Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

プロトコルは、3つの主要な手順で構成されます。最初のステップは、培養培地中で複合抽出物の調製を含み;第二の懸念初代ヒト歯肉線維芽（HGF）、細胞培養、複合抽出物および細胞染色による細胞の接触。第3のステップは、共焦点イメージング、蛍光信号解析で構成されています。服用歯肉組織の場合、プロトコルは、フランスの法律、インフォームドコンセント及び地域の倫理委員会に準拠して承認されました。 1.コンポジット抽出物の準備溶出媒体としてダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用します。試験片の表面積と抽出媒体の体積との比は、ISO 12分の10993要件の最低レベルであることを確認します。手順は、最近11を説明し、下に簡単に概説する。 <ol><li>オーダーメイドのホールドを使用して未硬化歯科複合材料の球状のサンプルを形成えー。ホルダーの大きさは、経口臨床治療において一般に助言硬化深度に応じた半径2mmである。 </li><li>プレートのウェルを準備し、それぞれのペニシリン/ストレプトマイシン及びアンホテリシンの1％、5％のミックスが、ウシ胎児血清（FBS）を含まない培地を1ml（DMEM）を含む。 </li><li> 40秒間1070メガワットcm -2の強度（λ= 465から475 nm）を有するLEDライトランプを用いよく含むDMEM培地内で硬化サンプル。硬化先端とサンプル間の距離は0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。歯と未硬化歯科用複合の間の一時的な接触をシミュレートするために、この硬化モードを使用します。修復複合材料を口腔内に配置されたときに臨床的状況では、接触が起こる。 </li><li>空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、37℃でのサンプル（DMEM培地中の複合試料）を培養する。同じ条件での対照細胞について（コンポジットサンプルなし）DMEM培地をインキュベートする。 </li></ol> 2. HGF細胞培養、コンポジットエキステストと細胞の染色<ol><li>成長および細胞培養の維持 ルーチン歯列矯正の抽出中に撮影患者の健康歯肉組織生検からヒト歯肉線維芽細胞を分離します。 <ol><li> 10％FBSの存在下で、DMEM中のヒト歯肉線維芽細胞を養う、5％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％アンホテリシンBを、空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で細胞を維持する。 </li><li> 5日毎、3日毎に培地を変更し、継代細胞。トリプシン処理によりフルエンシー、収穫細胞に到達した後。 </li><li> 5分間90×gで遠心分離細胞培養培地中で再懸濁する。笏ハンドヘルド自動細胞計数器で細胞を数える。 </li><li>チャンバースライドシステムにおいて2.5×10 4細胞/ mlの細胞密度でシード細胞懸濁液。 5％の雰囲気中で37℃で一晩細胞のインキュベーションを許可します。 </li></ol></li><li>培養中の細胞への複合抽出物のほか<ol><li> （インキュベーションの24時間後）は、試験した複合抽出物の1ミリリットルによってチャンバースライドの2井戸のメディアを交換してください。 </li><li>同じ条件で、残りの2つのウェル（対照細胞）を維持する。 </li><li>空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で4つのウェルを含むチャンバースライドをインキュベートする。 </li></ol></li><li>蛍光染色 メーカーの指示に従って、真核細胞のためのライブ/デッド細胞毒性ステインを使用してください。 注：このキットは、細胞膜の完全性およびエステラーゼ活性に基づいて、集団中の細胞の生存率を決定するための迅速な二色蛍光アッセイを提供する。