クライオ軟X線断層撮影法は、スタンドアロンとして、または他のイメージング技術と組み合わせて使用できる細胞レベルで定量的な貴重な情報を提供することができます。凍結した水和状態のセンサ画像は、染色または切片化の必要がある。さらに、各断層撮影がわずか数分で収集されるため、ハイスループットの手法です。
軟X線クライオ断層撮影は、単一細胞レベルで感染細胞または欠損細胞の細胞復元プロセスを追跡するための完璧なプラットフォームを提供します。この技術は、編集された表現型の感染を元に戻すための新しい抗ウイルス薬またはおよび遺伝子治療の有効性を報告することができる。透過X線顕微鏡にサンプルをロードするには、移送チャンバを液体窒素で100ケルビン未満になるまで冷却します。
ワークステーションに追加の液体窒素を満たし、ワークステーションリムのヒーターをオンにします。ワークステーションのリムが沸騰しなくなったら、グリッドを入れたクライオボックスをクライオ条件下でワークステーション内の適切な場所に置き、グリッドを以前に冷却したサンプルホルダーにロードします。ホルダーをシャトルに積み込み、カバーで保護します。
シャトルを100ケルビン未満で移送チャンバにロードし、チャンバを低真空にポンプで送ります。移送チャンバを顕微鏡に取り付け、スクリーン上の真空手順に従って移送チャンバシャトルを顕微鏡にロードします。シャトルがサンプルとともに顕微鏡に入ったら、顕微鏡ロボットアームを使用して、1つのサンプルホルダーをサンプルステージに移します。
オンライン可視光顕微鏡でグリッドの明視野イメージングを行うには、可視光顕微鏡カメラを選択し、明視野イメージング用の可視光顕微鏡LEDソースをオンにします。「モーション」、「コントロール」、「サンプル」、および「サンプルシータ」をクリックしてサンプルを可視光顕微鏡の対物レンズに向くようにマイナス 60 度に回転させ、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、サンプル X とサンプル Y を変更してサンプルを予期される中心位置に移動します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、連続、および開始を選択し、[モーションコントロール]と[サンプル]をクリックしてサンプルZを選択し、細胞および/または炭素支持フィルムの穴に焦点が合うまで5ミクロンまで小さなステップで焦点を絞り込みます。
次に、[顕微鏡]、[取得]、[取得設定]、[取得モード]、[モザイク]、[開始]を選択して、モザイクの既定値を使用して、明視野モードでグリッドの完全なモザイクマップの取得を開始します。蛍光モードモザイクイメージングの場合は、明視野イメージング用の可視光顕微鏡LED光源をオフにし、セットアップで目的の励起波長に対応するLED光源と対応する光学フィルタを手動で選択します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、連続、および開始を選択し、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックしてサンプルZを選択し、蛍光画像に焦点を合わせます。
次に、[顕微鏡]、[取得]、[取得設定]、[取得モード]、[モザイク]、[開始]をクリックして、明視野モザイクからの位置 X パラメーターと Y パラメーターを保持するモザイク マップの取得を開始します。その後、LED光源の電源を切ります。X線モザイク取得の場合は、出口スリットを5ミクロンに変更し、MISTRALで1秒間露光します。
「顕微鏡」、「集録」、「集録設定」、「カメラ設定」、および「ビニング」を選択して、サンプルの Z 変換を使用してフォーカスを調整します。モーションコントロールとサンプルを選択してサンプルZを選択します。5ミクロンのステップから始めて、セルまたはカーボンホイルホールに焦点が合うまでフォーカスを0.5ミクロンのステップまで絞り込みます。メッシュ正方形のモザイクマップを取得するには、「顕微鏡」、「取得」、「取得設定」、「取得モード」、「モザイク」、および「開始」をクリックします。
マップが取得されたら、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックし、サンプル X とサンプル Y を変更して、サンプルを平坦なフィールド位置に移動します。MISTRAL での露出時間を 1 秒に設定します。そして、取得したモザイクをフラットフィールド画像で正規化し、正規化したモザイクを保存して送信を得る。
回転軸上のサンプルを 0 度の回転に合わせるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、サンプル X、サンプル Y、およびサンプル Z を変更して、回転軸に配置するセルの特徴に焦点を合わせます。サンプルを正のシータ位置に回転させるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、「サンプルシータ」を正のシータに変更します。線ツールを使用して、回転軸に配置するセルの特徴に線を描画します。
サンプルを負のシータ位置に回転させるには、「モーションコントロール」と「サンプル」を選択し、「サンプルシータ」を負のシータに変更します。線ツールを使用して、回転軸に配置するセルの特徴に線を描画します。正または負のθ位置にいる間、サンプル Z 平行移動を使用して、選択したフィーチャを両方のライン間の中心位置に移動し、最小ライン間距離が得られるまでサンプルの回転を繰り返します。
サンプルシータがゼロに等しい場合は、選択したフィーチャを視野の中心に配置するのに必要な距離の 2 倍の距離でサンプル X を移動し、ゾーン プレート X を移動してフィーチャを視野の中心に戻します。新しい回転軸に対するゾーンプレートの Z 位置を再最適化するには、[顕微鏡]、[集録]、[集録設定]、[集録モード]、および [焦点系列] を選択し、[開始] をクリックしてゾーンプレート Z 焦点系列を記録します。次に、「モーションコントロール」と「ゾーンプレート」をクリックし、ゾーンプレートZを選択して、サンプルに焦点が合っている位置にゾーンプレートZを移動します。
断層撮影を取得するには、「モーションコントロール」と「サンプル」をクリックし、「サンプルシータ」を選択して、負の最大角度をプラス 0.1 に移動します。顕微鏡、集録、集録設定、集録モード、断層撮影の順にクリックし、角度ゼロの画像と角度範囲を考慮して、画像の数を角度の合計数として設定し、画像の数を設定します。「角度の開始」と「角度の終了」を選択し、「顕微鏡」、「取得」、「取得設定」、「カメラ設定」をクリックして、露出時間を設定します。
「開始」をクリックして、断層撮影チルトシリーズの取得を開始します。理想的なサンプルは、薄い氷の層に埋め込まれた正方形のメッシュの中心に単一の細胞を持ち、よく分散した金の基準マーカーに囲まれている必要があります。ミトコンドリア、小胞体、液胞体、核などの多くの異なる細胞小器官は、線形吸収係数の定量的再構成のおかげで、最終的な再構成断層図で区別できるはずです。
この画像では、セル密度の高い正方形が観察できます。この例では、ブロッティングの効率が低く、亀裂のある氷層が厚くなりました。この調製ではいくつかの大きな構造を認識することができるが、厚い氷のガラス化品質が悪いため、ノイズとざらざらした質感の中で細かいディテールが失われていた。
クライオ保存されたサンプルは、この段階のサンプルが生成されるとほとんどのアーティファクトが誘発されるため、最小限に抑える必要があります。通常、相関クライオ可視光顕微鏡は、クライオ基板断層撮影に先立って使用する。さらに、スペクトル顕微鏡は、関連する化学元素で行うことができます。
このプロトコルは、他の直接イメージング技術では容易にアクセスできない試料および分解能レジームで動作することによってニッチを埋め、数ミクロンおよび30ナノメートルのハーフピッチ分解能を可能にします。
