This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

注：このプロトコルのすべての手順は、動物の倫理的な治療とケア研究所健康のガイドラインに従って行われ、承認されたIACUC動物使用プロトコルに従って行った。 1.細胞株メンテナンス<ol><li> RPMI-1640培地中で培養BAF3細胞を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン（100単位/ mlおよび100μg/ ml）およびWEHI細胞の使用済み培養培地を補充した。 10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中でHEK293T細胞を増殖させる（100単位/ mlおよび100μg/ ml）。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を維持する。 </li></ol> 2.プラスミドの構築<ol><li>マウスJAK2およびLRによるのpMSCV-puroを-GWにおけるその発癌アイソフォームJAK2-V617F標準の組換えクローニング手順を使用してクロナーゼのクローンを作成。 </li><li>ルシフェラーゼ発現ベクター（のpMSCV-リュック·チェリー-GW）の構築のために-VIで使用VOイメージング、プライマーを用いてPCRによりpLVX-はTet-ONベクターからのルシフェラーゼを増幅（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCGとLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）が使用されているのpENTR-リュックを、生成するためのpENTR-SD-TOPO中にクローニングし、その後LRクロナーゼを使用して再結合を介したクローニングにより、レトロウイルスベクター、のpMSCV-チェリー-GW中のルシフェラーゼ遺伝子を転送する。 </li></ol>ランダム変異ライブラリの調製、突然変異をスクリーニングし、識別 3.1）ランダム突然変異誘発<ol><li> JAK2野生型および商業組換えクローニング技術を使用してのpMSCV-puroを-GWレトロウイルスベクターにV617F変異のクローンの全長。 </li><li>変換するためにJAK2-V617FプラスミドDNAの1μgのを使用し、XL-1レッド、E.従って、それらは、複製中にランダム突然変異を導入する可能DNA修復機構における欠陥がある大腸菌細胞 、。より具体的には、50ミックス - 100ngのDNAを10（DNA 100 ng以上の形質転換効率を低下させる）0あらかじめ冷却ポリプロピレンチューブ中のコンピテントセルのμL、静かに5分毎に渦巻く、30分間氷上でインキュベートした。良いライブラリカバレッジの場合は、コンピテントセルの四から六の管を使用しています。 注：DNAの100以上のngは、変換効率が低下する</li><li> 45秒間のヒートショックを42℃の水浴中でチューブを浸漬し、2分間氷上でインキュベートする。次いで、SOC培地1ml（2.0％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.05％のNaCl、10mMのMgCl 2を、10mMの硫酸マグネシウム、および0.4％D-グルコース）を追加。 90分間の225から250 rpmで振とうしながら、37℃でチューブをインキュベートします。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを含む4 10センチメートルLB寒天プレート上に各チューブからプレートの細胞。 37℃で24時間 - 16プレートをインキュベートします。 </li><li>目に見えるコロニーに続いて、無菌のプレートスクレーパーでプレートをこすることによってそれらを収集。各プレートからのプール細胞および市販のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドDNAを単離する。 注：通常のコロニーが小さく、なるように18〜24時間を取る目に見えるこれらは成長の遅い細菌の菌株であるため。この段階では、そのようなSau3A1またはTaq1または配列決定などの頻繁なカッターで制限消化によりライブラリ内の変異の不均一性を評価する。 </li></ol>レトロウイルス上清および形質導入の3.2）生産<ol><li>トランスフェクションの1日、プレートを10％FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM 100 10cm皿上に4×10 6個のHEK 293T細胞の前。 </li><li>次の日、培地を交換し、変異誘発のpMSCV-JAK2-V617Fライブラリで細胞をトランスフェクト。各10cmプレートの場合は、無血清DMEM培地を用いて、400μlの総体積にトランスフェ40μlのDNAを10μg（プラスミドライブラリー5μgのレトロウイルスパッケージングプラスミド5μgの、pCLEco）を混ぜる。室温で20分間、DNAおよび脂質ミックスをインキュベートする。 20分後HEK293T細胞の上に賢明なDNA-脂質複雑なドロップを追加します。 </li><li> 6時間後、トランスフェクション培地ワットを変更するi番目の新鮮な培地には、ウイルス産生のために、37℃で48時間プレートをインキュベートし。インキュベーションの48時間後に、0.45μmのアクロディスクフィルターを通して濾過し、ウイルス上清を集め。 </li></ol> インビトロでの耐性クローンの3.3）の選択<ol><li>薬剤耐性JAK2-V617F変異体の場合は、0.5〜1×10 6のウイルス力価を持つウイルス上清100mlで億BaF3細胞に形質導入する。より具体的には、10％血清を含むRPMI培地を用いて300ミリリットルの全体積のウイルス上清を100ml、及びpolybereneの24μg/ mlの（ploybereneの最終濃度を8μg/ mlである）と10 8細胞を混合する。複数で6ウェルプレート（4-5 1mlあたりをよく）これらのセルミキサを配布します。 </li><li> 25℃で90分間1250×gでプレートを遠心。遠心分離後、24時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>次の日、一緒に細胞をプールし、Ruxolitinibと媒体が柔らかい寒天を含むと混合し、Si中のメッキxのウェルプレート。各薬物濃度について、50mlチューブ中Ruxolitinib適当量の形質導入されたBAF3細胞（10〜20万個の細胞）を10mlを混合する。 20％血清を含むRPMIを用いて40mlまでボリュームを構成する。 mixcarefullyとプレート6ウェルプレートで、細胞に1.2％寒天の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 2週間、37℃でプレートをインキュベートする。 