染色を同時にmembranの損失を示すために、細胞内エステラーゼ活性を示し、赤色蛍光ジウムホモダイマー-1（のEthD-1）緑色蛍光カルセインAMで標識することによって損傷を受けた細胞からのライブ区別するEの整合性。 <ol><li>カルセインAM及び4μMとのEthD-1（線維芽細胞の染色に適していることが報告された最終濃度）の2μMを含む二つの染色試薬のワーキング溶液を調製する。選択された複合抽出物の存在下または非存在下で培養した接着細胞を染色を加える。 </li><li>染色後とタイムラプスイメージングを通じて少なくとも15分で直接かつ迅速に染色された細胞集団を観察します。遠心操作は行なわないと染色された細胞をFIXEません。 </li></ol></li></ol> 3.共焦点タイムラプスイメージングと信号解析使用されるシステムは、4つのダイオードレーザユニットと各検体のために最大4つの蛍光色素のためのマルチ染色像を備えている。システムは、1つは関心（600X倍率）の領域を観察するために移動することができる上、試験サンプルの概要を示したマッピング像（倍率10倍）を行うことができます。 <ol><li>タイムラプスイメージング<ol><li> Sを配置共焦点統合インキュベーター（37の暗い部屋にpecimens（染色されたサンプルを含むチャンバースライド） °C、CO 2湿潤雰囲気の5％）。 </li><li>対応するレーザーを選択します。カルセインとのEthD-1を励起するために2つのレーザ源を473 nmの（15 mW）とし、559 nmの（18 MW）を使用してください。 </li><li> 2使用済みの蛍光色素とイメージングにおけるクロストークずにライン配列を介して画像を取得するために2シーケンシャルモードを使用してください。 </li><li>自動的に走査ユニット内の蛍光色素に応じた条件を設定し、新たに開発されたスペクトル検出器を用いる。 </li><li>最大各チャンネルごとに検出された蛍光の帯域幅を最適化します。レコードに順次、すべての買収は、潜在的なクロストークを回避するため。 </li><li>取得ソフトウェアを使用して、蛍光色素の選択に基づいて最適な撮影条件を選択してください。 </li><li> 、自動的に螺旋パターンで中心から作成された地図画像を取得する関心のある領域で簡単に綿密に検討するために選択されている。 </li><li>観察モードを選択します。タイムラプス、Zスタック、および必要に応じて、多領域を含む観察モードの5種類まで選択。本研究ではZスタックとタイムラプスモードの組み合わせを使用して、迅速に撮影を完了</li><li>蛍光色素を変更し、切り替えます。代替的に、互いに蛍光および光コントラスト画像を重ねる。左下地図画面上で選択したポイントを使用したライブ画像を観察する。 </li><li>フレーミングを使用し、機能をズームにより撮影領域を決定します。必要に応じて、蛍光色素の種類ごとに表示の切り替え。 注：このプロトコルで使用される顕微鏡は、コンパクトな設計で高い従来の共焦点と同じ機能を持っています。顕微鏡は簡略化され、組み込みのインキュベーターとの生細胞の安定したタイムラプスイメージングのために最適に適して倒立水浸対物レンズが装備されています。 </lI&gt; </ol></li><li>信号解析および定量<ol><li>蛍光シグナルを定量化するイメージングソフトウェアを使用してください。試験される試料および細胞制御の両方のための10倍の対物レンズで5地図画像を取得します。 </li><li> 0.231ミクロン×0.231μmのピクセルサイズで、1024×1024画素の定期的な画像を得た。信号解析のためのオリンパスの画像フォーマットなどの画像（OIF）を保管してください。この形式は、さまざまなパラメータ設定や画像を一緒に保存することができます。別の解析ツール（強度プロファイルの測定二つ使用するチャネル間の強度比）を使用する。 </li><li> 12ビット/ピクセルのTIFFファイルとして最大の投影画像を保存する。 </li><li> Rコマンダーソフトウェアを使用して統計分析をリフォーム。反復試験で一元配置分散分析（ANOVA）を使用して差異を分析する。報告書は、（±SD）として平均値、標準偏差およびp &lt;0.05で統計的有意性をもたらす。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

