージングの摂動によって、突然のジャンプにつながることができ、原因マウスホルダーの材料の熱膨張は避けられないタイムラプス撮影時の焦点。多点タイムラプスイメージングの間にドリフト以前に撮像された位置を再訪するときにも、ステージの動きの不正確によって引き起こされる場合があります。ドリフトおよび経時映画のスタッターアーチファクトが画像レジストレーションアルゴリズムを使用することによって補正することができる。 表1励起および発光の設定を行います。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> カラーチャンネル </td><td style="width:213px;"> 励起 </td><td style="width:208px;"> 放出 </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488nmで</td><td style="width:208px;"> 500から530 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;">自己蛍光</td><td style="width:213px;"> 543 nmの</td><td style="width:208px;"> 560から610 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;"> DID </td><td style="width:213px;"> 633nmの</td><td style="width:208px;"> 640から700 nmの</td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840ナノメートル（MP） </td><td style="width:208px;"> 400から450 nmの</td></tr></tbody></table><img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> マウスの頭蓋冠におけるHSPCsの生体内の4Dイメージングでは 、図1。実験の（A）の概要（B - C）。得られた結果の例、（B）は 、3Dスタックからの2Dスライス（全体の深さは114μmで）、コラーゲン骨（白）からの信号を含む、ラベルされたなかった細胞（赤） 、自家CELLS（黄色）と、骨芽細胞（緑色）。スケールバー：骨芽細胞（緑色）の近くに移行するラベルされたDID HSC（赤色）を示す4Dタイムラプス映画から100μmの（C）は 、2Dスライス。点線は、セルの変位を強調しています。スケールバー：50μmの（B）及び100ミクロン（C）。注：（C）における経時的買収から得ムービーは、ビデオの記事中に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K ビュー.  Imperial College London. 造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。 

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

骨髄の造血細胞のホーミング

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...