We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

注：以下の実験手順は、モナッシュ大学の動物倫理委員会によって承認され、科学的目的のための動物の管理と使用（2006）の実践のためのオーストラリアの規範に従って行われる。代表的な結果を生成するために使用される成体雌C57BL / 6マウスをモナッシュ動物Servicesから入手した。マウスを、12時間の明暗サイクルで、特定病原体を含まない、温度および湿度制御された部屋で飼育した。これらのマウスは、餌と水を自由に摂取させた。 1。初期セットアップ<ol><li> USBケーブルを介して記録するためのデータ収集マシンにラップトップ/デスクトップを接続します。 </li><li> BNCケーブルを経由してデータ収集機の「入力1」に「出力1」からブリッジ·アンプを接続します。 </li><li>オクタルブリッジアンプの「チャンネル1」への圧力変換器を挿入します。上のデータ収集機を回して、解析ソフトウェアを開きます。ソフトウェアは自動べき自動的（資機材の表を参照）機器のセットアップを検出する。 </li><li>ソフトウェアのセットアップツール·バーに見つかったオープンチャンネル設定。変更チャンネル数は1に記録されている。 </li><li>室内圧力とブリッジアンプを校正する水柱装置を測定するための気圧計を設定します。水柱装置は、プラスチックチューブによって接続された2つの5ミリリットル血清シリンジピペットを含む。 </li><li>水で列を記入し、水位が定規とバランスしていることを確認。プラスチックチューブの一枚は、各ピペットの上部に接続します。 図2は、セットアップ水柱を示しています。 </li></ol> 2橋アンプキャリブレーション注：水柱への空気の注入は、1cmのH 2 O撓みを作 ​​成するために必要とされるブリッジ増幅器を較正する。これは条件の単一のセットの下で発生し、ユーザの装置に依存しているでしょう。明確にするための手順は、Dこの研究室では、キャリブレーションを実行する方法emonstrate。 <ol><li> 300μlに1mlシリンジを撤回。水柱の右側のチューブの端に活栓にシリンジを取り付けます。注：ストップコックをシリンジと水柱に開放されていることを確認し、室内の空気を閉じた。水位は、この時点でバランスされていない場合は、室内の空気と水の塔に開いていること、これが水を再調整しますので、ストップコックを回します。水柱の左側のチューブは、シリンジの急落によって誘発される圧力の変化を測定するために圧力変換器に接続されるべきである。 </li><li>圧力トランスデューサ（変換器のトップリング）上のコネクタに左側に水柱からチューブを取り付けます。 </li><li>ソフトウェアの右側にメイン画面で1チャンネルと「ブリッジ·アンプ」を（資機材の表を参照）を選択するために、次の発見スクロールダウンメニューを選択します。 </li><li>入力する5 mVの、20Hzのローパス、への設定が「反転」ボックスをチェックし、「ゼロ」をクリックします。 〜0mVにトレースを設定するために「ゼロ」をクリックしてください。見やすく1：4にウィンドウサイズを小さくしてください。 </li><li>すべてがセットアップすると、3秒のためにそれを残して、1ミリリットルの注射器を押し下げる。圧力が変更されているので、これはソフトウェア上で突然のスパイクが表示されます。 300μlを押されると、圧力を1cmによって水柱の中の水を移動します。この既知の値は、ブリッジ·アンプを校正するのに役立ちます。 NOTE：起因300μlの押下にチャンバ内の圧力の増加は、後の計算に使用されるP K値に相当する。 </li><li>ブリッジアンプウィン​​ドウの左下隅に見られる「入力装置」を選択します。 </li><li>前そうでなければ「ゼロ地域」として知られているスパイクの「バックグラウンド·トレース」を強調表示します。 <ol><li>次の「ポイント1」の横にある矢印をクリックして、このは、BACが生成されます-0.002 MV-0.002 mVの（値が正確に0mVになることはありません）の範囲内でkground信号。 </li><li>バックグラウンド信号ウィンドウに隣接したウィンドウで入力し、「0」。 </li></ol></li><li>シリンジが押下されたときから「グラフの増加圧力領域」を強調表示します。次のポイント2にある矢印をクリックし、値は0.9〜1.2 mV程度の範囲であるべきである。 <ol><li>タイプ「1」の横に「増加圧力」ウィンドウにウィンドウ内。