生体適合性材料の挙動は、医学的使用の前に評価されるべき最も前提条件パラメータです。国際規格は、ISO 7405 34医療機器のISO 10993 33、具体的には歯科材料をカバーしています。周囲の細胞への毒性作用の欠如は、このような材料の生体適合性評価において重要な規範です。 37 -細胞毒性試験は、歯科材料の生体適合性35の評価においてそのような重要性を持っている理由です。 ISO試験方法は、代謝活性または膜の完全性に基づくこ​​とができるが示唆された。選択されたエンドポイントは、時間と評価アッセイのコストを最小限にするために、試験物質によって誘発される副作用をランク付けするための特定の条件に従うべきである。調査（3D共焦点タイムラプスイメージング）の現在の方法は、ベース膜の完全性である。このエンドポイントを経由して細胞毒性の評価は、細胞の貴重なマーカーであると思われるbiocompa試験した材料とのtibility、それはISOがエンドポイントを承認したこともある。in vitro試験は、材料サンプルは、特定の細胞型にどのように影響するかを決定するために設計されています。比色MTTアッセイは、もともとインビトロでの細胞毒性及び細胞増殖を測定するための有用な方法としてモスマン（1983）により記載されている。 MTT試験は、ミトコンドリア活性を決定し、アクティブ細胞によるホルマザン結晶へのテトラゾリウム塩の変換に基づいている。これは生存率率38によって変換することができます。グプタと共同研究者は、MTT試験は、コンポジットレジンの細胞毒性を測定するために最も広く用いられている方法であることを報告した。コハク酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼ反応はまた、同じ目的39のために使用されている。 MTTアッセイは、各測定時点で細胞を死滅させる必要がありので、運命の細胞を追跡することができない。より密接に現在の研究では染色された細胞の挙動をモニターするために、ジ生細胞の矩形観察は、短いプロトコル染色、自動画像分析、蛍光シグナルの定量化と組み合わせタイムラプスCLSM画像のおかげで行った。 歯科用複合材料は、口腔組織、特に歯肉および歯髄細胞に密着。 41 -線維芽細胞はこれらの修復複合材料40から放出されたコンポーネントのターゲットになります。さらに、いくつかの研究は、不死化細胞及び初代細胞は、生体材料と接触して異なる細胞応答を有し得ることを報告している。初代細胞は、生体材料42の効果を評価することがより適切であることが見出された。これは、現在の研究で試験歯科用コンポジットの細胞毒性評価のための細胞モデルとして初代ヒト歯肉線維芽細胞の使用を説明しています。 44 -歯科用複合材料から放出される物質の毒性の可能性は、広く43を検討されている。 tで評価するために彼は、2つの接触モデル細胞が実行することができ、材料の潜在的な細胞毒性。間接接触システムにおいて、標的細胞は、生物学的媒体からの溶出液と接触している間の直接接触モデル系で材料を直接標的細胞に配置される。臨床応用ではと修復処置のために、歯科用複合材料は、歯肉組織と間接的に接触するように配置されている。このため、現在の実験プロトコルは、（試験した複合抽出物の存在下で細胞）ヒト歯肉線維芽細胞との間接接触システムに焦点を当てた。以前ダールと共同研究者によって報告されるように、細胞毒性応答はに対する活性に基づいて、&lt;（90％）、（30％、中程度（30-60％）、わずかに（60から90パーセント）または非細胞毒性）&gt;重度としてランク付けしたコントロール45について得られた値。したがって、このランキングに、得られた結果（ 表1）に照らしに従って、複合ELS超低収縮verはとしてランク付けすることができyはわずかに細胞毒性および全時間経過期間中、対照細胞と同等の挙動を示した。正確に同じ調査方法を使用して、この研究の結果は、最近公表された研究のものと比較してもよい。 ELS余分な低収縮複合材料は、直接修復11で同じ臨床応用のために使用される2つの以前に試験複合材料と比較して、優れた生体適合性を実証した。さらなる研究は、より一層完全な比較を確立するために必要である。 特定のエンドポイント評価のために承認するどの細胞毒性アッセイを決定するとき、それは利点と各アッセイの限界を理解することが重要です。共焦点イメージングの主な目的は、細胞や臓器の3-D構造を達成することである。技術は、試料の表面だけでなく、その表面下だけでなく明らかにすることができる。本明細書中に記載されるプロトコルは、センシとして3D CLSMタイムラプス共焦点イメージングの使用を強調歯科用コンポジットのin vitro生体適合性の挙動を評価するための電性法。しかし、この研究で遭遇制限を回避するために、防振ワークステーションは、より安定し、より長いタイムラプスイメージングを可能にするために使用することができる。卓上には、ラボでの振動が生じる可能性があること有害な影響から使用される共焦点システムを隔離することができます。また、口腔内で使用される材料は、理想的には歯肉組織に対して無害でなければならず、全身毒性を引き起こす可能性がない物質を含まないべきである。使用した方法と現在の研究から得られた結果に応じて、それは、試験した複合（ELS超低収縮）は、本実験条件において、細胞傷害性ではないと結論付けることができる。 CLSM法は敏感に生存細胞の初期速度を与えることができるように、他の可能性は、複数のエンドポイントを評価するために予見することができる。特に、最近報告されているように、複合モノマーはthrの細胞に影響を与えることウワーッ活性酸素種（ROS）46〜48、さらに調査があればシグナル伝達ネットワーク細胞毒性およびROS産生との間の相関を評価するために必要とされる。そしてタイムラプスCLSMイメージングを用いて細胞毒性率（ライブ/デッド染色） -将来のプロトコルは、同時にROS産生（染色H 2 O 2および/ ​​またはO 2）を評価するように設計することができる。

