マウスにおける咳嗽および気道炎症の検出方法

私の研究は慢性咳に焦点を当てています。咳の病態生理を理解するために、私の研究では、主要な因子レベルの変化を確認するためのテストサンプルが必要でした。私は、マウスから組織サンプルを採取するための標準化された手順を確立することを目指しています。

咳過敏症は、ウイルス感染によって引き起こされることがよくあります。ウイルス感染が咳過敏症を引き起こし、肺のTリンパ球からのインターフェロンガンマの放出を増加させる可能性があることを初めて発見しました。慢性咳嗽のほとんどの患者は、気道や肺に影響を与えるさまざまな刺激に対する神経反応の増加を特徴とする咳過敏症を患っています。

将来的には、咳過敏症に寄与する末梢および中枢プロセスに焦点を当てます。まず、咳を検出した後、深く麻酔をかけたH1N1感染マウスを採取し、眼窩から血液を採取します。採血チューブを振って血液と抗凝固剤を完全に混合し、血液凝固を防ぎます。

次に、採取した血液を800Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上澄み液を集めて保管します。ペレットを1ミリリットルのD-ハンク溶液に再懸濁します。

10マイクロリットルの血球懸濁液をスライドガラス上に広げて、細胞プロファイルを決定します。脾臓を採取するには、マウスの胸を開き、左耳介を取り除き、次に5ミリリットルの生理食塩水で肺循環と体循環を灌流します。外科用鉗子を使用して、マウスから脾臓全体を取り出します。

次に、脾臓の重量を測定します。脾臓を半分に切ります。前半を4%パラホルムアルデヒドで室温で固定し、病理組織学的解析を行います。

後半はマイナス80°Cで保存し、サイトカイン測定に使用します。気管支肺胞洗浄液の収集のために、右主茎気管支で結紮することにより、右肺を分離します。0.5ミリリットルのPBSで3回洗浄することにより、左肺から気管支肺胞洗浄液を収集します。

遠心分離機は、800 Gの気管支肺胞洗浄液を摂氏4度で5分間収集しました。次に、上清を収集します。ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。

計数スライドを使用して、気管支肺胞洗浄液中の白血球をカウントします。微分カウントによって細胞プロファイルを決定するには、細胞懸濁液の50マイクロリットルをスライドガラスに塗りつけ、乾燥させます。スライドを4%パラホルムアルデヒドで一晩固定してから、ヘマトキシリンエオシンで染色します。

気管支肺胞洗浄液の採取後、組織病理学的分析のために、右肺と気管の半分を4%パラホルムアルデヒドで切除して固定します。残りの半分は、ウェスタンブロッティング、RT-qPCR、および酵素結合免疫吸着アッセイのために摂氏マイナス80度で保存します。H1N1ウイルスの感染は、浮腫や多くのリンパ球、好中球の浸潤など、マウスの肺に炎症性変化をもたらしました。

H1N1ウイルス感染は、繊毛の排出や炎症性細胞浸潤など、マウスの気管に炎症性変化を誘発した。H1N1ウイルス感染は、マウスの脾臓全領域に対する白色歯髄領域の比率を有意に増加させ、リンパ球は脾臓の白色髄に蓄積した。