Name: a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
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This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 동물의 윤리적 인 치료 및 관리를위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 수행하고, 승인 된 IACUC 동물 사용 프로토콜에 따라되었다. 1. 세포주 유지 보수 <ol><li> RPMI-1640 배지에서 배양 BAF3 세포는 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ml) 및 WEHI 세포의 소비 배지를 보충. 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 성장 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ㎖). 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 세포를 유지한다. </li></ol> 2. 플라스미드 건설 <ol><li> 마우스 JAK2과 LR에 의해 pMSCV - 퓨로-GW에서의 발암 성 이성체 JAK2-V617F 표준 재조합 복제 절차를 사용하여 clonase을 복제. </li><li> 루시 페라 제 발현 벡터 (pMSCV 뤽 - 체리-GW)의 건설에-VI를에 사용VO 이미징, 사용 pENTR 뤽를 생성 pENTR-SD-TOPO의 복제와 다음 프라이머 (FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC가 LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG 및 LUC-SD를 /)를 사용하여 PCR에 의해 pLVX - 구정-ON 벡터에서 루시 페라 제를 증폭 LR의 clonase를 사용하여 재조합 매개 복제에 의해 레트로 바이러스 벡터, pMSCV - 체리-GW에서 루시 페라 제 유전자를 전송합니다. </li></ol> 무작위 돌연변이 라이브러리 3. 준비, 돌연변이를 검사 및 확인 3.1) 무작위 돌연변이 유발 <ol><li> JAK2 야생형 및 상업 재조합 복제 기술을 사용하여 pMSCV - 퓨로-GW의 레트로 바이러스 벡터에 V617F 돌연변이의 클론 전체 길이. </li><li> , 변형 JAK2-V617F 플라스미드 DNA 1 μg의 사용 XL-1 레드, E. 따라서이를 복제 중에 랜덤 돌연변이를 도입 할 수 있도록 DNA 복구 메카니즘에서의 결함이 콜라이 세포. 보다 구체적으로는, 50 혼합 - DNA 100 NG를 10 (DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소)0 사전 냉장 폴리 프로필렌 튜브에서 적격 세포의 μL 부드럽게 매 5 분 소용돌이, 30 분 동안 얼음 위에서 배양 하였다. 좋은 라이브러리 커버리지를 들어, 유능한 세포의 4-6 튜브를 사용합니다. 참고 : DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소 </li><li> 45 초의 열 쇼크를 위해 42 ℃에서 수조에 담금 튜브를 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 이어서, SOC 배지 1 ㎖ (2.0 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 %의 NaCl, 10 mM의 MgCl2를, 10 mM의 황산, 0.4 % D- 글루코스)를 추가한다. 90 분 동안 225-250 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린을 포함하는 4 개의 10cm LB 한천 플레이트에 각 튜브에서 플레이트 세포. 37 ° C에서 24 시간 - 16 접시를 품어. </li><li> 눈에 보이는 식민지 다음, 멸균 판 스크레이퍼로 판을 긁어를 수집합니다. 상업용 플라스미드 추출 키트를 이용하여 각 플레이트로부터 분리 된 플라스미드 DNA 풀 셀. 일반적으로 식민지가 작고로 18 ~ 24 시간이 걸릴 : 주볼이 느린 성장 균주이기 때문이다. 이 단계에서, 예를 Sau 3A1 또는 Taq1 또는 순서로 자주 커터 제한 효소에 의해 라이브러리의 돌연변이의 이질성을 평가. </li></ol> 레트로 바이러스 상층 액과 형질 3.2) 생산 <ol><li> 하루 트랜 플레이트 10 % FCS, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민을 함유하는 DMEM에서 100cm 접시 상 4 × 106 HEK 293T 세포의 전. </li><li> 다음 날, 매체를 교체하고 돌연변이 pMSCV-JAK2-V617F 라이브러리와 세포를 형질. 