This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde, e matriculou-se em um protocolo de cuidado e uso NHLBI animal Comitê-aprovado. Feminino B6.SJL-Ptprc (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6, machos, 6-12 semanas de idade, foram utilizados como dador e receptor, respectivamente. Uma lista de materiais, reagentes, e o equipamento é fornecido na Tabela 1. 1. Lego Transdução de Rato hspCs e Transplante de Medula Óssea Realizar procedimentos descritos abaixo, em um nível de biossegurança certificada 2 (BSL-2) gabinete (cultura de tecidos Hood). <ol><li> Produção de Lego Vetores Encoding 5fps <ol><li> Use o lentiviral &quot;Gene Ontology&quot; (Lego) plasmídeos vetor, cada codifica uma FP diferente de um promotor forte SFFV constitutiva, incluindo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Vênus), a Lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente cedido pelo Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); agora também disponível a partir Addgene 5-7. </li><li> Para produzir vetores de Lego, sementes de 5 x 10 6 células 293T em placas de 10 cm (use 12 pratos para cada vector) 24 horas antes da transfecção em 8 ml de mídia I10 (IMDM suplementado com 10% SFB e glutamina / penicilina / estreptomicina). </li><li> Transfecção das células com fosfato de cálcio, utilizando recomendações kit CAPHOS ligeiramente modificados: <ol><li> Para cada placa de mistura de 15 mg vetor Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmídeos pMD2.G-VSV-G em presença de 50 mL de 2,5 M CaCl2, e adicione água para obter um volume total de 500 ul. </li><li> Plasmídeos de ADN precipitado com 500 ul de 2x HeBS (HEPES-tamponado salino) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente antes de se adicionar a cada placa de células 293T. </li><li> Incubar as células para6 h num 37 ° C 5% de CO 2 incubadora; remover a mídia e adicionar fresco cultura da mídia pós 6 hr transfecção. </li></ol></li><li> Recolher os sobrenadantes da cultura contendo partículas lentivirais de cada placa, por dia, durante 3 dias. Cada coleção sobrenadante dia seguinte adicionar mídia I10 fresco para cada placa. <ol><li> Filtrar através de poros de 0,22 um, piscina e concentrar os sobrenadantes por ultracentrifugação num rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg e 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sobrenadante em 1 ml de meio StemSpan. Alíquota os estoques lentivï¿½icos em 200 mL e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titulação de Lentivirus Determinar o título de partículas vetor Lego em sobrenadantes coletados via quantificação de transdução de unidades / ml, utilizando células NIH3T3. Os títulos de permitir o cálculo do volume de cada sobrenadante vector necessária para resultar na desejada relativamente multiplicidade de infecção (MOI) de alvo experimentalcélulas. <ol><li> Placa de 5 x 10 4 NIH3T3 células por poço (placa de 12 poços) em 2 ml de meio I10 um dia antes da titulação. </li><li> Preparar diluições em série de 5 vezes de sobrenadantes contendo vector em meios I10 suplementadas com sulfato de protamina (4 mg / ml é 1.000x). </li><li> Remova a mídia das células, e substituir por 500 mL de diluições do sobrenadante contendo o equivalente a 2, 0,8, 0,32 e 0,128 l de vírus concentrado. </li><li> Determinar o número (n) de células por poço presentes no momento da transdução, contando também um controlo. </li><li> 6 horas após a transdução, adicionar 2 ml de meio de I10 e incubar durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Colher as células de cada poço utilizando tripsina-EDTA, e determinar a percentagem de células fluorescentes (FP%) através de citometria de fluxo. </li><li> Calcula-se o título como a seguir, a média dos títulos obtidos para cada poço (diluição), resultando num FP% entre 1 e 50%: (título de partículas de vector / ml) = nx% FP / Volume de sobrenadante vetor (ml). Calcule a média dos títulos obtidos para cada diluição, se o FP% é entre 1 e 50%. </li></ol></li><li> Colecção celular Rato, purificação, transdução, e transplantação (mostrado esquematicamente na Figura 1A adaptado de Malide et al. 4). <ol><li> Sacrifício camundongos doadores por um procedimento aprovado. Colheita de medula óssea de membros anteriores e posteriores: dissecar úmeros, o fémur ea tíbia, completamente remover todos os músculos, ligamentos e excesso de tecido a partir de ossos, corte em todo o final de cada osso mais próximo possível para a articulação, e lave a medula óssea de o osso usando uma agulha G 27-0 em uma seringa contendo mídia I10. </li><li> Agregar as células da medula óssea inteiras durante 10 minutos a 500 xg, a 4 ° C e lisar os glóbulos vermelhos duas vezes com 50 ml de tampão ACK. Suspenda as células em 10 ml de meio I10. </li><li> Purificar (Lin @) células progenitoras linhagem negativa com o kit de exaustão de acordo com a linhagem MACS Protoco um kit modificadol: <ol><li> Utilizar 30 ul de microesferas