ステップ2.7および2.8上で視覚的に明確にするためのオクタルブリッジアンプの損傷を示している可能性があり、指定した範囲外で見つかった3。値の図に対応しています。 </li></ol></li><li>ウィンドウの右上隅で発見&#39;単位を定義」を選択し、「CMH 2 O」に進みます。このオプションが利用できない場合は、手動で入力することができる。 [OK]をクリックします。 </li><li> （2.1参照）「ブリッジアンプ」メニューに戻ります。 1 mVのを選択し、「ゼロ」にアンプを設定;。これは、キャリブレーションを完了し、水柱を安全に取り外すことができます。 </li></ol> 3録音肺機能<ol><li>マウス（g）を秤量する。注：前の生理的評価に1週間容積脈波室環境にマウスをご紹介します。これは順化を支援し、後日、この手順を実行する際のストレスを軽減します。 UWBPのセットアップを示す全体概略については、 図4を参照してください。 </li><li>直腸体温計で体温を測定します。挿入前ワセリンで温度計に注油。温度読み取りを記録し、80％（v / v）のエタノールで潤滑油をきれい。そのような新生児の仔マウスのような非常に小さい動物を使用する場合は、平均体温値が代わりに赤外線温度計を用いて測定することができる。 </li><li>プレチスモ室の1穴の端に温度/相対湿度プローブを配置します。温度、湿度、barometrを記録内でマウスを配置する前に、容積脈波室内のIC圧力。 </li><li>容積脈波チャンバ内にマウスを置き、わずかに開いた端部を覆う。これは、マウスが順応することができます。チャンバを閉じます。 </li><li>一つの穴を持つプレチスモ室側に挿入された温度/湿度プローブを用いて、今2穴の反対側にある変換器と注射器を挿入します。 </li><li>約15〜45秒間、ソフトウェアプログラムおよび記録を押し「スタート」。動物が動いていないデータのレコード5-10秒。運動は、動物の基礎呼吸生理を変化させ、悪い結果をもたらす。呼吸は、プログラム上の直線経路で発振する必要があります。これらは、使用可能なデータです。注：排尿または排便のプレチスモグラフィーチャンバー内の温度および湿度の上昇につながる可能性がある。これは分析中に結果を不明瞭にします。排尿や排便の際には、すぐに録画を停止およびPLをきれいに80％（v / v）エタノールでethysmographyチャンバ。データは拒否されるべき次善の結果、視覚的に表現するために、図6を参照してください。 </li><li> 45秒間記録した後、プレス機のソフトウェア上の「停止」（資機材の表を参照）のプログラム。容積脈波室からマウスを取り出し、すぐに室内の温度と湿度を記録します。これは動物にストレスを可能として、継続的に45以上の秒間記録しません。 </li><li> 80％（v / v）のエタノールでスプレーチャンバと拭いて、そのケージにマウスを返します。 </li><li>チャンバーを乾燥し、次のマウスへ進む前に、ベースライン温度と湿度に戻れるように。繰り返します、その後の動物のための3.1〜3.9を繰り返します。注：複数の動物が研究されている場合は、それぞれの新しい動物の前に近くのベースライン値、チャンバの温度と湿度の戻りがチャンバに入れていることを確認します。 </li></ol> 4。プレチスモグラフ分析いいえテ：そのような一回換気量（V T）および分時換気量等の呼吸パラメータを計算するために以下の変数を測定する必要がある：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teとによりそれぞれ一回換気量（P T）。秒）、圧力の変化は、1トレースから測定可能な変数を示している図 。次の手順は、これらの変数を測定するために（資機材の表を参照）ソフトウェアを使用しています。分析する際に、盗聴や移動を含む微量の領域を避ける。再現性のある結果を得るためには、良好な呼吸トレースの少なくとも5秒が必要です。異なる呼吸トレースの例については図5および図6を参照してください。 <ol><li> 、フルスクリーンに画面を開き1、ビューを設定します。1と、使用可能なデータの5秒を選択します。この代表的なスナップショットが図5に示されている。 </li><li>プロの一番上に見つかったミニデータパッドウィンドウを開きますDATAPADタブでグラム。チャンネル1を選択し、右側の列の左側の欄の「周期測定」と「平均的なサイの高さ」を選択します。 <ol><li> 「オプション」を選択して、1秒（msec）の最小ピーク検出のためのスケールを設定します。これは、すべてのピーク値の検出を可能にし、小さな振動を生成小動物を使用する場合に非常に重要になるであろう。 </li><li> 「OK」をクリックします。これは（P、T）の測定」各一回換気量による圧力たわみ」を紹介します。 </li></ol></li><li>ミニデータパッドには「イベント数」に続いて、選択 &#39;サイクルの測定」と「OK」をクリックしてください。これは「周波数」（f）の測定を紹介します。 <ol><li>周波数は呼吸/分に変換する必要がある。これは、60秒して値を掛け、（min）を記録する全体的な時間で答えを割ることによって行われます。 </li></ol></li><li>ミニデータパッドで、[&#39;CYCLE測定期間 &#39;が続く&#39;をクリック &#39;&#39; [OK]をクリックします。これは「総呼吸サイクル時間」（T TOT、秒）の測定を紹介します。 </li><li>次のステップは、ピーク吸気と呼気時間値を生成するために、マクロ命令を作成するために使用される。カーソルが直接ピーク/トラフの最大を超えていることを確認し、9シーケンシャル山と谷にコメントを追加します。 図5に示すように振動のピークから始めます。 </li><li>続いて、選択ウィンドウ：データパッド、右側の欄の左側の列、「期間」で「選択情報」をクリックし、「OK」をクリックして表示されるウィンドウで列1。 </li><li>マクロプログラムの先頭に記述され選択してから、録音を開始。今selectコマンド：「ファイルのスタート」、「行く」、「検索」と「検索」をクリックします。 </li><li>コマンドを選択します。「検索」とのコメントを検索 &#39;。提供さ &#39;を含む&#39;ボックスにコメントボックスの入力したのと同じフレーズを入力します。 」を選択前のポイントに &#39;タブを選択し、「検索」。 </li><li>コマンドを選択します。「データパッドに追加 &#39;。次に、マクロを選択：マクロコマンドを繰り返しを開始します。表示される繰り返し回数ウィンドウは9に設定してください。 </li><li>コマンドを選択します。「次を検索」。コマンドを選択します。「データパッドに追加 &#39;。最後に、マクロコマンドと終了を繰り返しを選択します。 <ol><li>今マクロを選択して録音を停止。動物番号の後にマクロを保存し、名前を付けます。注：各動物のためのマクロを設定するには、マクロは、長手方向の研究のために使用することができますし、時間を節約できます。 </li></ol></li><li>マクロは、現在、各コメントの間にインスピレーション（のT i）および有効期限（T eは ）時間を取得するために実行することができます。データは、データパッドのチャンネル1の下に表示されます。有効期限とインスピレーションが連続発生し、データは、この順序で表示されます。 <ol><li>データは手動で吸気と呼気の値に分割する必要がある。平均T iおよびT 電子メールを取得するために各パラメータの4つのデータ値を平均する。 </li></ol></li><li>プライマリ値が導出されると一回換気量（V T、ml）を計算することができる。一回換気量を得るためにDrorbaughとフェン8の式が使用されます。 V T（ミリリットル）=（P T / P K）×（V K）×（（T CORE（P B - P C））/（T CORE（P B - P C） - T、C（P B - P CORE））） どこ V T：換気量 P kは ：1ミリリットルの各注入による圧力の振れ（2.5ステップを参照してください） T コア ：各動物の中核温度 P C：茶における室温度X相対湿度での水の蒸気圧mber T C：動物室の温度 P コア ：体温で圧力（体温で水蒸気圧×1.0） P tは各一回換気量による圧力たわみ V K：キャリブレーションのための容量注入 P Bは ：気圧の圧力 </li><li>一回換気量が計算されると、以下のパラメータも決定することができる。 <ul><li>分容量（ml /分）= V T XF </li><li>分容量（ml /分/ kg）=（V T XF）/本体重量（kg） </li><li> V T（ミリリットル/キログラム）= V T（ミリリットル）/本体重量（kg） </li><li>吸気デューティ·サイクル（％）= T I / T TOT </li><li>吸気流量（ミリリットル/秒）= V T / T iは </li><li>吸気時間と呼気時間の時間の比率= T I / T E </li><li>全サイクル時間（秒EC）=インスピレーション時間（秒）+有効期限（秒） </li></ul></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

