We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1マニュアル抽象モデル生成注：以下に記載される方法論の詳細はキメラに特異的であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。唯一の目的ではなく、オブジェクトのボリューム形状を表示する場合に比べ、幾何学的な測定を行うために、幾何学的モデル（ 例えば 、ボールとスティックモデル）を作成するときに、この方法を使用します。 <ol><li>マニュアル抽象化モデル生成のための適切なプログラムにデータボリュームをインポートします。 <ol><li> [ファイルを開く]ダイアログをプルアップするファイル]&gt; [ 開くマップを選択します。目的のマップのファイルの場所に移動します。 </li><li>異なるレンダリングスタイルを持つデータを表示するボリュームビューア（[ツール]&gt; [ボリュームデータ &gt; ボリュームビューア ）を選択特長 &gt; 表示スタイルの引き上げます。 </li><li>ボリュームビューアでヒストグラムに垂直バーをドラッグして表示するためのしきい値を調整しますウィンドウ。 </li></ol></li><li> 3Dボリュームをナビゲート（ 例えば 、スライスによるスライス）がセグメンテーションのための関心領域を選択し、必要に応じてより小さなサブボリュームをトリミングします。 <ol><li>ボリュームビューア]ダイアログで、X、Y、またはZを選択し、Axisをクリックします。 </li><li>ボリュームビューア]ダイアログボックスで、[ 機能 ]&gt; [ 飛行機 。左のボックスの数値に対応する平面を表示するように深さを設定するために一つをクリックして、すべての面を表示するには、[すべて ] をクリックします。 </li><li>ボリュームビューア]ダイアログボックスで、[ 機能 ]&gt; [ メコン選択 。 <ol><li>関心領域の周りに長方形のボックスを作成するにはクリックしてドラッグします。 </li></ol></li></ol></li><li>関心のある特徴に沿ってマーカーを置き、モデルが完了するまで（多くの場合、プログラムによって自動的に行われる）適切なリンカーを接続します。 <ol><li>ボリュームビューアのメニューバーから、[ツール]&gt; [ボリュームトレーサダイアログがボリュームトレーサ]ダイアログを開きます。ボリュームトレーサ]ダイアログで、[ファイル ]&gt; [ 新規マーカーセット中。 </li><li> 連続して選択されたマーカーをボリュームトレーサ]ダイアログで、、、高品質のデータ·プレーンの上に置いてマーカーをマウス &gt; 置きマーカーを確認し、選択マーカーにマーカーリンク新しいマーカーを移動し、サイズ変更 、およびリンク 。 </li><li> マーカー色見本をクリックし、色を選択します。 リンクの色ごとにこの手順を繰り返します。 </li><li>マーカーおよびリンクモデル構築要素のための半径を入力します。 </li><li>ボリュームトレーサ]ウィンドウで、[右]マウスボタンを使用して置きマーカーを選択して、マーカーやリンクのための半径を挿入します。 </li><li>右のマーカーを敷設を開始するボリュームデータをクリックしてください。マーカーは自動的に接続されます。 </li><li>ボリュームトレーサ]ダイアログで、[ ファイル ]&gt; [ 現在のマーカーセットを保存し 、その後&gt; 閉じるマーカーセットファイル 。 </li></ol></李&gt; <li>興味のある第2の所望の特徴にモデルの構築を開始するために、新しいマーカーセット（ステップ1.3.1）を開きます。特徴の違いを強調するために、マーカーセット間の対照的な色を利用している。 </li></ol>関心のある特徴2。手動トレース注：以下に記載される方法論の詳細はアミラに固有であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。人口密度が比較的小さく、特徴抽出の精度が最優先事項であるとき、マニュアルトレースのように時間のかかるアプローチであるときに、このアプローチを使用する。 <ol><li>マニュアルトレースオプションを使用してプログラムにインポートボリュームデータ。この機能を持つソフトウェアは、一般に、少なくとも基本的なブラシツールを提供します。 <ol><li>大量または断層像では（ 例えば 、16ビットの2048 X 2048以上.recまたはIMODに.mrc生成された断層像）：[開く]を選択しデータ &gt; filename.rec&gt;フォーマットを右クリックして...