生体適合性を定義するISO勧告に引用主基準の一つは、細胞への物質の毒性が存在しないことである。樹脂ベースの歯科用複合材料は、時間にわたって1-4による部分的な重合および/ ​​またはそれにより分解プロセスに最初にすることができた、樹脂状マトリックスから成分を放出することができる。これらのリリースのコンポーネントは、マイトジェンに対する免疫抑制または免疫刺激、I型コラーゲンタンパク質7上の歯肉線維芽細胞の形態及び削減の修正、口腔組織と接触し、蕁麻疹および粘膜の反応5のような種々の欠点を有していてもよく、患者6のアレルギーや過敏反応の開発9彼らの遺伝毒性の可能性を強調して駆動型精製Tリンパ球および脾臓細胞の増殖8および初代ヒト歯肉線維芽細胞におけるDNA損傷。多くのパラメータは、cがシェードとして歯科用複合毒性に影響を与えることができるomposite、光硬化性樹脂モノマーの化学組成、充填剤、変換10〜13度。 インビトロ以来の物質の毒性は、in vivoの状況で予測してもよいし、いくつかの関連するエンドポイントの研究によって臨床状況と比較することができた。歯科用複合材料およびそれらの成分の細胞毒性は、広く細胞培養系14〜16を使用して評価されてきた。 これらのin vitro系は、期間内の歯科用複合材料の生体適合性を評価するために開発されている：セル17、ヒト歯肉線維芽細胞における細胞毒性の18のようなTHP-1monocytesを使用して、細胞増殖、および細胞アポトーシス、HaCaT細胞における炎症電位がセル2、セルの機能のようなケラチノサイトodontoblast- MDPC-23細胞は19のように、ヒト歯肉上の総RNAレベルの減少、およびアポトーシスの誘導の有意な増加が20ケラチノサイトおよび歯肉と歯髄線維芽細胞21上のDNA損傷。 異なる方法論は、歯科用複合材料の生体適合性を調査するために提案されている。特定の着色剤及び光吸収測定を含む比色アッセイは、それらの相対的な単純性と低コスト22- 26に、最も一般的に使用されるままである。光のコントラストによる顕微鏡分析は、頻繁に多くの時間を消費し、コスト高を招く。しかし、これらの顕微鏡技術は、いくつかの重要な利点を有する。セル構造の観察は、より関連性の高い機密性の高いデータを提供し、経験豊富な毒性影響についての拡張情報を提供します。具体的には、共焦点顕微鏡27の導入は、従来の広視野イメージング蛍光顕微鏡に比べて軸方向の解像度を向上させるとの生物学的構造の観察を可能にした。したがって、共焦点イメージングは​​、異なる分野の強力な調査ツールとなっている医学と科学研究。電子顕微鏡技術とは対照的に、走査型共焦点顕微鏡は、特定の蛍光マーカーの取り込みにより、細胞の別個の構成要素を視覚化する能力を提供する。これらの特定のトレーサーの大半は、臨床での使用だけでなく、実験室での調査研究を可能にする、28、水性環境中で安定で賢明に測定可能な、安価で非毒性である。また、従来の電子顕微鏡分析に必要な試料の乾燥および固定がタイムラプス共焦点イメージングのための必要がなく、したがって、時間依存性の獲得は、サンプルにも可能である。二次元イメージングと比較して、共焦点画像化の原理は、試料表面下の視覚化と異なるられた奥行き画像から三次元構造の再構築を可能にする。三次元タイムラプスCの使用の例は30、より正確でより詳細な構造29をもたらす。現在の映像研究である革新的な方法としてライブ/デッド蛍光標識や信号の定量化と組み合わせたレーザー走査顕微鏡（3D-CLSM）onfocal。この論文で提示された技術が評価されたセル構造を変えずに、生細胞の感受性の評価とタイムラプスイメージングを可能にするという利点を有する。いいえ準備手順は、共焦点解析の前に必要とされない。以前に、同一の染色は、培養海綿骨のコア31の生存率を評価するためではなく、以下の共焦点タイムラプスすることなく使用した。同様に、同じタイムラプス共焦点手順は/特定の細菌が生きデッド染色を使用して、グラム型32に応じて活性汚泥の細菌にエリスロマイシン時間殺傷活性を評価するために使用された。これらの方法は、最近適合さメタクリレートモノマー11に基づく歯科用複合材料の毒性を比較するために使用されてきた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