anti-biotina em vez de 10 mL / 10 7 células; concluir as etapas de lavagem com media I2 (IMDM suplementado com 2% de SFB) em vez de tampão. </li><li> Insira uma etapa de lavagem entre a incubação com Cocktail Biotina-Antibody ea incubação com anti-biotina MicroBeads; e equilibrar a coluna com I10 em vez de tampão. </li></ol></li><li> Cultura de células Lin @ de 48 horas, a uma densidade de partida de 5 x 10 5 células / ml em meio StemSpan suplementado com 10 ng / ml de IL-3 murina, 100 ng / ml de IL-11 de murino, de 100 ng / ml humano Flt-3 ligando, e 50 ng / factor de células estaminais de murino ml. </li><li> Transferência de 1 a 4 x 10 5 células de 12 poços para as placas revestidas com RetroNectin e transdução com sobrenadantes LEGO, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 6-7 para alcançar 50% de eficiência de expressão para cada FP, na presença de StemSpan meios de comunicação e citocinas detalhado acima e 4 ug / ml de sulfato de protamina. </li><li> Transduzir célulascom cada vector LEGO individualmente, conforme descrito no passo 1.3.5 e misturar as células a seguir a transdução (denominado mistura) ou co-transdução de células com todos os sobrenadantes 5 LEGO vector simultaneamente (denominados Co). Remover as células 24 horas depois, lave uma vez com meio StemSpan sem citocinas, e ressuspender-los em mídia StemSpan sem citocinas para o transplante, ou transferi-los para meio fresco com citocinas e cultura durante 96 horas adicionais antes de microscopia confocal e citometria de fluxo. <ol><li> Realizar o transplante de medula óssea através da infusão transduzidas Lin hspCs através de injecção na veia da cauda em 11 Gy em dose única receptores pré-irradiadas (6-18 horas antes do transplante) destinatários, em um volume de 100 mL, a uma dose de células por ratinho correspondendo a 1 células -4 x 10 5 Lin @ banhado originalmente para a transdução. Em cada experimento, o transplante um grupo inteiro de animais com a mesma população de células transduzidas de doadores BM. </li><li> Para a caracterização in vitro de transduzidas HSPEs, a cultura das células para um adicional de 4-5 dias em StemSpan suplementado com citocinas e analisar por citometria de fluxo para a eficiência de transdução, e por microscopia para a diversidade de cores. <ol><li> Sacrifício camundongos individuais e recuperar tecidos e órgãos para a imagem latente, em vários pontos de tempo até 120 dias pós-transplante. <ol><li> Spray com etanol a pele do rato e inciso da pele no lado ventral evitar a disseminação de cabelo. </li><li> Dissecar e de consumo de acordo com os procedimentos padrão do baço, nódulos linfáticos poplíteos, pulmão, coração, pele, tecido adiposo, o músculo esquelético, rim, fígado, bem como a cabeça para o acesso a calvária. </li><li> Como alternativa, use calvaria ou criar uma janela óssea para geração de imagens ao vivo várias vezes ao longo do tempo 2,8,9 ou imagem órgãos superficiais, como os gânglios linfáticos da pele e no animal vivo. </li></ol></li><li> Coloque órgãos individuais em 35 milímetros placas de cultura de número 0 tampa de vidro em 50-10056; l PBS para imagens-los intactos, sem corte, fixação ou processamento adicional, tal como descrito no passo 2.5. </li><li> Para imagem volumétrica, manter os órgãos em em PBS frio até o uso. Para imagens de lapso de tempo proceder de imediato a imagens de órgãos em DMEM, 10% FBS contendo HEPES 20 mM a 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. confocal e de dois fótons Microscopia e Análise de Imagem <ol><li> Realizar imagem usando um microscópio confocal cinco canais e multiphoton sistema Leica SP5 equipado com multi-linha Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe e HeNe 633 nm lasers visíveis. Use no modo 2-fótons, um femtosegundo pulsada laser de Ti: Safira (Ti-Sa), ajustável para excitação de 680 a 1080 nm com correção de dispersão. Utilização em experiências envolvendo vermelho-deslocado PQ (tdTomato e mCherry), um oscilador paramétrico óptico (OPO) do laser para alargar a gama de comprimentos de onda de saída, tanto quanto 1,030-1,300 nm, sequencialmente ou em simultâneo com o tele Ti-Sa a laser. </li><li> Imagem de vários tecidos, utilizando um HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objectiva de imersão de água (WD = 2,5 mm), um-PLAPO-CS HC 20X / 0,70 NA objectivo seco (WD = 0,6 mm), ou HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetiva de imersão em água (WD = 0,6 mm). </li><li> Obter espectros de fluorescência confocal coleta de pilhas lambda (xyλ) da luz emitida em 5 nm-bandas do espectro visível a partir de células da BM transduzidas com um único vetor FP Lego, bem como do controle, não-transplantado BM. <ol><li> Processo de imagens com o software v2.4.1 Leica LAS-AF para criar todos os espectros de referência da PQ 5, bem como de autofluorescência (Figura 2A). Usando os espectros FP individual e a diferença no brilho de fluorescência (expressos como% de EGFP) de Cerúlea (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%), situado a 5 canais de imagem sequenciais do seguinte modo: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li><li> Validar a rigorosa separação PQ, como células transduzidas com cada indivíduo FP são visíveis apenas no canal correspondente e ausente do resto (Figura 2C). Além disso, esta abordagem multi-canal definido cria uma única 5-canais &quot;ColorPrint&quot; que permite a análise de cor e posterior acompanhamento clonal e tem a vantagem de reduzir tempos de aquisição em relação a imagem espectral. </li></ol></li><li> Emissão de fluorescência separado, no modo 2-fótons, de elevada eficiência espelhos costume dicróicas e recolher com quatro canais detector não-descanned (NDD) da seguinte forma: um espelho dicróico em 568 nm seguido por um espelho dicróico em 465 nm, seguido por a 452/45 nm filtro de emissão para SHG ou autofluorescência e Cerulean, um filtro 525/40 nm de emissão para EGFP ou Vênus, e um espelho dicróico 648 nm e 620/60 nm filtro de emissão para tdTomato ou mCherry. <ol><li> Revelar informações estruturais por microscopia de dois fótons iimaging contraste ntrinsic (como descrito acima) de autofluorescência tecido de elastina, NADH, (animado em 780 nm), e segundo harmônico sinal gerado (SHG) do osso e colágeno fibrilar (animado em 920 nm ou 860 nm coletados em um back-espalhados direção) 10,11. </li></ol></li><li> Para visualização volumétrica 3D, recolher série de imagens xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 mm 3 de tamanho de voxel) ao longo do eixo z, a intervalos de 5 mm ao longo de um intervalo de profundidades (150-300 um) por toda a medula óssea e outros tecidos, sobre grandes regiões, utilizando a função telha do software para gerar automaticamente volumes que compõem todo um costuradas fossas esterno, aproximadamente 2,5 x 1,2 milímetros 2 (xy) e 300 um (z) (Figuras 2D-2E) e Filme 1. <ol><li> Imagem calota craniana medula diretamente através do crânio, sem o corte 2, 8. </li><li> Seção esterno ao longo do plano sagital (bisection) e depoistransversalmente na articulação entre a imagem 2 esternal fossa e através do corte cara 3,4,12 (Resumo na Figura 1B adaptado de Takaku et ai 3). </li></ol></li><li> Para 4D lapso de tempo, colocar recentemente excisada poplítea nó de linfa, baço, pulmão, ou amostras de ossos de calvária sem cortes para pratos de 35 mm de cultura de número 0 lamela, em 50-100 ul de DMEM, FBS a 10% contendo 20 mM de HEPES a 37 ° C e usar dois fótons Ti-Sa excitação (860 nm), combinada com a excitação confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner de ressonância (8000 Hz / s), tendo z-stacks (~ 80 mm) em intervalos de 20 seg durante até 1 hora. <ol><li> Por três cores de uso de imagem 2P simultânea Ti-Sa sintonizado em 860 nm simultaneamente com o laser OPO (sintonizado em 1.130 nm para tdTomato; ou 1.140 nm mCherry) (Filme 2). </li></ol></li><li> Reconstrução e análise dos volumes 3D e sequências de tempo 4D <ol><li> Use Imaris x64 softwsão a versão 7.6, ou pacotes de software alternativas para transformar os azulejos-stacks de imagens RAW para prestados volume (3D) de dados de células fluorescentes dentro da medula óssea e tecidos diferentes e exportá-los como filmes 3D-rotação, como descrito anteriormente 3,4 (Filme 1) passo-a-passo exemplo: <ol><li> Em Imaris, abra a imagem z-stack; Selecione &quot;Ultrapasse&quot; para exibir a visualização volume 3D. </li><li> Use &quot;navegar&quot; para aumentar o volume em torno de 360 ​​°. </li><li> Selecione &quot;Animação&quot; para criar uma animação; usar quadros-chave para adicionar vistas selecionadas, zoom, rotações de volume; Visualizar o filme, edite como necessário e salvar o arquivo em um formato de filme desejada (ex: avi, mov). </li></ol></li><li> Para a avaliação quantitativa das células e clone de freqüência 3D, posições, tamanhos e distribuição, outro processo de z-stacks, utilizando os módulos Imaris XT que integram aplicações MATLAB realizando distância de mediçãourements (usando um algoritmo de transformação distância) e clusters de análise, como descrito anteriormente 3,4. Transforme as seqüências de pilhas de imagens ao longo do tempo em quatro dimensões (4D) filmes prestados no volume com software x64 Imaris e usar local e análise de superfície para rastreamento semi-automático de motilidade celular em três dimensões utilizando algoritmos de movimento auto-regressivos. </li><li> Realizar análise multiespectral de células da seguinte forma: extrair o multi-color pontos marcados, adicionando todos os 5 canais através de canal aritmética dos Imaris XT em um novo canal; determinar, para todos os pontos (células), a intensidade de fluorescência média em cada um dos canais do componente 5. Exportar os valores em software Excel para plotar gráficos que indicam o &quot;ColorPrint&quot; único ou seja, a relação% de cada FP em cela individual (Figura 2E gráfico). Corrija o conjunto de dados para a deriva de tecidos, e calcular a velocidade da célula e deslocamento ao longo do tempo, os comprimentos de pista, caminhos e distâncias; valores de exportação em Excel software para traçar gráficos. Montar figuras compostas com software Adobe Photoshop CSS 5. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. 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P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow.">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones.">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues.">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui os detalhes de uma metodologia poderosa recentemente concebido para rastreamento de células clonal, combinando a grande diversidade gerada pela marcação com vetores Lego-codificação 5PQ e de imagem com confocal tandem e microscopia dois fótons para alcançar volumétrica e imagens dinâmicas em tecidos vivos combinatória. Isto estendeu o uso de cores baseada em FP marcação gravando confocal identidade espectral em 5 &quot;distintas&quot; canais de 8-bits. Assim, a proporção relativa de Cerule...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

A produção de células sanguíneas, denominado hematopoiese, é mantida por uma pequena população de células estaminais e progenitoras hematopoéticas (hspCs). Estas células residir dentro da medula óssea (BM) em um nicho microambiental complexo que consiste em osteoblastos, células do estroma, tecido adiposo e estruturas vasculares, todos implicados no controlo da auto-renovação e diferenciação 1,2. Como intacta BM tem sido tradicionalmente inacessível para observações diretas, as interações entre HSPC e seu microambiente permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Anteriormente, nós estabelecemos uma metodologia para visualizar a arquitetura 3D da BM intacto usando microscopia de fluorescência confocal e reflexão 3. Foram caracterizados expansão de hspCs EGFP-marcados na MC, mas o uso de apenas um único FP impedida análise de regeneração a um nível clonal. Muito recentemente, aproveitou a Lentivirus Gene Ontology (Lego) vetores expressando constitutivamente flproteínas uorescent (FPS) para marcar de forma eficiente as células 4,5. A co-transdução de HSPC com três ou cinco vectores gera uma paleta de cores diversas combinatórias, permitindo a localização de vários clones de HSPC individuais. Marcado HSPC combinado com nova tecnologia de imagem permitido traçar homing indivíduo HSPC e enxerto na BM de ratos irradiados. Vetores Lego foram usadas para marcar HSPC com 3 ou 5 fps diferentes (de Cerulean, eGFP, Vênus, tdTomato e mCherry) e seguir o seu enxerto ao longo do tempo na BM por microscopia confocal e dois fótons, que permite a visualização nítida de ossos e outros estruturas de matriz, e a relação de clones HSPC de componentes do seu microambiente. HSPC foram purificados como a linhagem de células negativas de camundongos C57BL / 6 BM, transduzidas com vetores de Lego, e infundidas por injeção na veia da cauda em ratos congênitas ablated-mielo. Através do monitoramento de grandes volumes de tecido esterno BM visualizamos o enxerto intra-ósseo que ocorre no inícioBM regeneração. Grupos de células com espectros cor diversificada, parece, inicialmente, em estreita proximidade com o osso e progrediu centralmente ao longo do tempo. Curiosamente, após mais de 3 semanas, a medula consistiu de aglomerados clonais macroscópicas, sugerindo propagação da hematopoiese derivado de hspCs individuais contiguamente na medula, em vez de difusão generalizada de hspCs através da corrente sanguínea. Havia menos diversidade de cores em pontos de tempo de atraso, sugerindo dificuldade na transdução de longo prazo repovoar células com múltiplos vetores. Além disso, hspCs aglomerados formados no baço, um órgão também responsável para a hematopoiese em ratinhos. Células individuais derivadas de HPSC poderia ser resolvido no timo, nódulos linfáticos, baço, fígado, pulmão, coração, pele, músculo esquelético, tecido adiposo, e renal bem. As imagens em 3D pode ser avaliada qualitativamente e quantitativamente a apreciar a distribuição de células com perturbações mínimas dos tecidos. Por fim, ilustramosd a viabilidade de estudos dinâmicos ao vivo em 4D, combinando multiphoton digitalização ressonante e confocal de imagem time-lapse. Esta metodologia permite que não-invasivo de alta resolução, multidimensional célula-destino traçado do espectro marcados populações de células em sua arquitetura intacta 3D, fornecendo uma ferramenta poderosa no estudo da regeneração de tecidos e patologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Production of viruses</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-Cer2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27338</td>
			<td>Expression of Cerulean</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-G2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">25917</td>