&gt; LargeDiskDataとして生を選択 </i&gt;&gt; OK&gt;ロード 。 OK&gt;ヘッダ情報から、適切な生データのパラメータを選択します。新規として切り替えて、 保存 <a href="http://filename.am/">filename.amの</a>は、以下の手順で使用するためのファイル。 </li><li>小さ ​​い3D画像スタックファイルの場合（ 例えば 、3次元.TIFまたは.mrcまたは.rec）： オープンデータ &gt;を選択filename.tifまたはfilename.mrc。 名前を付けて保存を切り替え、右クリック&gt; <a href="http://filename.am/">filename.am</a> 。エラーが発生したか、プログラムが応答しない場合、ファイルが大きすぎていてもよく、ステップ2.1.1に従うことによって開くことができる。 </li></ol></li><li>分割のための3Dサブボリュームを選択したスライスをナビゲートしてから、関心のあるこのエリアに切り抜く。 <ol><li> 3Dビューアウィンドウでは、画像ファイルを開くにはOrthosliceを選択します。スライスを移動するには下部にあるスライダを使用してください。 </li><li> &gt;プールウィンドウでファイル名トグル、LargeDiskDataとして開かれ、より大きなデータをトリミングする権利&gt; LatticeAccessをクリックします。エンテrは希望ボックスサイズ&gt; 適用します 。新しいファイルを保存します。 </li></ol></li><li>セグメンテーションファイルを作成します。 <ol><li>プールウィンドウでファイルを切り替え&gt;右&gt; ラベリング &gt; labelFieldプロパティ ] をクリックします。新しいファイルが作成され、自動的にセグメンテーションエディタ]タブにロードされます。 </li></ol></li><li>手や使用するソフトウェアに固有のコマンドを使用してトレースを埋めた後、目的の第一の特徴の境界をトレースします。すべてのスライスを通じて関心特徴に従って、マニュアルトレースセグメンテーションを繰り返します。アミラを使用して次のコマンドを使用します。 <ol><li>ペイントブラシツールを使用するには、必要に応じてブラシのサイズを変更し、関心のある特徴の境界をトレースするには、マウスポインタを使用しています。 </li><li>ショートカット「F」と、トレースエリアを埋める。プラス記号の付いたボタンをクリックすることで選択範囲を追加するか、ショートカットの「a」。必要に応じて、Enterキーを押し、「U」は取り消し、および「S」を減算または消去することができます。 </li></oL&gt; </li><li>可視化と基本的な定性的またはソフトウェアユーザーガイド命令あたりの定量分析のための表面レンダリングを生成します。 <ol><li>オブジェクトプール]タブで、右&gt; SurfaceGenクリック&gt;プール·ウィンドウにファイル名-labels.amを切り替えます。 </li><li>所望の表面のプロパティを選択&gt; 適用します 。新しいファイルfilename.surfはプール内に作成されます。 </li><li>セグメント化されたボリュームを視覚化するために、プール·ウィンドウにfilename.surf切り替える&gt;右&gt; SurfaceViewをクリックします。 </li><li>移動、回転、3Dボリュームにズームする3DViewerウィンドウのツールを使用してください。 </li></ol></li><li>正確な密度を抽出し、ボリュームや表面積などの測定値を決定する。より高度な表示、解析およびシミュレーションのための他のプログラムにエクスポートします。 <ol><li> 3DViewerウィンドウで、 適切なオプション （2Dの長さと2次元角度測定のための単一の2D平面上に、3Dの長さと3Dの角度を選択 &gt; 計測ツールをクリックします3Dボリュームの測定のために）。 </li><li>希望の長さ、距離、角度を測定するためにメッシュサーフェスをクリックします。値は、[プロパティ]ウィンドウに一覧表示されます。 </li></ol></li></ol> 3自動密度に基づくセグメンテーション注：以下に記載される方法論の詳細はアミラに固有であるが、他のソフトウェアパッケージを用いてもよい。 <ol><li>興味のある密度を撤回する、コントラスト、鮮明さ、または混雑のいずれかさまざまなデータセットで、この方法を使用します。 </li><li>自動セグメンテーションのためのしきい値、魔法の杖、または他の密度ベースのツールを装備したプログラムにインポートボリュームデータ。