複雑な生物学的試料に関する特定の領域の3D超構造調査を必要とするライフサイエンスプロジェクトは、この技術を利用できます。サンプル調製手順は、SBF/SEMおよびFIB-SEMである2つのイメージングモダリティで同じです。マイクロ波の使用はサンプル処理部分を実質的にスピードアップする。
根のヒントのためにここに示されているが、このプロトコルは、最小限の調整で任意の生物学的モデルシステムに使用することができます。SBF/SEM と FIB-SEM を関連付けるこのワークフローを使用する前に、個々のテクノロジに精通している必要があります。特定のステップの実行は簡単に示されますが、書かれたテキストで記述することは困難です。
手順を実証するのは、私たちの研究室の技術者であるピーター・ボルググレイフです。まず、寒天プレートに固定シロイヌナズナの苗の根先をカットし、摂氏4度で一晩同じ固定剤を含むエペンドルフチューブに2〜3つの先端を置きます。午前中、ピペットで、固定液をチューブのpH 6.8の0.1モルリン酸緩衝液に交換し、100 RPMの回転テーブルのチューブで10分間洗浄します。
次に、新鮮なリン酸緩衝液を用いて洗浄を5回繰り返す。ヒュームフードでは、リン酸バッファーを 2%オスミウムテトキシドと 0.1 モルリン酸バッファーの 0.2%ルテニウム赤で pH 6.8 の 0.2%ルテニウム赤に置き換えて、マイクロ波で蓋を開いたチューブで根先先端を後固定し、プログラムを開始します。その後、チューブ内の溶液を捨て、根の先端をそれぞれ5分間二重蒸留水で2回洗います。
3番目と4番目の二重蒸留水洗浄の場合は、電子レンジを使用して洗浄を支援します。最初の40秒の二重蒸留水洗浄の後、電子レンジから根先の先端サンプルを取り出し、二重蒸留水を新鮮な二重蒸留水に置き換えます。サンプルをマイクロ波に戻し、プログラムを続行します。
次に、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルの二重蒸留水にチオカルボヒドラジドを0.1グラム加えてTCH溶液を調製する。チューブをオーブンに入れ、摂氏60度で1時間加熱して溶かします。その後、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してTCH溶液をフィルタリングします。
サンプルチューブ内の溶液をフィルター処理されたTCH溶液に直ちに交換し、プロトコルを続行します。サンプルをエタノールに浸し、マイクロ波に入れて50%70%90%の段階的なステップで脱水し、100%エタノール処理の2倍にします。プロピレンオキシド脱水処理後、50%スパーの樹脂をチューブに加えて、最低2時間根先先端の浸潤を開始します。
100%スパーの樹脂の最終インキュベーションの後、根の先端を埋め込み型に入れ、金型に新鮮な100%スパーの樹脂を充填し、オーブンで36〜48時間摂氏65度で重合します。まず、カミソリの刃を使用して、重合したサンプルを薄いブロックに大まかにトリミングします。露出した組織を下にした側に、導電性エポキシ樹脂で金属ピンの中央にサンプルを取り付け、組織を金属ピンに触れさせる。
エポキシを一晩治すために、サンプルを摂氏65度のオーブンに入れます。午前中、金属ピンをキャリアに積み込み、カミソリの刃を使用してサンプルから余分なエポキシを取り除きます。サンプルの表面をさらに滑らかにするには、ウルトラミクロトーム用ホルダーに金属ピンを積み込みます。
超ミクロトームでは、ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、ピラミッドを形成するブロックの側面を滑らかにします。少なくとも組織の一部が既にブロック面に露出していることを確認してください。次に、トリミングしたサンプルブロックをスパッタコーターに入れ、2〜5ナノメートルでプラチナに設定を調整し、薄い層でサンプルをコーティングします。
SBF-SEM顕微鏡にキャリアを挿入します。ダイヤモンドナイフをサンプル表面に近づけ、サンプルの上部を切り取って白金層を取り除き、組織の一部を露出させます。次に、加速電圧を1.5~2キロボルトに設定します。
組織の画像をキャプチャし、イメージング実行を設定します。フィジーのソフトウェアを使用して、ファイル、インポート、画像シーケンスを選択し、画像をロードするイメージスタックを見つけます。原稿に応じて画像を調整した後、データセットをスクロールして配置を確認します。
ファイル メニューの下の保存コマンドを使用して、整列したデータ セットを 3D TIFF ファイルとして保存します。データ・セットを慎重に分析して、ROI が含まれているか、また生物学的な質問に必要な情報が含まれているかどうかを確認します。SBF-SEM顕微鏡の現在のブロック面であるスタックの最後の画像で、FIB-SEMの新しいROIを選択します。
再度白金でコーティングした後、サンプルをFIB-SEMにロードし、2次電子検出器を15キロボルトと1ナノアンプで使用して、ブロック面上のSBF-SEMで識別されたROIを見つけます。ステージを移動して傾け、FIBビームとガス射出システムを使用して、サンプルのROIをFIBビームとSEMビームの偶然のポイントに持ち込みます。1マイクロメートルの保護層の白金をROIの上の表面に付着する。
次に、50~100ピコアンプの範囲の低いミリング電流を用いて、白金堆積物に細線をミルして自動焦点を合わせ、イメージング走行中に3Dトラッキングを行う。次に、30ナノアンプの高いミリング電流を使用して、ROIの前に30マイクロメートルのトレンチを粉砕し、SEMビームのイメージング面を作成します。画像表面を平滑化した後、イメージングの実行を開始し、最初の50〜100セクションの間にプロセスの安定性を監視します。
システムがスムーズに動作したら、部屋を出て、部屋の中にできるだけ少ない乱れがあることを確認してください。SBF-SEMからの画像は、細胞の空間的指向および細胞内接続に関する洞察を与える組織の概要を提供する。新しい領域での後続の FIB-SEM イメージングは、特定のセルおよび構造の高解像度の詳細を追加します。
SBF-SEM データは、等方性ボクセル FIB-SEM データからの非等方性ボクセルの異なるレンダリングを示しています。SBF-SEMは、5ナノメートルのセクションを持つFIB-SEMデータがレンダリングがはるかに滑らかに表示され、個々のセクションが完全に表面に溶け込むようにしながら、表面に階段効果を提示します。このプロトコルは、1 つのサンプルで一意の領域のイメージングを記述し、ワークフローからの任意の偏差は、サンプルに損傷を与え、対象領域を再配置することが不可能になる可能性があります。