ここで説明する技術は、非拘束および無麻酔のマウスの呼吸パラメータの評価のための非侵襲的方法である。このプロトコルの長所は、最小限の人工物で縦方向に肺機能を測定するために、そのシンプルさと精度が含まれています。いくつかの制限と手続きについて記載すべき重要なステップは、しかし、があります。第一に、そして最も重要なのは、マウスが5秒以上室内に落ち着いている...

肺機能障害は、世界で罹患率および死亡率の主要な原因の1つである。条件は咳、胸の痛みや呼吸困難の代名詞不十分な酸素交換、ことを特徴としている。世界的な死亡率1〜10％のための呼吸器疾患を占めている。世界保健機関によると、死亡率に起因永続的な喫煙、汚染および職業的刺激物に上昇するように設定されている。 UWBP強く2を分析し、従来の生化学的および組織学的を補完する肺の生理機能を研究するための有用な付加である。肺の評価のために使用される他の手順はUWBPと同じ利点を提供しない。侵襲プレチスモは、動物が3,4麻酔されるので、結果として呼吸測定は、必ずしも自然な状態を反映していない必要があり、一般的に使用される技術である。さらに、機械的な換気および化学的な課題のための必要条件は、将来の測定値3,4を排除する。呼吸データを収集する別の方法は、UWBP 5と比較して、呼吸パラメータの細かい変化に敏感で強制振動によるものである。強制振動は、しかし、侵襲的技術であり、データ収集5-7の動物の終端を必要とする。 UWBPは、特殊なチャンバー内に動物を配置することを含む。吸気の間、呼気が暖められると水蒸気圧の上昇、肺内の加湿ガス8の熱膨張を引き起こす。この効果は、プレチスモグラフ室8内の圧力の上昇を作成する風量の純変化を引き起こす。反対は、動物からの呼吸波形を生成する呼気中に発生します。波形解析は、その後、呼吸トレースから測定するために使用される：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teを、秒）により、各一回換気量（Pに圧力の変化T）。 <stroNG&gt;図1は、呼吸器トレースからそれぞれの測定値の原点を示しています。これらの測定は、計算が簡単で、複数の呼吸パラメータは、これらの測定値から導出することができる。これらのパラメータは次のとおりです。一回換気量（空気の体積が通常の吸気と呼気との間を移動）、分量（毎分、肺から吸入されるガスの体積）、吸気デューティ·サイクル（総呼吸サイクルの持続時間に吸気時間のパーセンテージ）と吸気流量（所定の時間内に吸入された空気の量）。 UWBPは、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供し、呼吸器疾患および肺機能6,9の進行を測定するために使用することができる。他の容積脈波法に反して、UWBPは、麻酔、拘束や工芸品と実験変動6,9を生成する侵襲的な操作の使用を回避する。麻酔は、呼吸を抑制することができる心拍数を変化させ、10を制御するために挑戦することができる。拘束は、コルチコステロンおよびエピネフリンリリース11,13経由による追加的なストレスに呼吸の増加を誘導する。 UWBPの重要な特徴は、長期的な研究には、影響を受けやすいこと、生理的な評価を繰り返される。 UWBP強く、肺生理学の長手方向の評価のために推奨され、将来の呼吸の薬剤の査定のための貴重なスキルを提供しています。 ブレオマイシン、オボアルブミン、および低酸素症は、いくつかの研究において、呼吸課題を誘導するために利用されているとUWBPが正常に正確な肺の生理学的な評価7,9,13-16を測定している。記載されたプロトコルは、標準的な成人の実験マウス用に設計されている。しかし、UWBPは、ラット、モルモット、および非ヒト霊長類17-20などの他の動物に適応されている。 UWBPは、肺機能不全の評価に限定されるものではなく、肺の成熟3の評価のために使用されてきた。UWBPの汎用性、シンプルさと再現性が動物で肺機能を評価するための優れた手法を確立した。さまざまなソフトウェアが（資機材の表を参照）、この手順に従うことが要求されます。経験豊かな科学者は、1時間以内に、マウスでは、このプロトコルを実行することができるであろう。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">LabChart 7 software (for Macintosh)</td>
			<td style="width:139px;">ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLU60/7</td>
			<td style="width:475px;">used in protocol step 4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerLab 8/30 (model ML870)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Octal Bridge Amp (model ML228)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>FE228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Black BNC to BNC cable (1m)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLAC01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Macintosh OS&#160;</td>
			<td>Apple Inc.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:475px;">Mac OS X 10.4 or later</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Surgipack Digital Rectal Thermometer&#160;</td>
			<td>Vega Technologies</td>
			<td>MT-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td>
			<td>Grass Instruments Co.</td>
			<td style="width:155px;">Model number PT5A; serial No. L302P4.</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">5ml serological syringe pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606160</td>
			<td style="width:475px;">Connected via plastic tubing</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Balance/Scales</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>SHIMAUW220D</td>
			<td style="width:475px;">Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HM40 Humidity &#38; temperature meter&#160;</td>
			<td>Vaisala&#160;</td>
			<td>HM40A1AB</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Barometer</td>
			<td>Barometer World</td>
			<td>1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>508-101</td>
			<td style="width:475px;">Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;width:263px;">Cylindrical Perspex Chamber</td>
			<td>Dynalab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:475px;">Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">80% Ethanol (4L)</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>BDH1162-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