각 10cm 접시를 들어, 무 혈청 DMEM 미디어를 사용하여 400 μL의 총 부피에 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene의 40 μL와 DNA의 10 μg의 (플라스미드 라이브러리의 5 μg의 및 레트로 바이러스 포장 플라스미드의 5 μg의, pCLEco)를 섞는다. 실온에서 20 분 동안 혼합 지질과 DNA를 부화. 20 분 후 HEK293T 세포의 상단에 현명한 DNA 지질 복잡한 드롭을 추가합니다. </li><li> 여섯 시간 후, 형질 감염 매체 w 변경i 번째 신선한 미디어는 바이러스 생산을 위해 37 ° C에서 48 시간 동안 접시를 품어. 배양 48 시간 후, 0.45 μm의 acrodisc 필터로 여과 바이러스 상층 액을 모은다. </li></ol> 체외에서 저항하는 클론의 3.3) 선택 <ol><li> 약제 내성 JAK2-V617F 돌연변이를 들어, 0.5-1 X10 (6)의 바이러스 역가를 갖는 바이러스 상층 액을 100㎖로 100,000,000 BAF3 세포를 형질 도입. 보다 구체적으로, 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 매체를 사용하여 300 ㎖의 전체 부피로 바이러스 상등액 100 ㎖, 및 polyberene에 24 ㎍ / ㎖ (ployberene의 최종 농도가 8 ㎍ / ㎖의 경우)로 108 세포를 혼합한다. 여러 여섯 잘 접시 (4-5 ml의 웰 당)이 셀 믹서를 배포합니다. </li><li> 25 ° C에서 90 분 동안 1,250 XG에서 접시를 원심 분리기. 원심 분리 후, 24 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 다음 날, 함께 세포 수영장과 Ruxolitinib과 매체가 부드러운 한천을 함유하는 혼합시에 도금X 잘 접시. 각각의 약물 농도를 들어, 50 ㎖ 튜브에서 Ruxolitinib 적당량 BAF3 형질 세포 (10-20000000 세포) 10 ㎖를 혼합한다. RPMI 20 % 혈청을 포함하여 40 ml의에 볼륨을 확인합니다. 여섯 잘 접시에 mixcarefully, 셀에 1.2 % 한천의 10 ML을 추가하고 판. </li><li> 2 주 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 0.2 ml의 피펫 팁 및 하위 문화들을 3 ~ 4 일 동안 개별적으로 24 웰 플레이트를 사용하여 저항하는 식민지를 선택합니다. </li><li> 실온에서 450 분 동안 다섯 XG에서 원심 분리하여 세포 내성 BAF3 수확. 상업용 게놈 DNA 분리 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리. PCR은 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG 및 mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG)과 고 충실도 PCR 시스템을 확장 긴 템플릿의 100 NG에서 전체 길이 JAK2의 cDNA를 증폭. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분리. JAK2 부호화 프레임을 나타내는 DNA 밴드의 3.4 kb의 절제 및 DNA를 분리상업용 겔 추출 키트를 사용. 시퀀스 8 내부 프라이머 (P1 - P8)을 사용하여 cDNA를 전 길이 상용 소프트웨어를 사용하여 암호화 서열에 걸친 서열 분석. </li></ol> 내성 돌연변이 4. 체외 검증 많은 세포 클론은, 저항의 각 변이 표현형의 기여를 주형으로 테스트 pMSCV-JAK2V-617F 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이에 의해 선택된 변이체를 생성하기 위해, 하나 이상의 돌연변이를 운반. <ol><li> 상용 돌연변이 유발 키트와 점 돌연변이를 만들 수 있도록 설계 올리고 뉴클레오티드를 사용 pMSCV-JAK2-V617F 플라스미드에 사이트 돌연변이 유발을 수행합니다. 염기 서열 돌연변이 클론의 ID를 확인합니다. </li><li> 레트로 바이러스와 BAF3 세포를 형질 도입은 선택이 1μg / ㎖에서 퓨로 마이신을 사용하여 다음 돌연변이 플라스미드를 사용했다. </li><li> 플레이트 (10) 4-BAF3 JAK2-V617F 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 (10 % FCS와 RPMI 50 μL). 