マニュアルトレース用の方向に2.1-2.1.2で説明されている手順に従ってください。 </li><li>スライスをナビゲートし、セグメンテーションのための領域を選択します。必要な場合には、セグメント化のためのより小さな3Dサブボリュームを切り取る。マニュアルトレース用の方向に2.2-2.2.2で説明されている手順に従ってください。 </li><li>の濃度を選択します通常機能のマークまたはアンカーポイントをクリックするか、配置することによって、目的の機能、。ソフトウェアで許可された場合は、その機能のピクセル強度を包含する番号の範囲を入力し、必要に応じて、この許容値を調整します。機能に属する密度は、アンカーのピクセルまたは許容値の強度に合わせてピックアップされます。アミラを使用する場合は、次のコマンドを使用します。 <ol><li>識別可能なマージンの機能に魔法の杖ツールを使用してください。 <ol><li>機能が完全にハイライト表示さ​​れるように、正しい値の範囲をキャプチャするためにディスプレイとマスキングでスライダを調整した後、関心のある領域をクリックします。ショートカットの「a」で選択範囲を追加します。 </li></ol></li><li>明確に区別余白せずに機能するためのしきい値のツールを使用してください。 </li><li>しきい値のアイコンを選択します。関心のある特徴のみがマスクされるように、所望の範囲内で濃度を調整するスライダを調整します。 [選択]ボタンをクリックし、ショートカットで選択範囲を追加する220; A」。 </li><li>セグメント全体のボリュームに、選択範囲を追加する前に、 すべてのスライスを選択します。 </li><li> 、ノイズを除去するセグメンテーションを選択&gt; 諸島および/ ​​またはセグメンテーション &gt; スムーズラベルを削除する。 </li></ol></li><li>マニュアルトレースセクション2.6-2.6.2で説明したように可視化および定性分析のための表面を生成します。必要に応じて、適切な3D表示、定量分析やシミュレーションのための他のプログラムにエクスポートする。 </li></ol> 4。カスタム仕立ての自動セグメンテーション注：コンピュータサイエンスのバックグラウンドでの経験を必要としますが、大容量の精密な密度モデルを作成する機能を可能にする自動セグメンテーションのためにカスタマイズされたスクリプトを作成するには、この方法を使用します。 <ol><li>ツール（MATLAB 27シェイプ教師付きセグメンテーションの具体例） <ol><li>画像前処理：雑音除去、背景除去及び画像強調を実行する次のパイプラインを使用することにより： <ol><li> 関数imreadコマンドを使用してイメージをロードします。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt;イム= imreadは$のIMAGE_PATHを分析しようとするイメージの場所です（$のIMAGE_PATH）。 </li></ol></li><li>画像処理ツールボックスから、推定または既知のノイズパワー対信号比（NSR）を使用して、ウィナーフィルタを呼び出します。 </li><li>以前に処理された画像上で、その後、背景レイヤーを推定するためにimopen画像opening関数を呼び出して別のマスクとして成果を割り当てる。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します。&gt;&gt;背景= imopen（イム、STREL別（$ shape_string、$サイズ））、この方法では、$ shape_stringはサイズがアナライザによって与えられている変数$ &#39;ディスク&#39;に等しく、 すなわち &gt;&gt;背景= imopen（イム、STREL（ &#39;ディスク&#39;、15））。 </li></ol></li><li>背景がフィルタリングされた画像を引きます。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; IM2 =イム -背景</li></ol></li><li>結果の質に応じて、画像処理ツールボックスから関数関数imadjustを使って呼び出すことができ、適応大津の方法28の有無にかかわらず、画像の正規化を行う。 <ol><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; IM3 =関数imadjust（IM2） </li></ol></li><li>正規化された画像をトリミングすることにより、関心領域を制限する、セグメンテーションのために関心のある特徴を準備します。 <ol><li> &gt;&gt; im3_crop = imcrop（IM3、[X1、Y1×2 Y2]）、ベクトル[×1 Y1×2 y2は]に対応：imtoolコマンドを使用して、トリミングされ、コマンドに座標を提供することにある関心領域を探索クロップされる正方形の領域。 </li></ol></li></ol></li><li>認識/教師形状分類形状：オブジェクトのそれぞれ異なるカテゴリの具体的な例（関心のある特徴を横断2D画像における線形トレース）を提供することによって、アルゴリズムを訓練。 <ol><li> VLFEAT 29 APIが正常にインストールされていることを確認し、より詳細な資料についてはVLFEATのホームページをご利用ください。 </li><li>コマンドラインでは、次のように入力します&gt;&gt; [TREE、ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop、$ K、$ NLEAVES）$ Kを使用するためにクラスタの数や観察者が中にデータを配置したいクラスの数であり、と$ NLEAVES すなわち &gt;&gt; [TREE、ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop、4,100）リーフクラスタの所望の数である</li><li> VLFeatの入力として手動でセグメント化された機能を使用してください。 注：このオープンソースのCベースライブラリは、ピクセルのパッチ、パッチクラスタ化、およびデータセットに最適に動作するように選択した方法の種類に応じて、クラスタ中心の位置決めを行います。利用可能なオプションは、ベースをテキストンでk-平均クラスタリングの範囲に30に近づき、出力は特徴が与えられた手本に基づいて、所望記述する数値配列です。 </li></ol></li></ol></li><li>セグメンテーション：このFUを使用してくださいLLYさらなる可視化と分析のための独立したマップとして書き出されます同時にオブジェクトのセグメント複数のクラスに計算コストが高い、アプローチが、自動化された。 <ol><li>以前に生成された数字の配列（モデル）をロードします。 </li><li>モデル入力としてセグメント化される画像を用いて、VLFeatにおけるサポートベクトルマシン（SVM）関数を呼び出す。 <ol><li>コマンドラインで次のように入力します。&gt;&gt; xは、元の画像im2_cropとyをトリミングさ= vl_svmtrain（X、Y、0.1）、[B、W]対象画像、手動でセグメント化された画像である。クラスタリングによって生成されたラベルに従って結果を着色する&gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG（I、ラベル）を使用します。 注：モデルの特性に基づいて、VLFeat最初から割り当てられたクラス（関心のある特徴）の数に画像を分類する。所望の精度の程度に応じて、他のアプローチまたは推定CLUSTこの方法を組み合わせることが可能であるそのような船体とクラスタ中心として小胞体パラメータ。 SVMアルゴリズムの出力は、確率モデルと新たなデータセット中の所望のクラスの複数のバイナリマスクである。 </li></ol></li><li>コマンドを入力して、結果を保存：$フォーマットが &#39;いさかい&#39;と$ filenameは、出力ファイルのパスです&gt;&gt; imwriteは（IM、$フォーマット、$ファイル名）。 </li><li> &gt;&gt; imshowは（IM）：画像を可視化するために、コマンドを入力します。 </li></ol></li></ol>

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C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

伝統的に、電子顕微鏡（EM）フィールドが1に分割されている）は、典型的に有する高分子複合体の三次元（3D）構造を調査するために平均化暗黙的または明示的なデータと組み合わされ、高、超高分解能TEMを用いた構造生物学支店定義された組成と、典型的には、比較的小さなサイズ1-4、全体の細胞風景が1,5,6を可視化されている2）細胞イメージングブランチ。構造生物学の枝が最後の40年間の壮大な発展を遂げてきたが、細胞生物学の枝は主に、多くの場合、より少なくより最適に保存されたサンプルに、2次元に限定されていた。だけ過去10年間電子線トモグラフィーの出現により、細胞生物学的な超微細構造イメージングは、一般的に平均化が細胞の風景のように行うことができないので、関心のある特徴は、一般的にユニークである三次元5,7へと拡大してきました。 