呼吸機能障害は、世界での罹患率および死亡率の主要な原因の一つであり、死亡率は上昇し続けている。げっ歯類モデルにおいて肺機能の定量的評価は、今後の治療法の開発における重要なツールである。一般的に侵襲容積脈波と強制振動を含む呼吸機能を評価するための技術を使用していました。これらの技術は貴重な情報を提供するが、データ収集に起因麻酔および/または動物の侵襲的な計測のための必要性にアーチファクトおよび実験的変動性を伴うことができる。これとは対照的に、拘束されていない全身プレチスモグラフィー（UWBP）は呼吸パラメータを分析することで、正確な、非侵襲的、定量的な方法を提供しています。この技術は、従来のプレチスモグラフィー技術に共通で麻酔し、拘束の使用を回避する。このビデオでは、機器のセットアップ、キャリブレーションおよび肺機能の記録を含むUWBP手順を紹介します。それ収集したデータを分析するだけでなく、動物の動きに起因する実験的な外れ値や工芸品を特定する方法を説明します。この技術を用いて得られた呼吸パラメータは一回換気量、分容積、吸気デューティサイクル、吸気流量及び呼気時間を吸気時間の比率を含む。 UWBPは専門的なスキルに依存しており、実行するのに安価ではありません。潜在的なユーザーにとって最も魅力的なキーUWBPの特徴、そして、同じ動物で肺機能の反復測定を実行する機能である。

この手順が正しく実行されたときに、一貫性のある振動トレースデータ分析ソフトウェアで作成される。手順は、リストされた呼吸パラメータを決定するために、簡単な計算の計算を使用してセットアップした後、数分以内に呼吸器のトレースを提供します。 図5対照（健常）マウスから、適切な呼吸トレースを表します。動物は活発に動いていないときに適切な振動データが生...

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Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。

拘束されていない全身プレチスモグラフィを使用したマウスにおける呼吸機能の測定

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K ビュー.  Monash Institute of Medical Research. 呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。 

ビデオ: Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume. A specially designed differential pressure transducer and an occlusion tail-cuff measure the total blood volume in the tail without the need to obtain the individual pulse signal. Special attention is afforded to the length of the occlusion cuff in order to derive the most accurate blood pressure readings. VPR can easily obtain readings on dark-skinned rodents, such as C57BL6 mice and is MRI compatible. The CODA system provides you with measurements of six (6) different blood pressure parameters; systolic and diastolic blood pressure, heart rate, mean blood pressure, tail blood flow, and tail blood volume. Measurements can be made on either awake or anesthetized mice or rats. The CODA system includes a controller, laptop computer, software, cuffs, animal holders, infrared warming pads, and an infrared thermometer. There are seven different holder sizes for mice as small as 8 grams to rats as large as 900 grams.

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. This tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume.

ボリューム圧力記録、テールカフ法を用いたマウスにおける測定血圧

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

シトクロムを使用してミトコンドリア呼吸機能の可視化 Cオキシダーゼ/コハク酸脱水素酵素（COX / SDH）二重標識組織化学

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

全身ナノ粒子エアロゾル吸入暴露

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

マウスにおける膝伸張筋機能のインビボ測定

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...