3-4日ごとに個別に24ウェルプレートで0.2ミリリットルのピペットチップを使用して、耐性コロニーとサブカルチャー、それらを選択します。 </li><li>室温で5分間、450×gで遠心分離することによって耐性BAF3細胞を採取する。商業ゲノムDNA単離キットを用いてゲノムDNAを単離する。 PCRはプライマー（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAGとmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）を使用して、100ngのゲノムDNAから完全長JAK2 cDNAを増幅し、長期テンプレートは、高忠実度PCRシステムを展開します。 </li><li>アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離する。 JAK2コーディングフレームを表すDNAバンドの3.4キロバイトを切除し、DNAを単離商業ゲル抽出キットを用いて。シーケンス8内部プライマー（P1 - P8）を使用して、cDNAの全長市販のソフトウェアを使用して、コード配列にまたがる、分析シーケンスを。 </li></ol>耐性変異のインビトロ検証4. 多くの細胞クローンは、耐性表現型の各突然変異の寄与を試験するテンプレートとしてのpMSCV-JAK2V-617Fのプラスミドを用いて部位特異的突然変異誘発によって選択された変異体を作製するために、二つ以上の突然変異を有する。 <ol><li>商業誘発キットおよび点突然変異を作成するために設計されたオリゴヌクレオチドを​​使用してのpMSCV-JAK2-V617Fプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行います。配列決定によって変異体クローンのアイデンティティを確認してください。 </li><li>レトロウイルスBAF3細胞を形質導入する変異体プラスミドを用いて作らを1μg/ mlのピ​​ューロマイシンを用いた選択を行った。 </li><li>プレート10 4 BAF3-JAK2-V617F細胞（10％FCSを含むRPMIの50μl）を96ウェルプレートの各ウェルに。独立した37℃で60時間プレートを（0、1、3、5、10、及び20μMの最終濃度）とインキュベートlyがプレート全体でウェルにruxolitinib含有培地50μlを添加する。 </li><li>よく2-4時間、37℃でのインキュベーションに続いてそれぞれにWST-1試薬を10μl添加することにより、細胞の生存率を評価する。プレートリーダーを用いてA450でのレコード吸光度。三連とプロット内のすべてのアッセイを行うINCB018424濃度に対して吸光度を平均した。非線形カーブフィッティングアルゴリズムを使用して、最高のフィットS字曲線を実行します。携帯IC50として50％の細胞生存率の結果として薬物濃度をスコア。 </li><li>次に、ruxolitinibの濃度を増加させ、37℃で4-6時間インキュベートし、10％血清を含むRPMI培地中で6ウェルプレート中のJAK2変異体を発現するプレート600万BAF3細胞。 </li><li> 4℃で5分間450×gでの遠心分離によって細胞を収集します。 PBSで細胞を一度洗浄し、そして20mMのトリス-Cl（pH7.5）中で溶解、50のNaCl、1％NP-40、0.1％SDS、5mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのフッ化ナトリウム、2mMのナトリウムバナジウム、および5％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤を補充した。 5×ゲルローディング緩衝液（350mMのトリス-HCl [pH6.8の]、続いて1分間の細胞懸濁液を超音波処理し、500mMのDTT、15％SDS、10mMのベンザミジン、5mMのEDTA、5mMのEGTA、5mMのナトリウムバナジン、5〜10分間70℃でプロテアーゼカクテル、50％グリセロール、および0.001％ブロモフェノールブルー）および変性。 </li><li>変性条件下で、8％SDSポリアクリルアミドゲル上のタンパク質を解決する。マウスモノクローナル抗phopsho STAT5を用いたイムノ実行します。ブロットをストリップし、ウサギポリクローナル抗SATA5抗体で再プローブした。供給業者の推奨に従って、ECL試薬を用いてバンドを可視化。 </li></ol> 生体内の検証5. <ol><li>のpMSCVリュック·シェールから作られたレトロウイルスで形質導入（ルシフェラーゼと桜を表現するBaF3細胞を形質導入JAK2-V617Fと耐性変異体を発現するウイルスとRY GW）。 JAK2とその抵抗変異体の発現のためのピューロマイシン選択後に生存している細胞を選択します。 </li><li>尾静脈注射により 6 Balb / CマウスにPBSを200μlのJAK2-V617Fとその耐性変異を運ぶ200万活発に成長BAF3リュック/桜の細胞を注入する。 </li><li>細胞移植の3日後、二週間1日2回Ruxolitinibた（100mg / kg）をマウスに注射する。 </li><li>イメージング·システムとルシフェラーゼベースの生物発光イメージングを行います。 。 <ol><li>簡潔には、滅菌脱イオン水25ml、小さな体積およびストア内のアリコートには300mgを溶解することによりルシフェリン溶液を調製。 注：-80℃で保存ルシフェリンと使用まで光から保護する。 </li><li>各マウスで125 mg / kgをを達成するためにIPによって各マウスに250μlのを注入。一緒に密封されたボックス内の吸入イソフルラン（1.5％-2.0％）を使用して、同じ群のマウスを麻酔。目の上の獣医軟膏を適用します乾燥を防ぐために、電子の目。 注：スリープ状態にしたマウスにかかる時間（10〜15分）ルシフェリン活動がピークに達することができました。変動を避けるために、グループ間の一貫性のある時間をおいてください。 </li></ol></li><li>イメージング室ステージにすぐにマウスを移し、イメージング手順の間1.5から2パーセントのイソフルランで麻酔を維持。シーケンシャル0.1、0.5、1、5、30、60、300秒の露光で画像マウス。画像を撮影し、画像取得及び分析ソフトウェアを用いて生物発光強度を定量する。イメージングは​​、そのケージに戻ってマウスを返すの後。 </li><li> 、in vivoでのキメラ現象の収穫総bonemarrow細胞について。頸椎脱臼で追跡5分間CO 2でマウスを安楽死させる。骨髄を収集するために4ミリリットルの冷PBSで骨やクラッシュを収穫する。蛍光顕微鏡下でのパーセント桜陽性細胞を分析し、FACSを用いて定量化する。各サンプルから2万イベントを収集。 </li></ol>