一般的には、 インビトロでの細胞物質との相互作用に歯科材料の生体適合性を評価するのに有用な基準であることが認められている。本研究の目的は、歯科用複合材料のin vitro生体適合性を評価するために、3D CLSMタイムラプス共焦点イメージングを使用することであった。この方法は、歯科用複合抽出物と接触している生細胞率の正確かつ敏感な指標を提供する。 ELS余分な低収縮、直接修復に使用される歯科用複合材料は、例としてとられている。 インビトロ評価を、生/死染色を使用して培養された初代ヒト歯肉線維芽細胞上で行った。画像は、共焦点FV10i生物学的に反転システムで得られたとFV10-ASW 3.1ソフトウェアを用いて分析した。画像解析は、時間経過の5時間後に試験した複合体の存在下で非常にわずかな細胞毒性を示した。細胞生存率のわずかな減少がcomparはテスト複合抽出物と接触して示された細胞を制御するために編所見は、定性的および定量的に歯科用複合材料の生体適合性の挙動を評価するための感度の高い方法として、3D CLSMタイムラプスイメージングを使用することを強調した。

図1は、制御して試験複合エキス（ELS余分な低収縮）に曝露された細胞の両方について得られたマッピング像（10×対物レンズ）で生/死染色された細胞の概要を示した。細胞の3次元構造は、倍率600Xで可視化することができた。制御室では、試験した複合抽出物の存在下でチャンバー内に収集された細胞から回収した細胞の可視化は、図2に示されている。最大突出部（対物レンズ60X）は、時間経過の開始時に選択された細胞集団の運命を示す（15分）を行い、時間の経過期間の終わり（5時間で）。画像の五十7スタック（xyzt MODスキャン、スタックあたり39画像、ボクセル深さ1.00μm）をこの期間中に得られた。赤色蛍光の緑色の蛍光シグナルのわずかな減少と非常にわずかな変化が暴露された細胞で得られた。有意な変動は制御のために認められなかった細胞。複合抽出物を曝露された細胞は、対照細胞と同様、スピンドル形態を想定。形態は（緑のシグナルが減少し、試験し、複合体の存在下で赤信号増加にもかかわらず）は、これらの実験条件では変化しなかった。画像解析は、緑と赤の両方の信号のための陰性対照細胞と比較して試験した合成のための得られた画像から、異なる細胞集団に対応する5つの選択された異なる画像スタックで行った。染色された細胞の強度プロファイルは、 図3に示されている。試験された複合材料と接触している細胞の緑と赤のシグナルの発生は、対照細胞のものと同等であった。カルセインとのEthD-1蛍光発光強度は、対照細胞に複合曝露した細胞で測定した。測定は、最大5時間、一時間間隔で行った。緑の495から515ナノメートルの積分強度と赤の620から650 nmの信号に基づいて、緑/赤蛍光比（）タイムラプス期間中に計算された。 ELS超低収縮エキスに生存能力制御のための比と曝露された細胞を、1できTに示した。試験された複合体の存在下では、生細胞の割合は、1時間後に93.9％、100％からわずかに減少させることが見出された接触。有意差が示されたタイムラプス周期の5時間後に試験したコンポジットおよび陰性対照（任意複合抽出物なしの細胞）の間で観察された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> 図1マッピング画像の概要の時間経過期間（時刻t = 15分）の初めに複合抽出物（ELS超低収縮）の存在下で目的10X、（A）対照細胞および（B）細胞の細胞染色を示した 。緑の領域は、生きた細胞であり、赤のエリアは、損傷した細胞である。この中で実験条件は、（両方の緑と赤の蛍光のための）変化がない陰性対照細胞と比較して複合暴露した細胞につき観察された。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> 図2：それぞれ5時間、15分およびII：（A）制御室からの細胞集団および開始と露光時間の経過期間（Iの最後に（B）複合抽出チャンバーの目的60XでのCLSM画像）。