별도37 ° C에서 60 시간 동안 플레이트를 (0, 1, 3, 5, 10 및 20 μM 최종 농도) 및 LY는 부화 플레이트 웰에 걸쳐 ruxolitinib 함유 배지의 50 μL를 추가한다. </li><li> 2-4 시간 동안 37 ℃에서 배양하여 각 웰을 다음에 WST-1 시약 10 μl를 첨가하여 세포 생존율을 평가. 플레이트 판독기를 사용하여 A450 흡광도로 기록. 세중 플롯의 모든 분석을 수행는 INCB018424 농도에 대한 흡광도를 평균. 비선형 커브 피팅 알고리즘을 사용하여 최적의 S 자형 곡선을 수행합니다. 셀룰러 IC50 50 %의 세포 생존율에 얻어진 약물 농도 점수. </li><li> 다음에, ruxolitinib의 농도를 증가시키고, 37 ℃에서 4-6 시간 동안 배양하여 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 여섯 웰 플레이트에서 JAK2 변이체를 발현하는 BAF3 플레이트 육백 만 세포. </li><li> 4 ° C에서 다섯 분 동안 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 20 mM 트리스 - CL의 셀을 한 PBS와 시간,로 용해 워시 (PH 7.5), (50)mM의 염화나트륨, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 5mM의 EDTA, 1mM의 EGTA, 1 mM의 불소화 나트륨, 2 mM의 나트륨 바나 데이트, 5 % 글리세롤 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충. 5X 겔 로딩 완충액 (첨가하여 1 분간 세포 현탁액을 초음파 처리 350 mM의 트리스 -HCl [하여 pH 6.8], 500 mM의 DTT, 15 % SDS, 10 mM의 벤즈 아미 딘, 5 mM의 EDTA 5 mM의 EGTA, 5 mM의 나트륨 바나 데이트 , 단백질 분해 효소 칵테일, 50 % 글리세롤, 5 ~ 10 분 동안 70 ° C에서 0.001 % 브로 모 페놀 블루)과 변성. </li><li> 변성 조건에서 8 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 단백질을 해결합니다. 마우스 단일 클론 항 phopsho의 STAT5와 면역 블 수행합니다. 말을 벗기고 토끼 다 클론 항 SATA5 항체 reprobed. 공급 업체의 권고에 따라 ECL 시약을 사용하여 밴드를 시각화. </li></ol> 생체 검증 5. <ol><li> 루시 페라 제와 체리를 표현 BAF3 세포를 형질 도입 (pMSCV 뤽 - 쉐어 만든 레트로 바이러스 형질 도입JAK2-V617F 및 내성 변종을 표현하는 바이러스와 공예 GW). JAK2와 저항 변이의 발현에 대한 퓨로 마이신 선택 살아남 셀을 선택합니다. </li><li> 꼬리 정맥 주사를 통해 6을 Balb / C 마우스에 PBS 200 μL에 JAK2-V617F 및 내성 변종을 들고 이백만 적극적으로 성장 BAF3 룩 / 체리 세포를 주입한다. </li><li> 세포 이식의 삼일 후, 2 주 동안 하루에 두 번 Ruxolitinib (100 ㎎ / ㎏)와 마우스를 주입. </li><li> 촬상 시스템으로 루시 페라 제의 생물 발광 계 촬상을 수행한다. . <ol><li> 요컨대, 멸균 증류수 300 mg을 25 ㎖, 작은 볼륨 및 저장소 분취 루시페린을 용해시켜 용액을 제조. 참고 : -80 ° C에서 저장 루시페린과 사용할 때까지 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 각 마우스에서 125 ㎎ / ㎏을 달성하기 위해 IP에 의해 각 마우스에 250 μl를 주입한다. 함께 실드 박스에서 흡입 이소 플루 란 (1.5 % -2.0 %)을 사용하여 동일한 그룹에서 쥐를 마취. 일에 수의사 연고를 적용즉 안구 건조를 방지한다. 참고 : 마우스 걸리는 시간은 잠 (10 ~ 15 분) 피크에 루시페린 활동을 허용했다. 변화를 피하기 위해 그룹 간 일관된 시간을 유지합니다. </li></ol></li><li> 영상 실 단계로 즉시 마우스 이동 및 이미징 과정에서 1.5 % 이소 플루오 란에서 마취를 유지합니다. 순차 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, 및 300 초의 노출 이미지 쥐. 이미지를 캡처하고 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 생물 발광 강도를 정량. 이미지가 케이지에 다시 마우스를 반환 다음. </li><li> , 생체 키메라 수확 총 bonemarrow 세포하십시오. 경추 탈구 다음 5 분 동안 CO 2와 쥐를 안락사. 수확 뼈 골수를 수집하는 차가운 PBS 4 mL에 호감. 형광 현미경 하에서 퍼센트 체리 양성 세포를 FACS 분석을 이용하여 정량화. 각 샘플에서 이만 이벤트를 수집합니다. </li></ol>