<ol>
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No conflicts of interest declared.

臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この?...

プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 ​​持した。 慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでな​​く、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承​​認された。癌における小分子阻害剤による発癌性キナーゼの特異的ターゲティングは有望な結果をもたらすが、それはまた、治療に対する耐性を発現苦しむ。実際には、これまでのところ、そのようなイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびダサチニブのようなキナーゼ阻害剤で治療した患者は、大部分の薬物は、8-10をターゲットとするために、キナーゼドメインにおける変異を取得することにより、耐性変異を開発した。遺伝子突然変異の結果として抵抗がo制限を強調fは発癌性キナーゼに対する単剤療法を目標とし、これまで以上に成功した癌化学療法の開発の次の挑戦を表します。薬剤耐性の機構および機能的結果を選択し、薬剤開発のための無料の化合物の設計のための根拠を提供するべきである。 in vitroでの画面を使用して同定された変異は、患者に見られるものとの高度の相関を示している。したがって、臨床的再発を引き起こす可能性がある耐性パターンを識別するのに臨床的または前臨床開発を支援における所与の薬物標的のペアのための薬剤耐性を付与する変異をin vitroスクリーニング。これらの変異型を同定するだけでなく、薬物反応および再発について患者をモニタリングするのに役立つだけでなく、より強固な次世代阻害剤の設計のために必須である。たとえば、次の世代BCR / ABL阻害剤、ニロチニブとPonatinibの開発は、理由も大きいメックに可能作られたhanistic理解は、突然変異誘発、構造的、および機能的研究から得られた。 以前、我々はそのようなイマチニブ11,12、PD166326 12、及びAP24163 13と阻害剤に対する耐性を付与する変異のスペクトルを明らかにするために、BCR / ABLのランダム突然変異誘発を用いて私たちのスクリーニングの結果を報告している。結果は、臨床的な抵抗および疾患再発を付与する変異を同定し、だけでなく、薬剤耐性及びキナーゼ機能11,14を支配する原則のメカニズムの理解を提供するだけでなく。ここでは、このスクリーニング戦略のより広範な適用を可能にするために、薬物標的対としてRuxolitinibおよびJAK2を使用して、追加の方法論の詳細を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点​​は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。

遺伝子変異の出現は、目標と抗キナーゼ療法のための大きな課題を提起する。突然変異研究は、選択次世代薬物開発の設計に尽力している機構的及び機能的洞察を提供することに加えて、より良い臨床管理を可能にし、将来的にパーソナライズされた治療のために、より有用であろう。この実験では、JAK2-V617Fキナーゼでruxolitinib耐性変異（ 図1）のスクリーニングを示した。私た...

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A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。 

ビデオ: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

生物学

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

結核および多剤耐性結核の診断のためのMODSの方法

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

トリパノソーマにおけるRNA編集に対する薬剤をスクリーニングするためのレポーターとして、RNA触媒

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...