可視化され、携帯のシーンは、多くの場合、目には美しいですが、正確なタンパク質組成は通常不明であるため、関心とそのような高度に複雑な細胞容積のその後の定量分析の特徴を効率的に抽出は、したがって、それが困難なこれらの細胞を解釈すること、部分的には、遅れ3Dボリューム。この今日まで、広範囲の生物学的専門知識は、多くの場合、複雑な断層像を解釈する、あるいは3Dボリュームに重要な領域とを必須成分を特定するために必要とされる。さらに合併症として、3次元ボリュームの可視化は著しく非自明です。 3Dボリュームがあると考え、したがって、2D画像のスタックとして視覚化することができる。シーケンシャル2D画像のスライスごと検査は複雑さを軽減し、それはまた、限界が2次元に抽出し、このようにして定量分析を備えています。しかし、ほとんどの3Dオブジェクトのために、3Dボリュームの描写は、単に連続した平面のスタックは不完全につながる特定のシステムの3D自然に歪んだ視点はd。目視検査の代替モードは、携帯の頻繁に密な自然に与えられたいずれかのボリュームレンダリングやサーフェスレンダリング、必要とするボリュームを、することができますので、インタラクティブな手動セグメンテーションを困難にし、簡単にネストされたオブジェクトの妨げビューにつながるか、完全にユーザーを圧倒する。 、自動化された特徴抽出（セグメンテーション）の多種多様なこれらの障壁を改善するためのアプローチは密度-又は勾配ベースの8-10のいずれか、典型的には開発されてきた。しかし、これらの方法にかかわらず、いくつかの最近の方法は、アクチンフィラメント11のような関心のある特定の機能をターゲットにすることができますが、専門家にとって関心のある地域や特徴のセグメントにボリューム全体を傾向がある。流域immersioを適用する場合に加えて、自動化されたセグメンテーションを実行するプログラムは、時にはサブボリューム（ 例えば 、多数の産生をもたらすことができ多くの場合、関心の全機能を含む、またはさらに細分化を施しても中に手動でバックマージする必要のnセグメンテーション）。これは、このように、ほとんどのレンダリングコンピュータアルゴリズムを忠実に関心のある特徴のみを抽出することができない、と専門家による大幅なキュレーションの努力は、多くの場合、必要​​なセグメント化されたボリュームを生成するために必要とされる、特に複雑で混雑したデータセットについても同様である。 また、高度に特異的な問題へのカスタムソリューションは、多くの場合、それらの数学の分野の詳細な知識を持っていない研究者がアクセスできる広範かつ包括的なツール作る上で無重点がほとんどで、科学的な会議の論文として公開されている、コンピュータサイエンス、および/またはコンピュータグラフィックス。画像解析ライブラリの範囲を含むカスタマイズ可能なプログラミングソフトウェア環境は、ユーザが効率的に正確なセグメンテーションのための独自のモジュールを記述することを可能にする強力なツールのセットであり得る。しかし、このアプローチは、内線を必要とするensive訓練とその多くの機能や画像解析のための機能を利用するために、コンピュータサイエンスの背景。一つは、それらの周囲12,13から関心のあるオブジェクトを分離するために「テンプレート」のユニークな幾何学的形状に依存して、強力な形状ベースのアプローチを利用することによって、特徴がよりスパースである特定のデータセットについて、 例えば 、そのような汎用性の高いソフトウェア環境内で動作することができ。 コンピュータグラフィックスの可視化パッケージの公正さまざまなインタラクティブな手動セグメンテーションとモデル構築のために存在する。カリフォルニア大学サンフランシスコ校キメラ14、コロラドIMOD 15校、テキサス大学オースティンVolumeRover 16：他の人が学術的起源のものであり、そのように、無料で配布しながら、いくつかのパッケージは、市販されている。しかし、これらのプログラムが持つ機能と能力の広い範囲と複雑さは、EAのための学習曲線を急勾配CH。特定の視覚化プログラムは、複雑な3Dボリュームの簡略化モデルを作成するために、密度マップに入れることができるさまざまな大きさのボールとスティックのような単純な幾何学的モデルを提供する。これらのモデルは、単純な幾何学的および体積測定を可能にし、したがって、単に &quot;きれいな絵」を越えて行く。オブジェクトのようなマニュアルトレースは、オブジェクトの数が少ないトレースして抽出する必要があるボリュームに適しています。しかしながら、集束イオンビーム走査電子顕微鏡法（FIB-SEM）17-20またはシリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBF-SEM）のいずれかを使用して大量の3D超微細構造の画像化の最近の開発21は、3Dデータのサイズというさらなる合併症を提示するセットは、数十ギガバイトと数百ギガバイト、さらにはテラバイトの範囲とすることができる。