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임상 적 재발과 표적 유전자의 약제 내성 돌연변이의 출현 : CML 치료에 글리벡의 임상 성공은 작은 분자 억제제에 의해 루즈 키나제를 표적으로의 가능성 만 대상으로 치료도 발견 제한뿐만 아니라 보여 주었다. 저항 돌연변이의 식별 더 나은 임상 관리 및 차세대 억제제의 개발에 도움이됩니다. 이 프로토콜은 표적 유전자에 약제 내성 돌연변이를 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 E. ?...

단백질 키나제 겉보기 모든 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로의 중요한 조절 효소이다. 키나제 매개 신호의 적절한 제어는 대부분 UPS에 의해 인산화 효소, 포스 및 성능 저하의 적절한 규제 (유비퀴틴 프로 테아 좀 시스템)에 의존 항상성 및 개발에 매우​​ 중요하다. 탈 조절 키나아제는 다양한 암의 중심 단계에있는 인간 숙주 질환 (1)의 연루. 인간 게놈은 직접 또는 간접적으로 결합 된 500 개 이상의 단백질 키나제, ~ 400에 인간이 질병을 인코딩한다. 이러한 관찰은 작은 분자 억제제 3-5로 키나아제의 치료 표적에 대한 개념을 지원했다. 만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 이러한 글리벡과 같은 ABL 키나제 억제제의 데모는,이 방법 6,7에 대한 개념의 증거를 제공했다. 이러한 관찰뿐만 아니라 개미 혁명I-키나제 치료하지만 또한 골수 증식 성 신 생물 (MPN)과 진성 적혈구 베라 (PV) 환자에서 JAK2에서 발암 돌연변이의 발견으로 이어질 치료 타겟팅 다른 양성 질환의 유전 적 병변을 확인하기 위해 아이디어를 적용. 이 발견은 작은 분자 키나제 억제제 JAK2을 대상으로 MPNs 치료에 큰 관심을 생성합니다. 이제, JAK2 억제제 십여 임상 시험에 있고 그 중 하나는 골수 섬유증의 치료를 위해 최근에 승인되었다. 암의 작은 분자 억제제에 의한 발암 키나제의 표적화는 유망한 결과를 가지고 있지만, 또한 치료에 대한 내성을 발전에서 겪고있다. 사실, 지금까지, 환자는 대부분 약물 8-10을 대상으로 할 키나제 도메인에 돌연변이를 획득함으로써 이러한 글리벡, 게 피티 니브, 플라세보과 스 프라이 셀과 같은 키나제 억제제와 저항 돌연변이를 개발 한 처리. 유전자 돌연변이의 결과로서 저항 O 제한 강조F는 종양 키나제에 대한 단독 요법을 목표로하고, 더욱 성공적인 암 화학 요법의 개발에 다음 도전을 나타냅니다. 약물 내성의 기계적 및 기능적 결과는 선택과 약물 개발을위한 무료 화합물의 설계를위한 이론적 근거를 제공해야한다. 시험 관내 스크린을 통해 확인 된 돌연변이는 환자에서 발견되는 것들과 높은 상관 관계를 보여 주었다. 따라서, 임상 재발을 일으킬 가능성이 저항 패턴을 식별 전임상 또는 임상 개발 어시스트 주어진 약물 표적 쌍에 대한 약물 내성을 부여 돌연변이 시험 관내 스크리닝. 이러한 돌연변이 형태의 식별뿐만 아니라 약물 반응과 재발하지만보다 강력한 차세대 억제제의 설계를위한 필수적의 환자 모니터링에 도움이됩니다. 예, 다음 세대 BCR / ABL 억제제, 닐 로티 닙과 Ponatinib의 개발을위한 때문에 더 멕의 가능하게되었다hanistic 이해는 돌연변이 유발, 구조 및 기능 연구로부터 얻었다. 앞서 우리는 글리벡 11, 12, PD166326 (12), 및 AP24163 (13) 억제제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 공개 BCR / ABL의 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 우리의 화면의 결과를보고했다. 결과뿐만 저항 및 임상 질환 재발을 부여하는 돌연변이를 식별 할뿐만 아니라 약제 내성 및 키나제 기능을 관장 11,14 원리 기전 이해를 제공 하였다. 여기에서 우리는이 심사 전략의 광범위한 응용 프로그램을 사용하려면, 약물 표적 쌍으로 Ruxolitinib과 JAK2를 사용하여, 추가 방법 론적 세부 사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Cell and Tissue culture&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>A gift from Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock in water</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 micron disc filter</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 micron nylon cell strainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml stock solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood&amp;amp; tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expand long template PCR system</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Sv gel and PCR clean up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield plasmid mini prep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &amp;amp; OmniMAX 2 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;nbsp; LR Clonase Enzyme mix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 and 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automated cell counter</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td></tr></tbody></table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