			<td>Expression of eGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-V2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27340</td>
			<td>Expression of Venus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-T2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27342</td>
			<td>Expression of tdTomato</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-C2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27339</td>
			<td>Expression of mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Calciumm Phosphate Transfection Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAPHOS-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Tissue culture dish</td>
			<td style="width:493px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:216px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">IMDM</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pen Strep Glutamine</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">SW28 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">L60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um)</td>
			<td style="width:493px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:493px;">Quality Biologicals Inc.</td>
			<td style="width:216px;">118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LS columns + tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pre-Separation Filters (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:493px;">StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc&#160;</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">murine IL-11 CF</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>418-ML-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine SCF</td>
			<td style="width:493px;">RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&#160;</td>
			<td>RDI-2503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>403-ML-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">FLT-3 Ligand</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-096-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">12-well plates, Costar</td>
			<td style="width:493px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:216px;">3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Retronectin</td>
			<td style="width:493px;">Takara Bio Inc</td>
			<td style="width:216px;">T100A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Protamine Sulfate</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Confocal and two-photon microscopy</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">DMEM</td>
			<td style="width:493px;">Lonza</td>
			<td style="width:216px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:493px;">Cellgro, Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:216px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Imaris software version 7.6</td>
			<td style="width:493px;">Bitplane</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

Nós desenvolvida e validada uma metodologia de marcação para rastreamento clonal de células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) com alta resolução espacial e temporal para estudar in vivo hematopoiese usando o transplante de medula óssea de camundongos modelo experimental fluorescente. Marcação usando lentivirais que codificam proteínas fluorescentes (FPS) combinatória genética permitem o mapeamento do destino da célula através de imagens de microscopia avançada. Vetores que codificam cinco PQ diferentes: Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato e mCherry foram utilizados para a transdução simultaneamente hspCs, criando uma paleta variada de cores de células marcadas. Imagem por microscopia confocal híbrido / two-photon permite a avaliação alta resolução simultânea de células marcadas com exclusividade e seus descendentes em conjunto com os componentes estruturais dos tecidos. Análise volumétrica ao longo de grandes áreas revelam que as células derivadas de HSPC espectralmente codificados podem ser detectados de forma não invasiva, em vários tecidos intactos, incluindo a medula óssea (BM), Por extensos períodos de tempo a seguir ao transplante. Estudos ao vivo combinando multiphoton taxa de vídeo e confocal de imagem time-lapse em 4D demonstrar a possibilidade de rastreamento de celular e dinâmica clonal de uma forma quantitativa.

Whole-mount 3D confocal / 2 fótons reconstruções de microscopia do curso esternal tempo de medula óssea revelou o enxerto e expansão de transplantados co-5fps em um padrão com características marcantes: clones apareceram claramente delineados, de forma homogênea marcado com ampla paleta de cores inicialmente e progresso ao longo do tempo para conter preferencialmente células de uma grande parte da cor. Configuração microscopia confocal e exemplos representativos de imagem 5ips-HSPC marcado na medula óssea do...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K visualizações.  NHLBI/NIH.  Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante. 

Vídeo: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.