したがって、このような大型の3Dボリュームは、手動特徴抽出と実質的にアクセス不可能であるので効率的なユーザーガイド半自動偉業URE抽出は予見可能な将来における3Dボリュームの効率的な解析のためのボトルネックの1つになるでしょう。 ここに提示日常的に生体画像タイプの広い範囲で使用される4つの異なるセグメンテーションアプローチがある。これらの方法は、次に、生物学者は、自分のデータの有効な特徴を抽出するための最良のセグメント化アプローチであるかもしれないものを判断するためのガイド内にコンパイルを可能にする、データセットの異なるタイプのそれらの有効性について比較する。詳細なユーザーマニュアルが記載されたプログラムのほとんどに利用可能であるとして、その目的は、これらの特定のパッケージのいずれかに精通している潜在的なユーザーにすることではありません。その代わりに、目標は、多様な特性を持つ6のデータセットの例にそれらを適用することにより、これらの異なるセグメント化戦略のそれぞれの強みと限界を実証することである。この比較により、基準​​のセットは、いずれかの客観的な画像特性に基づいて開発されているそのようなそのようなセグメンテーションのための所望の目的として主観的な考慮からのデータのコントラスト、鮮明さ、混雑、および複雑さ、またはステムなどの3Dデータセットは、特徴の形態での画分を意味する、関心のある特徴の人口密度、セグメント化される関心特徴、そしてどのように1収益最適にそのような時間とスタッフの可用性などの有限な資源で占める体積。これらの異なるデータセットの例は、これらの客観的および主観的基準は、データセットの特定の種類の特定の特徴抽出手法のペアを生成するためにさまざまな組み合わせで連続的に適用することができる方法を示す。指定された勧告は、うまくいけば、セグメンテーションオプションの多種多様に直面して、初心者が自分の3Dボリュームのための最も効果的なセグメンテーションアプローチを選択するのに役立ちます。 この論文の焦点は、データ収集と前処理データの特徴抽出、注意であるが効率的なのに不可欠であるegmentation。しばしば、試料の染色が不均一にすることができ、したがって、潜在的な染色アーチファクトがセグメンテーション手順で考慮されるべきである。しかし、染色は通常、より高い信号対雑音を与え、したがって、潜在的にアーチファクトが生じる可能性があり、携帯ボリュームの少ないフィルタリングや他の数学的処理を必要とします。それぞれの生画像データセットは、正確なコントラストおよびカメラピクセルの設定で取得した位置合わせ、及び3Dボリュームに再構築する必要がある。断層像については、整列された画像は、重み付け逆投影を使用して、典型的には再構築された後、データセットは、通常、非線形異方性拡散22、バイラテラルフィルタリング23、または24のフィルタリング再帰中央値として雑音除去アルゴリズムが施される。 FIB-SEMおよびSBF-SEM撮像データは、ImageJの25 XY利用プログラムで相互相関の連続切片により整列される。コントラスト強調とフィルタリングの機能を高めるために適用することができる関心ので、デノイズに画像スタック。フィルタリングアプローチは計算上高価であることができるように、フィルタリングは、選択または選択されたサブボリューム上のサブボリュームの前に、ボリューム全体のいずれかを行うことができる。時には、ノイズ低減および/またはファイルサイズ縮小のために使用される、（ビニング）データのサンプリングダウンデータが著しく予想解像度に比べてオーバーサンプリングされた場合にのみ推奨される。 ノイズ低減の後、処理された画像は、その後、さまざまな方法によってセグメント化することができ、そしてこの研究の焦点は、以下の4つである：（1）マニュアル抽象化モデル生成、（2）のマニュアルトレースを球棒モデルを作成を通じて関心のある特徴、（3）自動化されたしきい値ベースの密度、およびプロジェクト固有の分割のためのスクリプト（4）を介してカスタマイズされた自動化されたセグメント化の。境界セグメンテーション8と没入流域セグメンテーション10は、単純なしきい値へのより良い代替手段ですが、tはちょっと同じカテゴリーに属し、この議論の中で明示的に含まれていません。 密度の手動トレースはスライスごとのそれぞれの細胞内領域の元の密度の保持を可能にする、関心のある特徴を概説する必要があります。このアプローチは、セグメント化プロセスの最大制御を可能にするが、退屈で労働集約的なプロセスです。 アルゴリズムはユーザ定義パラメータのセットに基づいてピクセルを選択する場合、自動化されたしきい値ベース（および関連する）密度セグメンテーションアプローチは、半自動である。