만성 골수성 백혈병 (CML)의 구동 암에서 BCR / ABL의 발견 사실 효과적으로 CML 환자의 치료에 의해 암에서 키나제를 표적의 가능성을 보여, 글리벡의 개발 결과. 이러한 결과는 EGFR, B-RAF, KIT 및 PDGFRs 같은 다양한 다른 악성 종양에 연루 종양 키나제를 표적으로하는 약물 개발에 혁명을. 그러나, 항 - 키나아제 요법 하나의 주요 단점은 타겟 렌더링 약제 내성 돌연변이의 출현을 감소 또는 약물에 대한 친 화성을 잃어버린 것이다. 차세대 억제제를 개발하는 데 도움이뿐만 아니라 개인화 된 약을 사용 임상 관리에 자극을 제공뿐만 아니라 내성 변종에 의해 사용되는 메커니즘을 이해. 우리는 차세대 BCR / ABL 억제제 개발 도왔다 BCR / ABL에 저항을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 확인하는 레트로 바이러스 벡터 기반 스크리닝 전략을보고했다. Ruxoli 사용약물 표적 쌍으로 tinib과 JAK2, 우리가 JAK2 키나제의 무작위 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마우스 BAF3 세포를 이용하여 체외 검사 방법에 대해 설명합니다.

유전 적 돌연변이의 출현 대상 방지 키나제 치료에 큰 도전을 포즈. 돌연변이 연구는 선택과 차세대 신약 개발의 디자인에서 쓸모있는 기계적인 기능적인 통찰력을 제공하는 외에, 또한 더 나은 임상 관리를 할 수 있으며 미래에 맞춤 치료에 더 도움이 될 수 있습니다. 이 실험에서, 우리는 JAK2-V617F 키나제에 ruxolitinib 저항 돌연변이 (그림 1)에 대한 검사를 표시합니다. 우리는 pMSCV - 체...

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A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K 조회수.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다. 

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

연구

생화학

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

암 연구학

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

의학

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

생물학

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...