緑の領域は、生きた細胞であり、赤のエリアは、損傷した細胞である。画像のパネルは、輝度信号（緑色信号のわずかな減少と赤のいずれかの非常にわずかな増加）のわずかな変化を示した。無細胞形態の変化は、複合抽出物の存在下では観察されなかった。露光する細胞は、対照細胞としての紡錘状線維芽細胞と形態を維持した。 図3：タイムラプス顕微鏡で観察する細胞のラインプロファイル 、15分および（II）において、（A）コントロール細胞（B）複合曝露した細胞抽出物、（I）の5時間で。。テストされ、複合体の存在下で緑の信号進化における目に見える変化しない時間に関係なく接触。しかし、赤色信号のわずかな増加は、接触の5時間後に、複合体の存在下で観察された。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 接触時間（時） </td><td colspan="5"> 細胞生存率（％） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 対照細胞 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ TD&gt; <td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS余分な低収縮® </td><td> 93.9±7 </td><td> 91.3±5 * </td><td> 89.5±3 * </td><td> 87.6±2 * </td><td> 87.7±3 * </td></tr></tbody></table> 表1：複合抽出物による細胞生存率の接触1,2,3,4および5時間後の生HGF細胞の進化の速度は、生/死細胞毒性キットを用いて染色することにより分析した。データは、5枚の画像スタック解析の平均±SD値を示している。値は、p &lt;0.05で対照細胞とは有意に異なっている。

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

歯科用複合材料の生体適合性の最も研究された側面は、蛍光シグナルの定量化と組み合わせたそれらの細胞毒性3D CLSMタイムラプスイメージングは​​、時間をかけて細胞の運命の敏感な評価を可能にする。この方法を利用することは歯科用複合材料の細胞適合性を評価するための効率的なツールである可能性があります。

歯科用複合材料の細胞適合性評価のための効率的な方法として、共焦点タイムラプスイメージング

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K ビュー.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1. 歯科用複合材料の生体適合性の最も研究された側面は、蛍光シグナルの定量化と組み合わせたそれらの細胞毒性3D CLSMタイムラプスイメージングは​​、時間をかけて細胞の運命の敏感な評価を可能にする。この方法を利用することは歯科用複合材料の細胞適合性を評価するための効率的なツールである可能性があります。 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

麻酔、手術および収縮法を用いた経肛門用ねじの評価<em&gt;インビボ</em&gt;豚の腰椎モデル

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

ラットの血液サンプル コレクションの代替方法として鎖骨下静脈穿刺

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

ガイド付き歯内療法:歯内アクセス虫歯の3次元計画とテンプレート支援準備

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...