そのようなCHIMERAにより作成、IMOD、フィジー26、VolumeRoverなどのいくつかのアカデミック（無料）可視化パッケージは、パッケージ（有料のライセンスを必要とする）利用可能なだけでなく、商業であり、両方のタイプは、一般的に、これらのセグメント化の方法のいずれかまたは複数を含む。これらの異なる方法を説明するために本研究で使用されているソフトウェアパッケージは商用プログラムやアカデミックオープンの両方が含まれる手動で抽象モデルだけでなく、手動および自動密度セグメンテーションを生成するためのソースプログラム。しかし、オープンソースソフトウェアは、時には、カスタマイズの可能性を通じて、より高度なオプションを提供することができます。 データセットの異なるタイプを使用してこれらの技術の比較は、ルールや知識にまだ公開されていない多様な生物学的データの3Dボリュームのセグメントにアプローチする方法に関するガイダンスの次の提示につながった。したがって、これは最初の体系の異なるアプローチの比較は、異なる目的を持つユーザーのために特性を変化させたデータセットに対するそれらの有用性がある。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

近代的な3D電子顕微鏡のアプローチは、それらの細胞骨格および細胞小器官などの高次構造は、同様に、そのような接着複合体のような大きな高分子マシンの視覚化を可能にする、細胞および組織の3次元超微細組織への前例のない洞察を最近許可されているそれぞれの細胞および組織のコンテキスト。細胞のボリュームの固有の複雑さを考えると、まず視覚化、定量化、従って、それらの三次元組織の理解を可能にするために、関心のある特徴を抽出することが不可欠である。各データセットは個別の特性によって定義され、 例えば信号対雑音比、サクサク簡単に識別できるように特徴的な形状のデータ、その機能の不均一性、特徴の混雑、有無（シャープネス）、およびパーセント関心のある特定の領域が占めるボリューム全体の。すべてのこれらの特性を考慮する必要があるセグメンテーションのために取るためにどのアプローチを決定する際に。 提示六つの異なる3次元超微細構造のデータセットは、3つの異なる撮像により得られた近づく：染色された電子線トモグラフィーを埋め込み樹脂は、イオンbeam-と穏やかに染色し、激しく染色されたサンプルの連続ブロックface-走査電子顕微鏡法（FIB-SEM、SBF-SEM）、集束であった。これらのデータセットの場合、四つの異なるセグメンテーションアプローチが適用されている：（1）完全に手動モデル構築は、単にモデルの視覚化に続いて、表面レンダリングに続く（2）データのマニュアルトレースセグメント化、（3）半自動化されたアプローチは、その後表面レンダリング、または表面レンダリングおよび定量分析を行った（4）自動化されたカスタム設計のセグメント化アルゴリズムによる。データセットの特性の組み合わせによっては、これらの4つのカテゴリの手法の典型的には、1つが他よりも優れていることが判明したが、基準の正確な配列に依存して、カ再複数のアプローチが成功する場合があります。これらのデータをもとに、客観的なデータセットの特性と異なるデータセットを分析するための主観的個人の基準の両方を分類トリアージ方式を提案する。

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From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

携帯3D電子顕微鏡のためのボトルネックは非常に複雑な3D密度マップにおける特徴抽出（セグメンテーション）です。私たちは、このように効果的なセグメンテーションのための出発点を提供し、セグメント化アプローチ（手動、半自動、また​​は自動で）異なるデータ型に最も適しているに関するガイダンスを提供する基準のセットを開発した。

ボクセルからの知識へ：複雑な電子顕微鏡3D-データのセグメンテーションの実用ガイド

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K ビュー.  Lawrence Berkeley National Laboratory. 携帯3D電子顕微鏡のためのボトルネックは非常に複雑な3D密度マップにおける特徴抽出（セグメンテーション）です。私たちは、このように効果的なセグメンテーションのための出発点を提供し、セグメント化アプローチ（手動、半自動、また​​は自動で）異なるデータ型に最も適しているに関するガイダンスを提供する基準のセットを開発した。 

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...